Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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우리가 기꺼이 그녀의 지원에 대 한 3d 인쇄, 금형 디자인, 그들의 입력에 대 한 아만다 조이 Reidinger, 박사, 크리스 Nycz, 그리고 카 렌 레 마인 박사 에리카 스 털 츠 (학술 연구 및 응용 과학자, WPI 정보 기술 서비스)을 인정 캐시 Suqui와 제니퍼만 금형 디자인을 테스트 하는 그들의 도움에 대 한 촬영과 그의 도움에 대 한 마이클 오키프.  이 작품은 NSF IGERT 당선 1144804 (MWR, 있다), NIH R15 HL097332에 의해 지원 되었다 (MWR, TAH), NSF 소장 EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, 있다)와 NIH R15 HL137197 (MWR, 있다).
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1. 3D 인쇄 형 준비 하기
<ol><li>CAD 드로잉의 원하는 크기에 형을 준비 합니다.</li>
	<li>고해상도 3D 프린터에 CAD 파일을 보냅니다. 광택 마무리, 적절 한 플라스틱 인쇄 자료를 선택 합니다.</li>
	<li>인쇄 후 철저 하 게 세제와 물으로 금형 세척.</li>
</ol>2. 주조 PDMS 제외
<ol><li>균형에 기본 PDMS의 원하는 금액을 측정 합니다. 60 m m 금형에 대 한 직경 및 2mm 잘 게시물, 25 g를 사용 하 여.</li>
	<li>1:10 (w/w)에 경화제를 추가 PDMS 베이스에 비율.</li>
	<li>적극적으로 두 개의 구성 요소는 철저 하 게 결합 될 때까지 저 어. 부족 한 혼합 "저속" 표면 결과 PDMS의 불완전 한 치료 될 수 있습니다.</li>
	<li>3D 인쇄 금형, 인쇄 된 우물 위에 PDMS 기본 층의 형성을 활성화의 테두리 실험실 테이프의 조각을 넣으십시오.</li>
	<li>PDMS 혼합물을 금형에 부 어 고 형 될 때까지 모든 거품은 탈 가스 진공 챔버 합니다.</li>
	<li>제거 하려면 2-4 h, 또는 충분히 경화 될 때까지 50 ° C에서 PDMS를 치료.</li>
	<li>랩 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 추출 PDMS 부정.</li>
	<li>금형은 완전히 치료 되도록 (3D 인쇄 형에서 제거) 후 추가 1 시간에 대 한 60 ° C에서 PDMS를 품 어.</li>
	<li>어떤 잔류물을 제거 하는 세제와 물으로 깨끗이 PDMS를 씻어. 부족 한 세척 PDMS 네거티브의 첫 번째 사용에 대 한 불 쌍 한 링 형성 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 조작 Agarose 웰 스
<ol><li>Agarose 웰 스 셀을 뿌리기 전에 1 일 준비.</li>
	<li>DMEM과 압력솥 2% (w/v) agarose 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>피펫으로 4 mL 압력가 PDMS 부정적으로 녹은 agarose. 다음 피펫으로 agarose 직접 PDMS의 게시물에 음화. 거품 잘 차원에서 이질성을 발생할 수 있습니다 피펫으로 팁 모든 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>참고: 금형; 연극 하지 마십시오 agarose의 위쪽 표면 agarose 우물 PDMS에서 제거와 6-잘 문화 접시에 배치 수준 수 있도록 평면, 해야 합니다. 남은 agarose 있을 수 있습니다 다시 압력가 사용 다시, 하지만 한 번 이상 하지.</li>
	<li>agarose 냉각 후 (약 10 분 4 mL agarose;에 대 한 큰 형 이상 냉각 시간을 할 수 있습니다), 신중 하 게 무딘 집게를 사용 하 여 PDMS 원판에서 agarose 웰 스를 분리 하 고 6-잘 접시의 우물으로 전송.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 agarose 우물 잠수함 그리고 하룻밤 사용 하기 37 ° C 배양 기 전에 equilibrate.</li>
</ol>4. 시드 조직 반지
<ol><li>문화 쥐 대동맥 평활 근 세포21 (RaSMCs) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 포함 된 DMEM L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 나트륨 pyruvate, 및 1% 페니실린-스 70% 합류를 도달할 때까지. 참고: 셀 5% CO2 와 15 cm 조직 배양 배지에서 37 ° C 배양 되어야 한다.</li>
	<li>금형 equilibrated 후 (3 절), 시드를 위한 RaSMCs를 준비.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 접시 당 5 mL로 두 번 접시를 헹 구 십시오.</li>
	<li>15 cm 배양 접시 당 3 mL 0.25 %trypsin 추가 합니다. 2-3 분, 또는 때까지 세포가 접시를 낸 37 ° C 배양 기에 격판덮개를 이동 합니다.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 동일한 볼륨 (접시 당 3 mL) 트립 신을 무력화. 철저 하 게 덩어리 헤어 셀 resuspend</li>
	<li>세포 현 탁 액 trypan blue 염료와 1: 1의 약 수를 희석 하 고는 hemocytometer와 셀.</li>
	<li>세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 200 x g에 5 분의 총 볼륨 원심</li>
	<li>ML; 당 10 백만 셀의 농도에서 세포 resuspend 50 µ L 당 500, 000 셀이 됩니다. 참고: 다른 세포 유형을 다른 세포 농도 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose 금형에서 모든 중간 발음 개별 우물에서 모든 매체를 제거 하지만 하지 우물의 바닥 찌를 다는 것을 조심 하십시오.</li>
	<li>피펫으로 50 µ L의 각 음에 서 스 펜 션.</li>
	<li>조심 스럽게 agarose 몰드의 외부 신선한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 하도록 하지 중간 오버플로 agarose의 우물에 주의 해야 합니다. (약 16 h) 하룻밤 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>하룻밤 부 화 후 금형, 외부에서 매체를 발음 하 고 금형과 반지 완전히 빠져들 수 있도록 6 잘 플레이트의 각 음에 4.5 mL 신선한 매체를 추가 합니다. 매일 변경 매체입니다.</li>
</ol>

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	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

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여기 우리 3D 인쇄를 사용 하 여 쉽게 사용자 정의 크기와 자기 조립된 조직 링의 빠른 제작을 위해 다양 한 방법 제시는. 우리의 방법은 비슷합니다 Svoronos 외에 보고. 6 , 벌집 3D 인쇄와 개 뼈 모양의 왁 스 금형 PDMS 원판을 사용 했다. 그러나, 금형 몇 가지 독특한 디자인 기능을 포함 하도록 수정 되었습니다. 노치 (그림 4A(1)) 표시를 개별적으로 모니터링 각 링 수 있도록 금형의 방향을 제공 합니다. 중앙 홀 (그림 4A(2)) 우물에 매체의 확산을 향상 시킬 수 있습니다. CAD 파일 번호 형;에 직접 인쇄 따라서, PDMS 제외 각 버전 번호 표시 됩니다 하 고 직경 (그림 4A3) 게시. 테이퍼 외부 벽 (그림 3(1), 5 °), 잘 골짜기 (그림 3(2), 45 °), 그리고 중앙 구멍 (그림 3(3), 5 °)의 상단에 쉽게 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제외를 제거 하려면 agarose 우물이 쉽게 PDMS 원판에서 제거 하 고 (그림 4A(2), A(4)).
우리는 다양 한 직경 및 기본 인간의 부드러운 근육 세포 (SMCs)18,22, 쥐 대동맥 SMCs7 을 포함 한 세포 종류의 자기 조립된 고리 모양의 조직 조작 하 여이 시스템의 다양성을 증명 하고있다 , 23, 인간 간 엽 줄기 세포 (hMSCs)13, 그리고 SMCs 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)11 (표 1)에서 파생 된. 진행 중인 작업에서 우리는 반지 추가 셀 유형 내 피 세포에서에서 형성 평가 하 고 tracheal 교체에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 다양 한 크기의 연골 고리 융합. 완전히 세포 유래 구조 뿐만 아니라 우리는 또한 사용이 시스템 통합된 복사해올된 젤라틴 스피어13,22와 반지를 조작 하. 스피어 자기 집합 추가 기계적 강도 제공 하기 위해 동안 조직 고리 내에서 통합 될 수 있다 또는 지역화 성장 요인13,22의 배달.
조직 링을 조작 하는 경우 휴대폰 번호의 최적화 다른 세포 유형에 대 한 필요할 수 있습니다. 숫자 다를 수 있습니다 최소 셀 크기와 세포의 종류에 따라. 예를 들어 Ipsc에서 파생 된 hSMCs 600000 셀/링11에 씨를 뿌리고, hMSCs 및 기본 hSMCs 400000 셀/반지13,22, 그리고 쥐 대동맥 SMCs는 500, 000 셀/반지18시드 시드. 물마루 차원 반지 형성 및 셀 링 형성24에 필요한 최소 수 영향을 또한 수 있습니다. 인간의 세포와 3D 인쇄 형 연구, 대 한 여 물통 폭 2 m m의 사용 되었다. 원래 폴 리 카보 네이트 형 750000 hSMCs 2mm 셀 링18를 형성 하는 데 필요한 3.75 m m의 구 유 폭을 했다. 감소 물 폭 46%, 반지25당 400000 셀 링 형성에 필요한 셀의 수를 줄일 수 있었습니다. 셀 링 당 시드의 표 1에 요약 되어 있습니다.
3D 인쇄 소재를 선택할 때 많은 요인 고려 될 필요가 있다. PDMS은 60 ° C에 일반적으로 치료 된다, 때문에 3D 인쇄 자료 충분히 높은 있어야 PDMS 경화 하는 동안 손상을 방지 하려면 온도 용융. 이 연구에 사용 되는 재료의 용융 온도 (독점 소재, 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다. 그러나, 1 시간에 60 ° C에서 구운 우리는 자료는 냄새를 생산 하기 시작 했다 관찰 했다. 따라서, 우리가 하기로 낮은 경화 온도 50 ° C를 위해 3D 인쇄 자료 손상 없이 PDMS를 구워 경화 시간을 증가. 경화 시간 조정 형태 큰 PDMS 네거티브에 금형 수정 하는 경우 필요할 수 있습니다. 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제거 후 60 ° C에서 추가 치료 기간에 노출 되는 3D 인쇄 형 온도 제한 하는 동안 볼품 없는, 나머지에서 부정적인 최종 PDMS를 방지 합니다. 참고 일부 자료 치료 PDMS의 억제, 그래서 선택한 소재 PDMS와 호환 되는지 확인 하십시오. 마지막으로, 금형 소재 독성 또한 고려 되어야 한다. 3D 인쇄 형 세포와 직접 접촉에서 되지 것입니다, 하는 동안 금형에서 일부 잔류물 PDMS 부정적인 치료 절차 동안에 전송 될 수 있습니다 가능 하다. 우리는 매우 철저 한 세척 세제로 부정적인 PDMS에서 어떤 잔류물을 제거 하는 충분 한 발견. 그러나, 우리는 이전 부적절 한 세척 agarose 웰 스 처음에 가난한 반지 형성에 부정적인 PDMS의 몇 가지 사용 지도 관찰. 다른 3D 인쇄 자료에서 PDMS 캐스트를 사용 하 여 세제 포함 하 여 모든 잠재적인 leachates 형 잔류물 제거 충분 한지 확인 하기 위해 추가 조사를 요구할 수 있습니다. 정기적인 테스트 시간이 지남에, 금형을 손상 하 고 반복된 사용 후 잔류물에 있는 증가 일으킬 수 있습니다 난방 사이클 (50 ° C)에 반복 가능한 그것으로 필요할 수도 있습니다. 날짜 하려면, 조직 반지를 성공적으로 생성 하는 데 사용 된 30 개 이상의 PDMS 원판을 생산 하는 단일 3D 인쇄 형을 사용 했습니다.
전반적으로, 3D 인쇄 폴 리 카보 네이트의 가공 보다 agarose 금형의 제작에 대 한 더 큰 다양성을 허용 한다. 그것은 가능 툴, 보다 높은 해상도 제공 하 고 금형 설계 도구를 사용할 수의 크기에 의해 제한 되지 않는다. 큰 사용자 지정 가능 하 고 그 끝이 등 기능 추가 가공 가능 하지 않을 수 있습니다. 이 시스템은 반지6,17이외에 다른 모양 뿐만 아니라, 자기 조립된 조직 조작에 적용할 수 있습니다. 반지 제조 방법을 사용 하 여, 조직 반지 세포 유형 및 tracheal 조직 공학13, 조작된 혈관7, 그리고 모델링 혈관 질환11에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 크기의 다양 한 개발 했습니다.

세포질 자기 집합 조작 설계 조직 혈관에 접근은 비 계 기반 접근 대신. 자기 조립, 비 계 없는 조직 큰 세포 밀도, 향상 된 매트릭스 증 착 및 강도, 그리고 비 계 기반 조직1,2,3,4에 비해 향상 된 생물 학적 기능을 할 수 있습니다. . 그러나, 특정 크기 및 모양 세 비 계 지원의 사용 없이 3D 조직 형성 도전 남아 있습니다. 이 프로세스는 시간과 노동 집약적인5될 수 있지만 몇 가지 방법을 함께 두꺼운 구조를 셀 시트의 레이어 퓨즈. 또는 셀 비 접착제 금형에 시드 수 하 고 허용 spheroids, 반지, 그리고 다른 조직 모양6,,78으로 집계 하.
자기 집합된 조직 반지 필요 적은 셀, 문화 시간을 단축, 그리고 관 보다 더 큰 적은 약 설계 조직, 하지만 여전히 기계적 테스트, 조직학, 검사 하거나 수 수축 및 다른 기능 테스트7 사용 , 9 , 10 , 11. 조직 반지 문화 매개 변수 수가 많은 검사에 이상적입니다 그리고 질병 모델11 로 사용을 위한 잠재력 또는 약12상영을 위한 도구가 그들은 빠르게 조작 및 쉽게 테스트할 수, 때문에. 또한, 반지 혈관 등 기관7,13, 더 복잡 한 조직 구조에 융합 될 수 있다 그리고 반지 spheroids,1415등 다른 모양 보다는 더 완전 하 게 융합 될 수 있습니다.
Agarose는 생체 적합성, 침투성, 및 비 세포 접착 속성 자체 조립된 조직 날조를 위한 금형 소재로 널리 이용 된다. 예를 들어, Norotte 그 외 여러분 agarose 금형 금형 모양 및 필요한 전문된 장비15제한 제어 사용 압출된 봉에서 조작. 황갈색 외 다양 한 모양 (피라미드, 광장)16사용자 지정 히드로 금형을 조작 하는 단위 건축 alginate 방울 입금. 그러나, alginate spheroids (300 μ m)의 큰 직경 낮은 해상도 기능 귀착되는. 낮은 해상도 셀 집계 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 고르지 못한 몰드 표면에 발생할 수 있습니다. 또는, agarose 매끄러운 기능 및 특정 크기6,,717비 접착제 금형을 만드는 폴리머 원판으로 캐스팅 될 수 있습니다.
우리는 이전 사용자 지정 환상 agarose 셀 시드 웰 스 가공 된 폴 리카 보 네이트 몰드7,18에서 PDMS 부정적인 캐스트에서 날조를 위한 시스템을 보고 했다. Agarose는 PDMS 부정으로 부 고7,18설정할 수 있습니다. 셀은 다음 시드 agarose 웰 스, 어디 그들은 자기 조립 하는 형태로 집계에 24 h7,18미만에서 비 계 없는 조직 반지. PDMS 원판 멸, 여러 번 다시 사용할 수 있으며 부드럽고 유연 하 고, 쉽게 응고 agarose 웰 스를 제거 하는. 때이 시스템 처음에 알려졌다 Gwyther 외. 7, PDMS 원판에서 캐스팅 됐다 가공 된 폴 리 카보 네이트 형 (그림 1A). Agarose 주조, 후 셀 시드 웰 스 개별적으로 잘라 되었고 12-잘 접시7,18의 우물에 배치. 단일 agarose 몰드 5 고리를 생성 하 고 개별 웰 스를 잘라 필요가 없습니다 및 PDMS와 각 반지 (그림 1B)를 생산 하는 데 필요한 agarose의 양을 줄이는 6 잘 플레이트의 잘에서 맞는 그런 디자인 더 최근에 바뀌었습니다. 작은 셀 구 유 폭 시드 고리 형성을 달성 하는 데 필요한 시드 셀의 수를 줄이기 위해 사용 되었다. 이러한 변화에도 불구 하 고 해상도 금형의 사용자 지정에 사용할 수 있는 표준 엔드밀, 제한 했다 그리고 micromilling는 엄청나게 비쌀 수 있다. 또한, 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 가공 하는 시간이 소요 될 수 있습니다 및 성가신에 시간을 예약 하는 필요 때문에 무 겁 게 사용자 지정 장비, 컴퓨터 지원 설계 (변환 하는 추가 컴퓨터 지원 제조 (CAM) 소프트웨어 활용 프로그래밍 도구 경로 및 가공 중 폴 리카 보 네이트 부품의 안정적인 없애거나 CAD) 파일입니다.
현재 연구에서 우리는 CNC 가공 하는 대신 3D 인쇄를 사용 하 여를 검사합니다. 3D 인쇄 엔지니어링 사용자 지정 임 플 란 트, 비 계 자료를 날조 한 세포와 조직 spheroids15,,1920의 직접 인쇄에 널리 사용 됩니다. 고해상도 3D 프린터를 사용 하는 우리 고 전문된 3D 인쇄 소재는 매끄러운을 가진 엄밀한 형 인쇄 수, 광택 표면 마무리 ( 재료의 표참조). 우리의 기술 주조 PDMS 네거티브와 agarose 우물에 사용할 수 있는 고도로 사용자 정의 고해상도 플라스틱 금형의 제작에 대 한 수 있습니다. 디자인 반복 그림 1에서 요약 된다. 금형 설계 추가 3D 인쇄 형에서 모두 PDMS 원판 및 PDMS 원판에서 agarose 웰 스의 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼 외부 벽과 중앙 구멍을 포함 하도록 3D 인쇄 형 버전에서 수정 되었습니다. 이 테이퍼 기능 표준 프로세스 가공으로 얻을 수 없다. 금형의 하단에는 우물의 바닥에서 거리는 두꺼운 agarose 게시물 agarose 잘 제거 하는 동안 침입의 위험을 줄이기 위해 게시물 아래의 기본 인이 반복에서 증가 되었다. 형과 링 제조 절차 개요로 그림 2에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td><td>Provided by T. Wight [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

엔지니어링된 조직 조직 수리 및 교체, 임상적으로 사용 되 고 마약 검사 및 인간 질병 모델링 도구도 개발 되 고 있다. 자기 집합된 조직 향상 된 매트릭스 증 착, 강도, 기능 등 비 계 기반 조직 공학에 이점을 제공합니다. 그러나, 3 차원 조직 세포 또는 지원 비 계 시드 없이 날조를 위한 몇 가지 사용할 수 있는 방법이 있다. 이전에, 우리는 비 접착제 agarose 우물으로 셀 시드 여 자기 조립된 조직 반지를 날조를 위한 시스템을 개발. 음수입니다 (PDMS) 처음 가공된 폴 리카 보 네이트 몰드, 캐스팅 그리고 agarose는 gelled 고리 모양의 셀 시드 웰 스를 만드는 부정적인 PDMS에. 그러나,이 접근의 다양성은 폴 리카 보 네이트 몰드 가공에 사용할 수 있는 도구의 해상도 의해 제한 되었다. 여기, PDMS 원판 날조를 위한 3D 인쇄 플라스틱 가공된 폴 리 카보 네이트 하는 대신 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 3D 인쇄 형과 개정된 형 디자인은 사용 하 여 간단 하 게, 생산, 저렴 하며 훨씬 더 적은 agarose 및 PDMS 잘 시드 셀 당. 우리가 시연 결과 agarose 웰 스 다른 세포 유형의 다양 한 사용자 지정 된 직경 자기 집합된 조직 반지를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 링 기계, 기능, 및 조직학 분석을 위해 또는 더 크고 복잡 한 관 조직 조작에 대 한 사용할 수 있습니다.

이 시스템은 간단 하 고, 고리 모양의 3D 자기 집합의 셀 수 있도록 agarose 셀 시드 웰 스의 사용자 정의 제조 설계 조직 허용 합니다. 3D 인쇄 보다 크기는 사용 가능한 도구 크기에 의해 제한는 폴 리카 보 네이트 가공 금형 설계에 더 나은 해상도 더 큰 유연성을 허용 한다. 고해상도 3D 프린터 0.254 m m로 얇은 벽은 인쇄 될 수 있다와 여 물통 크기 (15.2 µ m 해상도 이러한 연구에 대 한) 프린터의 해상도 의해서만 제한 됩니다. 일반적으로, CNC 엔드밀 미만 0.3 m m 그래서 되지 않습니다 상용, 작은 폭의 골짜기를 만들 수는 없습니다. 마이크로 밀링 작은 기능을 생성할 수 있다, 장비 필요 하지만 엄청나게 비싼 또는 많은 생물 의학 연구 실험실에 액세스할 수 있을 수 있습니다. 여 물 크기와 곡률도 엔드밀 팁 모양에 의해 제한 됩니다. 또한, 기능 같은 각도 또는 테이퍼 벽은 가능, 고 작은 기능 가공 과정에서 휴식 수 있습니다.
CAD 드로잉 금형 3D 인쇄 및 사용자 정의 크기의 PDMS 원판을 생산 하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 그림 3 에서는 우리의 현재 2mm 게시물 3D 인쇄 형의, 이전 디자인 반복에 비해 크기를 설명 합니다. 과정은 비싼; 2 mm, 5-링 3D 인쇄 형 3d 인쇄, 44.67 달러 비용과 각 부분 여러 PDMS 네거티브를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 우리는 단일 3D 인쇄 형에서 30 개 이상의 PDMS 원판 만들었습니다. 각 부정적인 g (PDMS 부정적인 당 2.75 달러) 당 0.11 USD에서 PDMS의 25 g을 필요합니다. 각 PDMS 부정적인 압력가 마로 소독, 세제로 청소 하 고 다시 사용의 주파수에 따라 몇 년까지 사용 수 있습니다. 원래 디자인18에 비해 소형 3D 인쇄 형 사용 하 여 상당히 적은 PDMS 2mm 조직 반지 (그림 1E) 당 agarose.
셀 집계 미만의 24 h. 반지 치수 agarose 우물의 크기에 따라 달라 집니다 양식 조직 반지 equilibrated agarose 스에서 시드. 여기, 우리는 자기 조립된 쥐 평활 근 셀 링 2, 4, 또는 12 mm 직경 게시물 (그림 4)와 웰 스에서 날조 될 수 있다 설명 했다. 이 연구에서 반지만 3 일에 대 한 교양 했다, 우리는 이전 최대 2 주22, hSMC 반지를 경작 및 hMSC-연골 링으로 최대 3 주13. 이전에 보고 된, 반지 수 작동 3D 생체 외에서 조직에 대 한 양적 평가 대 한 인간의 조직 기능11 및 기계적 강도13,22, 모델과 모듈 건물 단위를로 봉사 할 수도 튜브 모양의 조직 구조7,13을 생성 합니다. 시드 조건 셀 고이 셀 형식에서 설계 조직 반지의 기능 특성 표 1에 요약 되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> 그림 1: 폴 리카 보 네이트 몰드 디자인. 처음에, 15 잘 금형 폴 리 카보 네이트 (A)에서 가공 했다. 이후 버전 6 잘 플레이트의 한 잘 내 단일 폴 리 카보 네이트 형에 맞게 설계 된 5 웰 스와 더 컴팩트한 디자인 (B)를 선보였습니다. 여기, 우리는 가공된 폴 리 카보 네이트 (C)에 더 많은 사용자 정의 대신 3D 인쇄 플라스틱을 사용 하 여이 디자인을 수정. (D) 표시는 agarose 웰 스는 초기에서 조작 디자인18 (왼쪽) (오른쪽), 현재 소형 디자인에 비해 훨씬 적은 agarose를 요구 하 고 우물의 수동 분리를 필요 하지 않습니다. PDMS의 agarose 각 디자인 반복에 필요한 수량 (E)에 표시 됩니다. 센터 포스트는 직경에서 2 밀리미터. (A) 형 6 cm x 12 cm, (B)는 5 cm 직경, 그리고 (C)는 6 cm 직경입니다. 눈금 막대 (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> 그림 2: 자기 집합된 조직 반지의 제작. 3D 인쇄 형 agarose 웰 스 (A)를 캐스팅 하는 데 사용 되는 PDMS 부정, 캐스팅 하는 데 사용 됩니다. 셀은 다음 agarose 웰 스, 그들은 양식 조직 반지 (B)에 24 시간 미만에 집계에 직접 시드. (B)에서 파선 잘 개요를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> 그림 3: 3D 인쇄 형 CAD 드로잉의 횡단면 뷰. 구 유 폭 (A), 여 물 높이 (B), 센터 구멍 (C), 총 직경 (D), 외부 립 (E), 그리고 외부 벽 높이 (F)에 대 한 치수 표시 됩니다. 외부 벽 (1), 웰 스 (2), 및 센터 구멍 (3)의 상단 부분 (2 대 1, 3, 45 ° 5 ° 각도)에서 PDMS 부정적인 제거의 용이성을 개선 하기 위해 테이퍼 됩니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> 그림 4: 해당 PDMS 원판으로 CAD 도면 및 자기 조립된 SMC 반지 2 (A), 4 (B)와 (C) 12mm 직경 게시. (A), (1) 오리 엔 테이 션을 제공 하기 위한 노치를 나타냅니다, (2) 나타냅니다 관류를 개선 하기 위해 중앙 구멍, (3) PDMS 원판에 직접 인쇄물, 파일 번호 이며 (4)는 외부 벽, PDMS 부정적인 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼입니다. Agarose 스에서 바 규모 = 1 cm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>셀 유형</td>
			<td>셀 링 당 시드</td>
			<td>링 직경</td>
			<td>문화 기간</td>
			<td>기능 분석 수행</td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐 SMC</td>
			<td>0.5, 1 또는 3 x 106
</td>
			<td>2, 4, 또는 12 mm</td>
			<td>3 일</td>
			<td>현재 연구; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC 파생 SMC 11
</td>
			<td>0.6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 일</td>
			<td>수축 테스트, 단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간의 SMC 22
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 일 또는 14 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간 MSC 14
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석, 반지 퓨전 및 튜브 압축 테스트, 연골 조직으로 차별화</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 셀 번호 다른 세포 유형에서 반지 제작에 필요한.

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Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

fabrication-custom-agarose-wells-for-cell-seeding-tissue-ring-self

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. 이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

연구

생체공학

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

면역학 및 감염병학

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

생화학

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

요약

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이 비디오의 챕터

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)