체코 과학 재단 (프로젝트가 CR 17-12816S) 및 CEITEC 2020 (LQ1601)에 의해 금융 지원은 크게 인정 했다.

1. 마그네틱 나노 입자 합성 <ol><ol><li>FeCl 3의 추가 20 mmol 시트르산 (MNPs)와 자성 나노 입자의 합성 안정화 <li>&#8729; 6 H 2 O (5.406 g) 및 FeCl의 10 mmol 2 &#8729; 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated 이중 증 류 물 (ddd) 20 mL에. 투명 한 솔루션을 얻을 때까지 기계적인 교 반기를 사용 하 여 N 2 분위기에서 비 커에 적극적으로 솔루션을 얻은 볶음.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 150 mL의 1 M NH 4 오, 드롭 들러 떨어지고 퍼 널 (1 시간 또는 더 필요한 경우)를 사용 하 여 추가. 모든 NH 4 오 추가 되는 솔루션 screwable 그릇에 전송 합니다. 30 분에 75 ° C에서 선박 및 열 솔루션을 스크류 
		주의: NH 4 오는으로 분류 부식성 환경에 대 한 위험. 
		참고: 높은 학년 28% NH 4 deoxygenated 물을 사용 하 여 물에 오에서에서 NH 4 오 솔루션 준비.</li>
		<li>수집 및 사용 하 여 자석 세척 ddd 물 100 mL를 사용 하 여 검은 침전. 3 회 반복 한다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사. 
		참고: 트라이-나트륨 시트르산이 수화물의 deoxygenated 솔루션 사용.</li>
		<li>쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 80 ° C에서 열 배를 통해 다시 분산 된 침전 
		참고: 충분 한 힘의 sonicator 필요.</li>
		<li>실내 온도에 솔루션 식힙니다. 침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 다시 검은 진흙 sonicator (35 kHz, 100%의 진폭)를 사용 하 여 ddd 물 50 mL에 분산.</li>
		<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 aliquots (25 mL)을 전송 하 고 아세톤 20 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 2400 x g에서 원심과 supernatants 제거.</li>
		<li>다시 침전을 분산 하 고 24 헤에 대 한 적합 한 볼륨의 낮은 분자량 컷오프 투 석 장치 (500-1000 다)를 사용 하 여 물에 대 한 솔루션 dialyze 
		참고: 준비 제조 업체에 따르면 투 석 장치 &#39; s 요구.</li>
	</ol></li> <li>분기 polyethylenimine (MNPs_PEI)로 자성 나노 입자의 합성 <ol><li>유리 비 커에 얻은 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 2 개 mL를 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 sonicate (35 kHz, 100%의 진폭) 서 스 펜 션 (10 분).</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 추가 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa). 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>수집 자석을 사용 하 여 침전 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 다시 침전 20 mL ddd 물에 분산. 5 회 반복 후 마지막 정지 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>자성 나노 입자의 합성 실리 카 (MNPs_TEOS) 수정 <ol><li>유리 비 커에 10 mL 취득된 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 28% NH 4 오 6 mL을 추가 하 고 솔루션을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 10 mL에 다시 분산 입자 물와 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>아미노 그룹 (MNPs_APTES)로 자성 나노 입자의 합성 <ol><li>유리 비 커에 얻은 MNPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. (35 kHz, 100%의 진폭) 솔루션을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). 다시 분산 입자의 ddd 5 mL에 물과 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate.</li>
	</ol></li></ol> 2. 마그네틱 미 합성 <ol><li><ol><li>2 M 알 것 3, 1 M 코의 12.5 mL 및 screwable 그릇에 ddd 물 205.875 mL의 추가 25 mL 자기 미의 합성 시트르산 (MMPs)와 안정. 자석 교 반 중 1 M FeSO 4 6.675 mL를 추가 합니다. 2 헤에 대 한 따뜻한 물 목욕 (90 ° C)에 즉시 전송 선박 
		참고: 알 3와 ddd에서 코 솔루션 준비 물.</li>
		<li>실내 온도에 솔루션 식힙니다. 사용 하 여 자석 및 세척 ddd 물 50 mL (5 번)을 사용 하 여 검은 침전을 수집 합니다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사.</li>
		<li>쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 수집 검은 침전 자석 및 세척 (10 번) ddd 물 50 mL를 사용 하 여 그것을 사용에 대 한 80 ° C에서 열 배를 통해 침전 redisperse.</li>
		<li>수정 MMPs 분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)와 실리 카 (MMPs_TEOS) 및 아미노 그룹 (MMPs_APTES) MNPs 프로토콜에 비슷합니다. 2.2, 2.3, 2.4, 각각에 대 한 자세한 내용은 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)로 자기 미의 합성 <ol><li>유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 (35 kHz, 100%, 10 분의 진폭) 솔루션을 sonicate. 빠른 기계 교에서 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa) 추가 합니다. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 두 배 증류수 20ml에 침전 redisperse 5 회 반복 후 (35 kHz, 100%의 진폭) 최종 솔루션을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>합성 실리 카 (MMPs_TEOS)로 자기 미의 <ol><li>유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate 고 추가 28% NH 4 오 6 mL.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 물 5 mL에 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li> <li>아미노 그룹 (MMPs_APTES)로 자기 미의 합성 <ol><li>유리 비 커에 MMPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 3 개 mL를 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
		<li>빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어</li>
		<li>는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회)과 물 (3 시간) 50 mL에 그것을 씻어. Ddd 물 3 ml에서 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.</li>
	</ol></li></ol> 3. 자석 입자 크기 분석을 사용 하 여 DL 다시 산란 검출기 각도 (173 °) 및 633의 빔 파장 적용 되는 <ol><li>물에서 입자 크기 <ol><li>는 DL 사용 하 여 악기 nm. 
		참고: 다시 산란 DL 여러 분산을 피할 수 있다 집중된 샘플에 적합 하다. 사이드 산란 (검출기 각도 90 °) 앞으로 산란 (검출기 각도 15 °) DL 적합 작은 입자 및 입자를 각각 혼합.</li>
		<li>이전 측정 물에 3 분에 대 한 입자 sonicate 
		참고: 입자의 희석된 솔루션을 사용 합니다. 이 위해 입자의 9.6 µ L 96 µ L의 물 혼합.</li>
		<li>신중 하 게에 폴리스 티 렌 라텍스 입자 솔루션의 50 µ L를 플라스틱 큐 벳 거품의 형성을 방지 하는 고. 
		참고: 각 샘플 사용 일회용 cuvette (자료 목차 참조).</li>
		<li>참고는 베트의 선명도 광선의 방향. 샘플 홀더에 셀을 삽입 하 고 챔버 닫습니다.</li>
		<li>측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 2.344; 분산 환경 (물)의 굴절률: 1.333 
		참고: 소설 또는 하이브리드 재료를 개발 하는 경우에 특히 더 정확한 결과 얻으려면 한 굴절 계를 사용 하 여 굴절률의 측정 수행.</li>
	</ol></li></ol> 4. DNA, 자석 입자 및 바인딩 버퍼 준비 <ol><li>DNA 주식 <ol><li>사용 10 mM Tris HCL 버퍼 (pH = 8) 희석 및 DNA의 저장. 실험실 (섹션 5.2 반응 설정 및 조건에 대 한 참조)에서 직접 PCR 프로토콜으로 증폭 될 수 있는 표준 DNA 샘플을 사용 합니다. 498 기본적인 쌍 (bp) 살 균 소 λ 컨트롤에서 xis 유전자의 증폭, 다음 프라이 머를 사용 합니다. 뇌관을 앞으로: 5 &#39;-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3Ɔ 반전 뇌관: 5 &#39;-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3 &#39;</li> <li>정화 PCR 제품 상업적 DNA 정제 키트를 사용 하 여. 
		참고: 실리 카 열 기반 프로시저를 사용 하 여 상업적 키트 항복 &#62; 100 ng / µ L 정화 DNA.</li>
		Spectrophotometric 메서드를 사용 하 여 DNA의 <li>측정 농도 (260에서 흡 광도 nm). 10의 작업 솔루션 위의 지시로 10 11 복사본 / µ L의 DNA 재고 희석 10, 10 9, 10, 8 및 10 7 복사본 / µ L. 
		참고: PCR 제품의 복사본의 수 평균 분자량은 각 혈압에 대 한 650 다 가정 다음 방정식에 따르면 산출 될 수 있다: DNA 복사본 / µ L = (ng / µ L에 수량 * 6.022x10 23 복사본/mol) / (498 bp * 혈압의 650 g/mol * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>자석 입자 <ol><li>입자는 자석 없이 토사를 허용 하 고 상쾌한 제거. 1시 20분 믹스 ddd 물 자석 입자의 v/v 비율 (입자: 물). 
		참고: 볼륨 기반 접근 MNPs와 MMPs의 동등한 대 중은 쉽게 비교 하기 어려운 이후 자석 입자의 수량을 설명 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>버퍼 바인딩 <ol><li>0.75 M 나트륨 아세테이트 HCL 솔루션의 빠른 준비에 대 한 (pH = 6), 3m 나트륨 아세테이트의 1 mL의 1 m m HCL 3 mL 혼합. 
		참고: 바인딩에 사용 되는 모든 솔루션은 4에 저장 될 수 있다 ° C. 참고 낮은 온도 크게 에탄올 솔루션의 경우 특히 바인딩 증가. 더 나은 재현성에 대 한 솔루션의 온도 심사의 정확성 제어.</li>
	</ol></li></ol> 5. 효율의 DNA 격리를 사용 하 여 정량 PCR 테스트 <ol><li>수정 MMPs 또는 MNPs DNA 격리 <ol><li>96 잘 접시와 작은 볼륨 실험에 대 한 96 잘 접시에 맞게 자석 사용.</li>
		<li>다음 바인딩 솔루션 혼합물을 사용 하 여: 8 µ L 수정 MMPs MNPs, 10 µ L 나트륨 아세테이트-HCl (0.75 M, pH = 6), 60 µ L 85% 에탄올, 10 µ L DNA의 (10 10 복사본 솔루션).</li>
		<li>믹스 pipetting으로 잘 하 고 3 분에 대 한 자석에 접시를 놓습니다. 자석에 접시를 실행 하는 동안 솔루션을 제거 하 고 세척에 대 한 85% 에타 놀의 100 µ L 추가.</li>
		<li>제거 에탄올. 
		참고: 몇 초 동안 건조 에탄올을 허용 하지만 지나치게 건조 하거나 균열 입자를 두지 마세요. 그들은 입자 이상 건조 하는 경우 차입 솔루션 디졸브 어려울 것 이다.</li>
		<li>자석에서 접시를 제거 하 고 차입 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 섞는다. 자석에 다시 접시를 놓고 eluted DNA를 수집 (~ 37 µ L). 추가 분석까지-20 ° C에서 eluent 저장.</li>
	</ol></li> <li>정량 PCR <ol><li>드는 외 프로토콜에 따라 재고 단계 xis 유전자의 복사본을 계량 하기 4.1.1에서에서 DNA를 준비 하는 데 사용 된 뇌관을 사용 하 여. 10</li> <li>마스터 믹스 솔루션 테스트 샘플의 양에 따라 준비 후 PCR 튜브 또는 흰색 배경 96 잘 접시에 혼합물을 배포.</li>
		<li>20 µ L PCR 혼합의 완전 한 볼륨에 대 한 다음 수량을 사용 하 여: 10 µ L 중 합 효소 / 염료 혼합 intercalating (재료의 표 참조), 2 µ L DNA 샘플, 2 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M), 2 µ L 역 뇌관 (10 µ M)</li>
		<li>다음 프로그램에 따르면 thermocycler 설정: 120 95 ° C s, 40 사이클 (15 95 ° C s, 64 ° C 15에 대 한 s, 45 ° C 68 s), 68 ° C 5 분</li>
		<li>표준 및 샘플을 사용 하 여 triplicates 주기 임계값을 계산 하 고 각 샘플에서 검색 하는 DNA의 사본의 수를 추정 하는 표준 곡선을 구성. 여기에 사용 되는 악기가 자동으로 수행 합니다.</li>
		<li>여기, DNA의 사본의 수 총 차입 볼륨 (~ 40 µ L)으로 추정 된다. DNA 솔루션 (완전히 10 11 부)를 바인딩 추가 원래 금액을 해당 검색의 비율 0 ~ 100 간격 넘어 다를 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 6. DNA-마그네틱 입자 바인딩 분석을 사용 하 여 DL <ol><li>DNA 바인딩 <ol><li>큰 볼륨에 대 한 실험 (1.5 mL 튜브)에 다음과 같은 바인딩 솔루션 혼합 사용: 96 µ L MMPs MNPs, 120 µ L 나트륨 아세테이트-HCl의 수정 (0.75 M, pH = 6), 720 85% 에탄올, 120 µ L DNA의 µ L (10 10 복사본 솔루션) 또는 120 µ L Tris HCL 버퍼 (10 m m, pH = 8) 컨트롤.</li>
	</ol></li> <li>제타 잠재력 분석 <ol><li>준비 2 바인딩 솔루션, dna와 Tris HCL 버퍼 제어 단계 6.1.1에서에서 지시. 거품의 형성을 방지 하려면 신중 하 게 일회용 셀에 바인딩 혼합물의 800 µ L를 플라스틱. 
		참고: 표면 제타 잠재적인 (재료의 참조 테이블)의 측정에 대 한 일회용 cuvette 사용.</li>
	</ol></li> <li>DL 계기에 측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: Smoluchowski 모델은 F(ka) 1.5, 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 분산 환경 (물)의 2.344, 굴절률: 1.333. 
	참고: DNA-마그네틱 입자 상호 작용의 속도 직접 복제의 측정을 적용 됩니다. 악기에 의해 단일 측정 60-70 s를 걸립니다. 여기, 악기 1 분 10 측정 지연 간격을 지시 했다. 편의상, 결과 표시 됩니다 시간 = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 분 첫 번째 독서에서.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 제타 잠재적인 통해 자기 입자를 DNA 바인딩 설명 하는 이론적 원리 질문에서 했다. 프로토콜 합성 및 자성 나노 입자와 미의 수정에 설명합니다. DNA 제어 및 바인딩 솔루션의 준비를 위한 방법 또한 설명 합니다. 여기에 표시 된 두 가지는 DNA 입자 상호 작용의 심사에 대 한: 양이 많은 PCR 그리고 DL 접근. DL의 입자의 물리 화학적 변화 세 가지 지표를 제공 합니다: 입자 크기, 증가할...

DNA 분리 분자 생물학에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 핵 산 추출 방법의 개발 유전체학, metagenomics, epigenetics, 및 transcriptomics의 신흥 분야에 큰 영향을가지고. DNA 분리 등 의료 (법의학/진단 도구와 전조 생체), 바이오 응용 프로그램 및 환경 응용 프로그램 (metagenomic 생물 다양성, 병원 체, 정도와 감시)의 넓은 범위가 있다. 정화 하 고 다른 비늘 같은 혈액, 소변, 토양, 나무, 그리고 샘플의 다른 종류와 다른 자료에서 DNA를 분리 하는 수요 증가 되었습니다. 1 , 2 , 3 , 4
나노 및 마이크로 크기의 입자는 DNA 분리 및 특히 그들의 높은 표면적 때문에 적합 때 그들은 자기장에 의해 움직일 수 있다. 입자 크기, 충전 등의 물리 화학적 특성 크게 대상 생체를 바인딩할 그들의 능력을 좌우할 수 있다. 5 추가 바인딩 생체의 향상 그리고 입자를 안정화, 다른 화학 수정 (표면 코팅) 활용할 수 있습니다. 바인딩에 대 한 많은 다른 전략 공유 및 공유 비 상호 작용에 따라 분류 됩니다. 반면 입자 구성의 금속, 합금 또는 그것의 밀도, 다공성, 고 표면에 영향을 미칠 수 있는 다른 자료에 의해 지 어질 수 있다 6 입자의 크기는 직접 그들의 자화 특성 적용 됩니다. 7 거기 방법은 신뢰할 수 있는 측정 하는 작은 입자의 표면 전 하입니다. 대신, 미 끄 러 짐을 비행기 (나노 표면에서 거리)에 전기 잠재력은 측정할 수 있습니다. 8 이 값 이라고 제타 잠재 하며 그것은 DL 통해 나노-및 microparticle 안정성의 평가 위해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 9 의 값 뿐만 아니라 pH 이온 강도 입자의 표면 특성에 뿐만 아니라 분산 환경에 매우 의존 때문에, 그것은 또한 증명할 수이 표면 사이 상호 작용으로 인 한 변화는 입자 그리고 관심사의 분자입니다. 10
다른 한편으로, 탈수 조건 (A DNA 형태) 전시 압축된 conformations 촉진 하는 그것의 강 수 (집계) 비교 하는 경우에 일반적으로에서 DNA 구조 B DNA 형태로 발생 합니다. 정전기 (이오니아와 H-본드) 그들의 sterically 액세스할 수 인산 인해 다른 자료에 DNA의 바인딩을 제어 하는 주요 세력 그리고 질소 기지 (특히 구 아닌). 7 , 10
이 작품에서 자기 나노 입자와 미의 3 개의 대표적인 화학 수정 분석 (그림 1A). 합성 방법 및 나노 입자와 미의 화학 수정 설명 합니다. 바인딩 솔루션, DNA 강 수 (pH, 이온 강도, 그리고 탈수)의 이론적인 원리에 그 협정 DNA 바인딩 및 차입을 평가 하는 데 사용 됩니다. 정량 PCR는 대표적인 나노 입자와 미 (그림 1B)에서 DNA의 차입 효율성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 입자 크기, 증가할수록 색인, 및 잠재적인 제타는 입자 표면 (그림 1C)에 발생 하는 물리 화학적 변화를 시각화 하는 데 사용 되는 중요 한 매개 변수. 그것은 자성 입자 표면의 화학 특성에 강조 해야 합니다. 이 프로토콜의 범위를 넘어이 단계 동안, 몇 가지 현대 기술은 화학 수정의 효율성 조사에 적용할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14 입자 표면의 적외선 스펙트럼을 평가 하 고 무료로 화학 한정자의 스펙트럼을 비교 하는 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR)을 사용할 수 있습니다. 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 소재 표면 원소 구성 식별 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기술입니다. 다른 전기, 현미경, 분 광 방법 입자 합성의 품질에 빛을 발산 하 게 사용할 수 있습니다. 이 작품 DL 통해 DNA-마그네틱 입자 상호 작용을 분석 하는 새로운 관점을 강조 한다.

<table><tbody><tr><td>Iron(III) chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Tetraethyl orthosilicate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&amp;nbsp;</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Potassium nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td><td>Spectrum labs</td><td>G235063</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Overhead Stirrer</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH.WOS01035</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Magnetic particle synthesis</td></tr><tr><td>BRAND UV cuvette micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cuvette for size measurement</td></tr><tr><td>BRAND cap for UV-cuvette micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Cuvette caps for size measurement</td></tr><tr><td>Folded Capillary Zeta Cell</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>Cuvette for zeta potential measurement</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Device for measurement of size and zeta potential</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO&lt;br/&gt; NanoQuant instrument</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>device for measurement of DNA concentration</td></tr><tr><td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S instrument</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA purification kit</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>DNA binding</td></tr></tbody></table>

dna-magnetic particle binding analysis by dynamic and electrophoretic light scattering

자성 입자를 사용 하 여 DNA의 분리는 생명 공학 및 분자 생물학 연구에 높은 중요성의 필드입니다. 이 프로토콜 통해 동적 산란 (DL) 및 전기 이동 산란 (ELS) 바인딩 DNA-마그네틱 입자의 평가 설명 합니다. DL 분석 입자 크기, 증가할수록, 잠재적인 제타 등 입자의 물리 화학적 특성에 귀중 한 정보를 제공 합니다. 후자의 설명 표면 입자는 DNA와 같은 재료의 정전기 바인딩에 주요 역할을 담당을 합니다. 여기, 비교 분석 3 화학 수정 미, 나노 입자와 DNA 바인딩 및 차입에 대 한 그들의 효과 이용 한다. 화학 수정에 의해 분기 polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate 및 (3-aminopropyl) triethoxysilane 조사. 이후 DNA 음 전 전시, 입자 표면의 제타 전위의 DNA 바인딩 시 줄어 전망 이다. 클러스터의 형성 입자 크기에 영향을 또한 한다. 격리에서 이러한 입자의 효율성과 DNA의 차입을 조사 하기 위하여 입자는 낮은 pH (~ 6), 이온 강도 및 탈수 환경에 DNA와 혼합 됩니다. 입자는 자석에 세척 되 고 다음 DNA는 eluted Tris HCl 버퍼에 의해 (pH = 8). DNA 복사 번호 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 추정 된다. 제타 전위, 입자 크기, 증가할수록 및 PCR 양적 평가 하 고 비교 됩니다. DL는 통찰력과 지원 DNA 격리에 대 한 입자의 심사 과정에 새로운 관점을 추가 하는 분석 방법 이다.

화학 합성 및 자성 입자의 수정에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 6 마그네틱 입자 합성 되었고 DNA 바인딩 분석. 분석 요약 표 1에 표시 됩니다. 바인딩 솔루션과 물에서 입자의 크기를 비교 하 여 그것은 분명 모든 입자 2-22 겹으로 솔루션 바인딩 집계. 어떤 입자는 더 DNA;의 더 많은 주름을 집계 그러나이 되지 직접 상관 DNA 검색 양이 많은 PCR (<stro...

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DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

dna-magnetic-particle-binding-analysis-dynamic-electrophoretic-light

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

12.0K 조회수.  Mendel University in Brno. 이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

Frequency Mixing Magnetic Detection Scanner for Imaging Magnetic Particles in Planar Samples

The setup of a planar Frequency Mixing Magnetic Detection (p-FMMD) scanner for performing Magnetic Particles Imaging (MPI) of flat samples is presented. It consists of two magnetic measurement heads on both sides of the sample mounted on the legs of a u-shaped support. The sample is locally exposed to a magnetic excitation field consisting of two distinct frequencies, a stronger component at about 77 kHz and a weaker field at 61 Hz. The nonlinear magnetization characteristics of superparamagnetic particles give rise to the generation of intermodulation products. A selected sum-frequency component of the high and low frequency magnetic field incident on the magnetically nonlinear particles is recorded by a demodulation electronics. In contrast to a conventional MPI scanner, p-FMMD does not require the application of a strong magnetic field to the whole sample because mixing of the two frequencies occurs locally. Thus, the lateral dimensions of the sample are just limited by the scanning range and the supports. However, the sample height determines the spatial resolution. In the current setup it is limited to 2 mm. As examples, we present two 20 mm &#215; 25 mm p-FMMD images acquired from samples with 1 &#181;m diameter maghemite particles in silanol matrix and with 50 nm magnetite particles in aminosilane matrix. The results show that the novel MPI scanner can be applied for analysis of thin biological samples and for medical diagnostic purposes.

A scanner for imaging magnetic particles in planar samples was developed using the planar frequency mixing magnetic detection technique. The magnetic intermodulation product response from the nonlinear nonhysteretic magnetization of the particles is recorded upon a two-frequency excitation. It can be used to take 2D images of thin biological samples.

평면 샘플에 자석 입자 이미징에 대한 자기 인식 스캐너를 혼합 주파수

The setup of a planar Frequency Mixing Magnetic Detection (p-FMMD) scanner for performing Magnetic Particles Imaging (MPI) of flat samples is presented. ...

공학

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

화학

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

완전히 재구성된 Cdc45/MCM2-7/GIN(CMG)의 모션 이미징

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication forks. Obtaining a deep mechanistic understanding of the dynamics of CMG is critical to elucidating how cells achieve the enormous task of efficiently and accurately replicating their entire genome once per cell cycle. Single-molecule techniques are uniquely suited to quantify the dynamics of CMG due to their unparalleled temporal and spatial resolution. Nevertheless, single-molecule studies of CMG motion have thus far relied on pre-formed CMG purified from cells as a complex, which precludes the study of the steps leading up to its activation. Here, we describe a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed imaging at the single-molecule level of the motion of fluorescently labeled CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 different purified S. cerevisiae polypeptides. This assay relies on the double functionalization of the ends of a linear DNA substrate with two orthogonal attachment moieties, and can be adapted to study similarly complex DNA-processing mechanisms at the single-molecule level.

저자 스포트라이트: Investigating the motion Dynamics of the eukaryotic replisome components at the single-molecule level

We report a hybrid ensemble and single-molecule assay to directly image and quantify the motion of fluorescently labeled, fully reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase on linear DNA molecules held in place in an optical trap.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

요약

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적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

평면 샘플에 자석 입자 이미징에 대한 자기 인식 스캐너를 혼합 주파수

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석