Name: detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
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저자는 감사 로버트 Genn 일리노이 대학에서 크리스토프 폰 Ballmoos 베른 대학에서에서 제공 하는 플라스 미드와 보3를 표현 하는 스트레인-산화 효소. 프로젝트 BBSRC에 의해 지원 되었다 제공 RI와 R.B. BB/L01985X/1을 부여

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저자는 공개 없다.

다음과 같은 몇 가지 문제가이 실험 방법의 성공을 위해 고려해 야 할:
의 지질 bilayers proteoliposomes 및 대상에 대 한 선택: 양이온 지질에에서 없는 자연, 음이온 지질은 풍부한 생물 막 도달, 예를 들어, 25, 35, 대장균, 효 모 S. cerevisiae, 원형질 막 및의 안 미토 콘 드리 아 막의 내부 막에서 20%에 많은 종, 각각27,,2829. 그것은 합리적인 pl+ 막 단백질의 기능 양이온 지질 bilayer는에서 및 외부 이온의 상대적인 내용에 따라 차례로 bilayer의 포지티브 차지의 강도 의해 영향을 받을 수 있습니다 기대 하는 것 강도입니다. 따라서, 그것은 어느 정도 관심의 막 단백질의 기능에 따라 다르죠 양이온 지질 환경의 실험적으로 해결 하는 것이 중요. 여기, 우리는 둘 다 F1Fo ATP synthase와 보3보여줍니다-산화 효소 양이온 지질 환경에 민감 하지만 우리가 조절 하 고 관리 하 첫 pl+ 단백질을 배치 하 고에 그들을 제공 하 여이 효과 역방향 음이온 bilayers, 수락 하 고 다음 퓨전 후 반응 매체의 이온 강도 증가 완료.
특정 양이온 지질의 선택: 대부분 상용 양이온 지질은 비 triacylglyceride 자연; 따라서 잠재적인 후보 지질 막 단백질의 호환성에 대 한 테스트 되어야 한다. 우리가15 는이 연구에 사용 된 ATP synthase PL+ 에서 최상의 성능을 에틸-PC, DOTAP (triacylglyceride에에서 자연 triacylglyceride 지질 하 높은 구조 유사 했다의 형성 이전에 발견 지질) PL+ 이 단백질이 덜 활성화 했다.
소포 융해 분석 실험: 진정한 기 퓨전 (intravesicular 액체 내용을 믹스) 때 소포 그들의 수성 콘텐츠를 혼합 하지 않고 서로 준수 하지만 쉽게 그들의 외부 또는 둘 다 지질의 내용을 혼합 중간 hemi-퓨전 상태에서 분화 될 필요가 전단지30. 차선의 지질 혼합물 또는 특정 조건, 소포는 또한 퓨전31동안 발음된 액체 내용 누설을 보여줍니다. 진정한 퓨전을 사용 하는 fusogenic 혼합물에 충전된 지질의 최소 농도 각 지질 종족에 대 한 실험적으로 발견 될 필요가 있지만 일반적으로, 그것은 10% 미만으로 세포 막 지질은 비 fusogenic 32렌더링 청구 발견.
멀티-발렌타인 이온의 존재에 fusogenic SUV를 형성 하는 동안 그것은 중요 하다 반대로 충전된 구성 요소, 혼합에 아닙니다이 이온에 의해 즉시 응집 및 지질 집계 될 수 있습니다. 예를 들어 코발트-calcein-EDTA 메서드에 대 한 SUV를 준비 하는 동안 이멀전의 구성 요소 폴 리 카보 네이트 필터의 막힘을 방지 하기 위해 EDTA와 양이온 지질 혼합물을 혼합 하지 마십시오 중요 하다.
그것은 또한 그 코발트-calcein-EDTA 방법 매우 민감하고 실시간 퓨전 모니터링, 편리 하면서 수 여전히 과소 평가 1 인 융합의 범위를 언급 하는 것이 중요) 자체 내부 무료 calcein의 형광의 냉각 postfusion 소포, 자체 냉각 임계값은 약 20 µ M33, 고 2 보고 하는 동안 1 m m를 도달할 것으로 예상 되는) 표면 바인딩된 코발트-calcein, 젤 여과 지를 통과 후에 SUV+ 에 바인딩된 남아 있는 고 반면 SUV0 창백한 오렌지 색상 밝은 오렌지 색 소포를 색상. 또한 세제 Triton X-100 EDTA 존재의 추가에 바인딩된 코발트 calcein의 출시 SUV0 (회색 추적) 보다 SUV+ (그림 3C, 빨간 추적)에 대 한 훨씬 더 강력한 신호 생성 note.
관점: 우리는 여기에 설명 된 빠른 접근 수 있습니다 크게 용이 하 게 하 고 속도 신흥 합성 생물학 응용 프로그램의 요구에 대 한 복잡 한 막의 어셈블리를 기대. 우리의 막 단백질 재구성 프로토콜은 깨지기 쉬운 큰 막 단백질의 재구성에 대 한만 30 분이 fusogenic 접근 제공에 5-10 분 동안 긴 투 석 기반 재구성 기술에 민감한 것으로 알려져 큰 지질 bilayers에 같은 단백질. 여기, 대장균 F1Fo ATP synthase, 깨지기 쉬운 단백질의 예로 조작 하 여 이러한 접근 방법의 이점을 설명 합니다. 그것은 23 subunits 고 중/후 가용 화, 차선 조건 (예: 열)에 노출 하는 경우의 무결성을 쉽게 잃게 알려져 있다 하지만이 절차에서 사용 되 고, 단백질 양성자 펌프에 reproducibly 높은 활동을 보여줍니다.

막 단백질을 함께 인공 지질 bilayers의 기능화 막 모델 시스템의 어셈블리에서 핵심적인 단계입니다. 가장 간단한 모델, proteoliposomes (PL), 소형 (30-200 nm 직경)의 구성 단백질 unilamellar 소포 (SUV, 또한 전화 리), 그들의 막에 통합. PL은 전통적으로 형성 된 2 단계1. 첫째, 미리 형성한 SUV는 막 단백질의 관심, 임계 micelle 농도 (CMC)의 위 농도에 세제와 혼합 됩니다. 둘째, 세제는 다양 한 투 석, "바이오-비즈" 또는 젤 여과 기법, 막에 있는 단백질을 떠나 함께 제거 됩니다. 후자의 접근 방식을 훨씬 빠른 (~ 30 분1) 이며 따라서 연 약하고 민감한 막 단백질의 재구성 하는 것이 좋습니다 동안 처음 두 가지 방법 많은 시간을 소요 하 고 발생할 수 있습니다 세제 제거 속도 의해 제한 되는 활동 및 단백질의 구조적 무결성의 손실의 상당한 손실. 더 큰의 기능화 소포 (큰 unilamellar 소포, LUV, 1 µ m 직경까지)이이 접근에 의해 더 도전 소포 크기 세제 제거 후 감소 되 면 이며, 그것은 거 대 한 unilamellar 소포 불가능 (우두머리, > 1 µ m), 그들은 세제 (하지만 참조 존슨 그 외 여러분 에 의해 불안정 2 큰 bilayers에 있는 막 단백질의 느린 2D-결정에 대 한). 우두머리 막 기능화3,,45 에 대 한 대체 방법을 존재 하지만 힘 드는, 시간 소모, 그리고 일부 세제 농도 CMC 아래에서 해야. 더 복잡 한 또는 허약한 지질 모델 (예를 들어 물방울 히드로 Bilayers6 및 3D 인쇄 방울 인터페이스 Bilayer 기반 인공 조직7) 세제를 참을 수 없습니다. 신속 하 게 합성 생물학 응용 프로그램8,신흥9,10 비판적으로 의존 같은 복잡 한 막 구조의 기능화. 따라서, 대상 연약한 bilayers에 막 단백질의 신속 하 고 부드러운 배달 수 있도록 쉽고 강력한 방법 높은 필드에 전과 있다.
대신, 세제 무료 단백질 전달 방법이 이다 소포 융해, 어디 상호 작용 소포 막 단결 그대로 postfusion bilayer에 그들의 intravesicular 수성 내용, 외부에 발표 되 고 없이 혼합 하는 동안 환경입니다. 소포 융해 활성화는 연락에 있는 보완 fusogenic 에이전트 (일부 단백질11,12 , 펩 티 드13 또는 특별히 수정 된 DNA14) 내에서 구조적 재배열에 의해 구동 bilayers, 또는 지질 bilayers 간의 Coulombic 상호 작용 complementarily 충전된 양이온 및 음이온 지질15,16또는 양이온 bilayers 및 부정 청구 단백질17의 형성.
전 접근 필요 퓨전, 이전 상호 작용 세포 막의 fusogenic 요원의 존재 이지만 상대적으로 느린 (~ 30 분 퓨전12,18의 절반 최대에 도달), 모두 자연과 인공에 적용할 수 있습니다. 막입니다.
Fusogenic 지질 (그림 1)를 사용 하 여 접근의 장점은 훨씬 빠른 막 융합 (반-최대, 및 반응 완료 5-10 분 ~ 1 분)는 이다. 또한, 융합의 범위 i) 하기 쉬운 상대 콘텐츠 청구 지질 bilayers fusogenic, 및 ii) 이온의 일반, 삼투성 강도 50 m m 및, 예를 들어, 자당15 위 (소금에서 반응 매체의 공식화에 의해 통제 될 수 있다 같습니다 퓨전 중지), 또는 둘 다의 조합. 퓨전을 시작 하려면 반대로 충전된 fusogenic 소포는 5-10 분에 대 한 낮은 (일반적으로 10-20 밀리미터 소금) 이온 강도 매체에 혼합 됩니다. 한 상대는 방법의 단점은 양이온 지질 양이온 proteoliposomes 퓨전, 특히 낮은 이온 강도에서 이전에 막 단백질의 기능에 부정적인 영향을 발휘할 수 있습니다 하지만이 효과 가역과 자연에 의해 완화 융해 후 막과 정상 이온 강도 매체에 그것의 반환의 지질 구성.

<table><tbody><tr><td>DOPC neutral lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA anionic lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC cationic lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Type 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>Extrusion system</td><td>Avanti Extruder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tube luminometer, model Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate filter, D19 mm</td><td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td><td>WHA800309, WHA800284</td><td>100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers used in the paper&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Buffer C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td></tr><tr><td>Buffer D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7.4&lt;br/&gt; Various concentrations of KCl</td></tr></tbody></table>

detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.

더 복잡 한, 더 큰 모델 지질 bilayers는 세제와 덜 호환 세제 30-100 nm 작은 unilamellar 소포에 막 단백질의 납품을 위한 불가결 하지 않습니다.
여기는 반대로 리 베어링의 막 단백질을 청구 하는 fusogenic를 사용 하 여이 근본적인 한계를 우회에 대 한 전략에 설명 합니다. 이러한 vesicles 사이의 융합 낮은 이온 강도 버퍼에서 5 분 이내에 발생합니다. 긍정적으로 위탁된 한 fusogenic 리 부정 청구 biomimetic 대상 지질 bilayers에 막 단백질의 세제 무료 배달에 대 한 간단한 셔틀 벡터로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 fusogenic proteoliposomes 빠른 30 분 프로토콜에 막 단백질을 다시 구성 하는 방법을 보여줍니다.
이러한 두 가지 방식을 결합 하 여, 대장균에서 두 막 단백질의 구성 하는 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리 설명, 기본 양성자 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase의 세포 막에서 0.1에서 배열 하는 다양 한 크기의 소포 >이 체인에 의해 ATP 생산 뿐 아니라 10 미크론.

Fusogenic 사용 하 여 무료 충전 3 단계 (그림 1)를 포함 하는 대상 bilayer 막으로 막 단백질의 빠른 세제 무료 배달에 대 한 proteoliposomes: A, fusogenic SUV 높은 지질 혼합물에서의 형성 충전된 지질;의 내용 이 SUV는 intravesicular 부하;을 선택적으로 있습니다. B, 우리의 빠른 막 단백질 재구성;를 사용 하 여 PL로 fusogenic SUV의 변환 C, fusogenic PL 대상 bilayers 낮은 소금 매체에서와 융합 융합 반응을 중지에 높은 소금의 추가 의해 따라. 큰 소포 (D) 일 경우 바람직 전략 음이온 대상 bilayer, 막 단백질의 활동에 대 한 더 나은 지질 환경 제공으로 막 단백질을 제공 하는 (토론 더 텍스트에서).
거꾸로 에멀젼 방법을 우두머리 형성 프로토콜은 그림 2에 자세히는 강조 표시 됩니다. 우리 때문에 상대적으로 높은 지질 오일 혼합물에 hexadecane를 사용 하는 것을 선호 판 우두머리 후 응고 기름 쉽게 제거 가능 (18 ° C) 냉동 온도.
그림 3 에서는 소포 융해를 코발트-calcein-EDTA 메서드를 사용 하 여 보여 줍니다. 퓨전 보완 청구 소포 높은 소금 농도 동안 낮은 소금 버퍼에 사용 됩니다 경우에 볼 수 있다 (> 50 m m14) 또는 비 fusogenic 소포를 사용 하 여 설명 없는 퓨전.
Fusogenic SUV로 막 단백질의 재구성의이 빠른 프로토콜은 그림 4A에 나와 있습니다. 우리 빨리 입증이 프로토콜을 사용 하 여 기본 양성자의 재구성 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase PL, 그리고이 세포 막에 그들의 특정 활동의 평가에. 그것은 중요 한 단백질 재구성의 수익률 지질 사용15 의 책임에 의존 하지 않습니다 및 약 50-7525,12, 그리고 그 후에 PL로 재구성, 단백질 저장 될 수 있다 적어도 3 일 에서도 단백질 활동의 명백한 손실 없이 실내 온도. 이 절차는 또한 ATP synthase, 그것의 95%는 그것의 친수성 moiety F1 중심 바깥쪽15,26의 단방향 방향을 제공 합니다.
그림 5 는 F1Fo (패널 A)의 활동 및 보3를 양수 하는 양성자를 보여줍니다-양이온 지질에 산화 효소 (패널 B)은 감소 하 고 음이온과 중립 지질 환경에 비해 낮은 이온 강도에 민감 하지만 이 효과 음이온 LUV-+ PL 융합 후 postfusion 막에 완화 됩니다.
그림 6 의 큰 소포 막으로 F1Fo ATP synthase의 납품을 보여 줍니다. 이 실험, PL+ 에 800 nm LUV- 20 m m KCl 5 분, 그리고 반응 제품에 융합 했다 수송과 들뜬된 PL+를 제거 하려면, resuspended 이었고 양성자 펌프에 대 한 분석. 제어 실험 아무 양성자 펌핑 LUV0 대신 LUV- 의에서 사용 된 융해 반응 (검은 추적), 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적) 하는 때 보였다.
Fusogenic PL에 의하여 큰 소포 막에 작동 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리는 그림 7에 표시 됩니다. F1Fo SUV+ 를 사용 하는 우리 보3 SUV+ 융해 800 nm LUV-, 코엔자임 Q1 과 정력적으로 DTT 순차적으로 추가 하 여이 체인 postfusion 소포에 의해 ATP 생산을 증명 막, 고 인산 염 ATP 합성 F1Fo트리거 추가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> 그림 1: 개념의 초고속 세제 무료 배달 막 단백질의 unilamellar vesicles의 융합을 통해 대상 지질 bilayers에 보완 된 지질 형성. 선택적으로 intravesicular 화물 적재 양이온 및 음이온 fusogenic unilamellar 작은 소포 (+의 SUV, SUV-)의 (A) 형성. (B) fusogenic fusogenic proteoliposomes (PL) 막 단백질의 재구성에 의해에 SUV의 변환. (C) 세제 무료 큰 소포, 100 nm PL+ 사이의 융합에 의해 그림의 세포 막에 막 단백질의 배달에 대 한 fusogenic와 줘. (D) 바람직 전략 postfusion 막으로 막 단백질의 배달 그리고 800 nm LUV-입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> 그림 2: 우두머리 형성 프로토콜 거꾸로 에멀젼 방법. (A) 석유 지질 혼합물 및 물 사이 국경에 지질 단층의 형성. (B)는 거꾸로 (물에서 기름) 유제의 형성. 원심 분리에 의하여 기름-물 국경을 통해 유제를 전달 하 여 (C) 우두머리 형성. (D) 냉각 튜브 아래의 < 18 ° C 고형화 하 고 기름을 제거 ~. 그것의 막 (녹색)와 기의 루멘 (레드)에서 북극 fluorophore (1 m m Sulforhodamine 101) 형광 지질 (1% 무게 분수 cholesteryl-Bodipy-FL12)를 포함 하는 우두머리의 (E) A 형광 현미경 이미지. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> 그림 3: 지질 소포 융해 코발트-calcein-EDTA 방법으로 공부 했습니다. 어디 무료 calcein 릴리스입니다 비 형광 코발트-calcein 복합물에서 EDTA에 의해 방법의 (A) 회로도 (B) 융합의 SUV 다양 한 KCl 농도에서. 텍스트에 설명 된 대로 B 에서처럼 postfusion 소포를 EDTA와 트라이 톤 X-100 세제의 추가 의해 intravesicular calcein의 (C) 자료. 붉은 추적에 대 한 융합 정도 (%)은 최대한 배경 수정 퓨전 신호를 나누어 계산 (1-2) 신호에 의해 배경 수정 최대한 캡슐화 된 calcein (3-2)의 출시에 따라 고 100을 곱한. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> 그림 4: 보3의 초고속 재구성-산화 효소 및 fusogenic proteoliposomes와 같은 proteoliposomes에 단백질 활동 측정으로 F1Fo . (A) 도식 재구성 프로토콜의 (B) 코엔자임 Q1 산화 양성자 펌프 보3에 의해 구동-PL 산화 효소 (텍스트 설명)를 냉각 하는 ACMA로 측정. (C) ATP 가수분해 기반 양성자 펌핑 pl에서 F1Fo ACMA 냉각 (텍스트 설명)로 측정. F1Fo pl에서 (D) ATP 가수분해 ATP 회생 시스템 (텍스트 설명), 및 그것의 자극에는 uncoupler에 의해 측정. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> 그림 5: 막 단백질의 활동에 지질 환경 및 이온 강도 영향. 양성자 펌프 F1Fo (A) 및 보3-20, 100 m m KCl. 제어 추적 (음이온 LUV (녹색 추적)와 융합 하는 양이온 PL (빨간 추적), 음이온 PL (블루 추적), 중립 PL (검은 추적), 그리고 양이온 PL에 산화 효소 (B) 회색) Fo PL- 혼합 시 SUV-와 F1에 의해 양수 하는 양성자의 변화를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> 그림 6: 배달 F1Fo ATP synthase의 800의 세포 막에 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): PL+ 와 800 nm LUV- 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 m m MgCl2, 20 m m KCl 5 분, 제거 수송과 융합 했다 PL, 들뜬 및 동일한 버퍼에서 resuspended. (B) 양성자 postfusion LUV (빨간 추적)에 의해 펌핑. 제어 실험 때 PL0 luv- (검은 추적), 혼합 했다 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적)에 냉각 하는 아무 ACMA 보였다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> 그림 7: 5-분 세제 무료 조립 800의 세포 막에서 전자 전송 체인의 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): 100 nm F1Fo PL+ 와 100 nm 보3- 그림 6에서 설명한 대로 산화 효소 PL+ -, LUV로 융합 했다. 퓨전은 KCl MOPS 100, 50 mM에 각각 추가 하 여 중지 되었습니다. 세포 막 ADP-소-luciferase 칵테일 혼합 되었고 텍스트에 설명 된 대로 DTT와 Q1의 추가 의해 활성화. ATP 생산은 1 m m 인산 염 (Pi) 및 모니터링된 실시간으로 텍스트에 설명 된 대로 luciferase 소 시스템의 추가 의해 시작 되었다. Postfusion 소포 (빨간 추적)에 의해 (B) ATP 종합. 제어 실험 때 PL+ 높은 소금 (회색), LUV- 와 함께 혼합 했다 또는 PL0 LUV- (블랙)와 함께 혼합 했다 아니 ATP 생산을 보였다. ATP 합성 속도 텍스트 (단계 8.8 8.9)에 설명 된 대로 계산 됩니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.1K 조회수.  First Pavlov State Medical University. 여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

생체공학

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

신경과학

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma membrane and the numerous factors that influence protein behavior in live cells. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a biomimetic and highly tunable in vitro model system for investigating protein-membrane interactions and probing protein behavior in a precise, stimulus-dependent manner. In this protocol, we present an inexpensive and effective method for fabricating GUVs with the human serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stably integrated in the membrane. We fabricate GUVs using a modified hydrogel swelling method; by depositing a lipid film on top of a mixture of agarose and 5-HT1AR and then hydrating the entire system, vesicles can be formed with properly oriented and functional 5-HT1AR incorporated into the membrane. These GUVs can then be used to examine protein-membrane interactions and localization behavior via microscopy. Ultimately, this protocol can advance our understanding of the functionality of integral membrane proteins, providing profound physiological insight.

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

This protocol utilizes agarose swelling as a powerful and generalizable technique for incorporating integral membrane proteins (IMPs) into giant unilamellar lipid vesicles (GUVs), as described here for the reconstitution of the human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), one of the classes of pharmacologically important G protein-coupled receptors.

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

생물학

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...