Name: simultaneous measurement of superoxide/hydrogen peroxide and nadh production by flavin-containing mitochondrial dehydrogenases
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases at JoVE.com

이 작품은 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 투자 되었다. 동영상 제작 교육 및 학습 (CITL) 뉴펀들랜드 메모리얼 대학에 혁신을 위한 센터와 공동으로 실시 했다.

1. 화학 물질 고 정화 효소
<ol><li>다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H2O2 (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드+, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.</li>
</ol>2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획
<ol><li>96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다. 참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.</li>
	<li>220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다. 참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다.</li>
	<li>효소 활동 분석 실험14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩5.</li>
	<li>표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다. 참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.</li>
</ol>3. 분석 결과 서식 파일 설정
<ol><li>듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.</li>
	<li>"프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.</li>
	<li>25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.</li>
	<li>(그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.</li>
	<li>클릭 "읽기" (그림 1B). 참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.</li>
	<li>"읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.</li>
	<li>"키네틱 끝"을 선택 합니다.</li>
</ol>4. 표준 곡선
<ol><li>시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>
NADH 표준 곡선 (그림 2A)
	<ol>
<li>반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.</li>
		<li>"읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm. 참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AUR 표준 곡선 (그림 2B)
	<ol>
<li>반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.</li>
		<li>각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.</li>
		<li>잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H2O2 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H2O2 의 최종 농도 20-400 nM 이다.</li>
		<li>25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>"읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. O2 ●/H2 O2 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정
<ol><li>다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.</li>
	<li>각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.</li>
	<li>2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.</li>
	<li>KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2). 참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.</li>
	<li>25 ° c.에 1 분 동안 품 어 참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.</li>
	<li>HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.</li>
	<li>코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드+ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.</li>
	<li>보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.</li>
	<li>Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.</li>
	<li>클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.</li>
	<li>상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.</li>
	<li>분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.</li>
	<li>"그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.</li>
	<li>채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species.">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forty+years+of+Mitchell's+proton+circuit:+From+little+grey+books+to+little+grey+cells.">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li><li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling.">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li><li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins.">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li><li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2(.-)/H2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue.">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li><li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress.">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li><li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Progress+in+understanding+the+molecular+oxygen+paradox+-+function+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+cell+signaling.">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity.">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li><li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components.">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase.">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li><li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+superoxide/hydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria.">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li><li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide/hydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex.">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li><li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide/hydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I.">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li><li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase.">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li><li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2(.-)/H2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue.">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li><li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+(E3)+deficiency:+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism.">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li><li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide/hydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria.">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li><li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload.">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li><li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+(complex+I)+from+bovine+heart+mitochondria.">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li><li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart:+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0.">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li><li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase,+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism.">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li></ol>

공개는 아무 상관이 있다.

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H2O2 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접?...

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH2)1을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH2 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O2) 복잡 한 41에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O2 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP2를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님3O2 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O2●- H2O2. O2●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O2●- 및 H2O2의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조6의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H2O2 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작7먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.
선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판3, 의 종류 8 , 9. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산8,10영향 요인. 예를 들어 O2●-/ H2O2 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O2●-/ H2O2 생산12에 대 한 사이트의 E3 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드+ 의 KGDHC12에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O2●-/ H2O2 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O2●-/ H2O2 생산13아날로그와 E2 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O2●-/H2O2 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 2 소 단위14. PDHC 및 KGDHC의 E2 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O2●-/ H2O2 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.
미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O2●-/ H2O2 소스6포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O2●- 및 H2O2의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O2●-/ H2O2 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직3. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O2●-/ H2O2 근육과 간 미토 콘 드리 아13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O2●-/ H2O2 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O2●-/ H2O2 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O2●/H2O2를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O2●/H2O2 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O2●- 및 H2O2 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O2●-/ H2O2 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O2●-/H2O2 사이트를 형성.
여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O2●-/ H2O2 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O2●-/ H2O2 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O2●-/ H2O2 O2●-/H2O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. 2 출시입니다. 마지막으로, O2●/H2O2 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Pyruvate dehydrogenase complex</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>purified flavoenzyme</td></tr><tr><td>alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>purified flavoenzyme</td></tr><tr><td>30% hydrogen peroxide solution</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>reagent, standard curves</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>reagent, activity/ROS release assay</td></tr><tr><td>NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>reagent, standard curves</td></tr><tr><td>pyruvate</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>reagent, activity/ROS release assay</td></tr><tr><td>alpha-ketoglutarate</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>reagent, activity/ROS release assay</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>reagent, activity/ROS release assay</td></tr><tr><td>thiamine pyrophosphate</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>reagent, activity/ROS release assay</td></tr><tr><td>mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>buffer component</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>buffer component</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>buffer component</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>buffer component</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>reagent, ROS release inhibitor</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td><td>reagent, ROS release inhibitor</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>reagent, ROS release detection</td></tr><tr><td>horseradish peroxidase</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>reagent, ROS release detection</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>reagent, ROS release detection</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2 microplate reader</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>microplate reader for assays</td></tr><tr><td>Gen5 software</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>software, used for collection of raw RFU</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad software</td><td></td><td>software, data analysis</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td><td>Microsoft</td><td></td><td>software, data analysis</td></tr></tbody></table>

simultaneous measurement of superoxide/hydrogen peroxide and nadh production by flavin-containing mitochondrial dehydrogenases

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (2O●-), 과산화 수소 (H2O2)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O2●/H2O2를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H2O2 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H2O2 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H2O2 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H2O2 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H2</s...

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Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K 조회수.  Memorial University of Newfoundland. 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of hydroxamate siderophores that are essential for virulence (e.g. ferricrocin or N',N",N'''-triacetylfusarinine C)1. The reaction catalyzed by SidA can be divided into reductive and oxidative half-reactions (Scheme 1). In the reductive half-reaction, the oxidized FAD bound to Af SidA, is reduced by NADPH2,3. In the oxidative half-reaction, the reduced cofactor reacts with molecular oxygen to form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which transfers an oxygen atom to ornithine. Here, we describe a procedure to measure the rates and detect the different spectral forms of SidA using a stopped-flow instrument installed in an anaerobic glove box. In the stopped-flow instrument, small volumes of reactants are rapidly mixed, and after the flow is stopped by the stop syringe (Figure 1), the spectral changes of the solution placed in the observation cell are recorded over time. In the first part of the experiment, we show how we can use the stopped-flow instrument in single mode, where the anaerobic reduction of the flavin in Af SidA by NADPH is directly measured. We then use double mixing settings where Af SidA is first anaerobically reduced by NADPH for a designated period of time in an aging loop, and then reacted with molecular oxygen in the observation cell (Figure 1). In order to perform this experiment, anaerobic buffers are necessary because when only the reductive half-reaction is monitored, any oxygen in the solutions will react with the reduced flavin cofactor and form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate that will ultimately decay back into the oxidized flavin. This would not allow the user to accurately measure rates of reduction since there would be complete turnover of the enzyme. When the oxidative half-reaction is being studied the enzyme must be reduced in the absence of oxygen so that just the steps between reduction and oxidation are observed. One of the buffers used in this experiment is oxygen saturated so that we can study the oxidative half-reaction at higher concentrations of oxygen. These are often the procedures carried out when studying either the reductive or oxidative half-reactions with flavin-containing monooxygenases. The time scale of the pre-steady-state experiments performed with the stopped-flow is milliseconds to seconds, which allow the determination of intrinsic rate constants and the detection and identification of intermediates in the reaction4. The procedures described here can be applied to other flavin-dependent monooxygenases.5,6

We describe the use of a stopped-flow instrument to investigate both the reductive and oxidative half-reactions of Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA), a flavin-dependent monooxygenase. We then show the spectra corresponding to the species in the reaction of SidA and we calculate the rate constants for their formation.

중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

연구

생체공학

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

생화학

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Mitochondrial Functional Assessment in Brush Lizard Liver Mitochondria

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

<meta charset="utf8"></head><body>치료 및 생물 살충제 응용 분야를 위한 미토콘드리아 기능 변경

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). However, their significance extends far beyond energy production. Dysregulation of mitochondrial bioenergetics can trigger intracellular cascades that impact health and cellular function. Given their physiological importance, there is growing interest in exploring the pharmacological potential of mitochondrial function for developing new therapies and bioproducts. Modulating mitochondrial bioenergetics could provide innovative approaches to address challenges such as neurodegenerative disorders, metabolic diseases, and cancer, as well as to develop bioproducts for controlling pests and vector-borne diseases.
This work presents a method for assessing the effects of xenobiotics on the electron transport chain (ETC) using various substrates, including glutamate and NADH for complex I, succinate for complex II, and cytochrome c (both oxidized and reduced) for complexes III and IV. This methodology allows the activation or inhibition of electron transport through mitochondrial complexes to be evaluated using a respirometer and spectrophotometer. The mitochondria can be sourced from isolated mitochondria, fragmented cells, or homogenized tissue from various species.
In the laboratory, mitochondrial function has been analyzed in Aedes aegypti and Wistar rats, but this method is also applicable to other species, such as Rhipicephalus microplus and Rhodnius prolixus. This approach provides the basis for theorizing about the existence of uncoupler proteins and species-specific oxidizable substrate preferences influenced by their unique energetic demands. Recent findings offer valuable insights into innovative bioinsecticide design strategies that target mitochondrial function, holding significant potential for effectively controlling vector-borne diseases and pest infestations.

<meta charset="utf8"></head><body>고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

This study introduces a methodology for studying xenobiotic effects on mitochondrial function via respirometric and enzymatic assays. It examines electron transport chain modulation in various species, offering insights for targeted biopesticide development against insect vector-borne diseases.

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

요약

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중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정