Name: preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
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이 작품은 NIH CA109821 (TCC)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 베크 Coulter 아낌없이 간행물 비용을 충당 하기 위해 자금을 제공 하 고 설정 및 elutriation 시스템의 운영 기술 지원. 우리는 제공 하는 초기 기본 모든 문화에 대 한 박사 프레드 Falkenburg 감사 합니다.

참고:이 프로토콜 기본 B-모든 세포 직경 약 8 µ m (G1 단계)에서 13 µ m (G2/M 단계)에서 범위에 대 한 최적화 되었습니다. 따라서, 특정 원심 분리기 속도 펌프 유량 수 없습니다 다른 크기 범위에 있는 셀에 적용. 그럼에도 불구 하 고, 적절 한 elutriation 매개 변수 침전 비율 방정식을 사용 하 여 추정 될 수 있습니다. 셀 설명된 16 10 6 셀/mL x 1-3의 최적의 밀도 정의 된 혈 청 자유로운 매체에 교양. 분수의 얼음 냉각 튜브를 사용 하 여 4 ° C에서 실시 하는 컬렉션, 제외한 모든 단계 실내 온도 및 24의 최대 20 ° C에서 원심 분리기에서 실시 하는 ° C.
 1. Elutriation 버퍼의 준비 및 자료 <ol><li>세포의 응집을 감소, 행 크의 elutriation 버퍼를 준비 하기 위해 &#39; s 균형 소금물 (HBSS) 페 놀 레드 2% 소 태아 혈 청 (보충 FBS), elutriation 프로세스, 부정 청구 셀 외관을 렌더링 하 고 응집 감소 2-naphthol-6,8-disulfonic 산 dipotassium 소금 (NDA)의 1.6 g/L 중 기계적 스트레스 로부터 세포를 보호 하.
	<ol><li>NDA의 1.6 g을 50 mL 원뿔 튜브 추가할.</li>
		<li>살 균 조건 추가 HBSS의 35 mL 1 L 병에서 NDA를 포함 50 mL 원뿔 튜브. 튜브는 NDA 해산 했다 때까지 소용돌이.</li>
		<li>새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 녹아 NDA를 전송 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. HBSS 나머지 1 리터에 기밀 엄수 계약서 추가.</li>
		<li>마지막으로 2% (v/v)의 최종 농도를 HBSS 21 mL FBS 추가. 
		참고: elutriation 버퍼 수 준비 되며 만료 날짜는 HBSS 또는 지시자 염료의 황으로 pH에 큰 변화가 있을 때까지 때까지 4 ° C에 저장.</li>
	</ol></li> <li>표시 튜브 1과 2 (W1, W2) 분수 1-20 (F1 ~ F20), 세척 하 고 중지 되도록 50 mL 원뿔 튜브 분수의 컬렉션에 대 한 라벨.
	<ol><li>분수를 수집 하기 전에 미리 얼음이이 튜브를 진정.</li>
	</ol></li></ol> 2. Elutriation 시스템의 조립 <ol><li>첫째, 스트로보 어셈블리는 원심 분리기에 있도록 설치 전원 코드 왼쪽에 있는 포트를 통해 상공에서 먹이. 원심 분리기를 닫을 때 그것은 보기 창 줄 것입니다 그래서 스트로브 플래시 램프는 챔버의 앞에 인지 확인 합니다.
	<ol><li>먼저 각 브라켓의 상단에 두 개의 구멍에 두 개의 십자 머리 나사를 강화 하 고 다음으로 각 브래킷의 하단에 나사를 강화 하 여 장소에 어셈블리 보안.</li>
		<li>스트로브 전원 포트는 원심 분리기의 뒷면에 전원 코드를 꽂습니다.</li>
	</ol></li> <li>다음, 원심 분리기 드라이브 허브에 곧장 회전자를 설정 하 고 T-핸들 육각 렌치로 고정. 
	참고: 경우에 원심 분리기 비 elutriation 목적을 위해 필요 하지 않습니다, 스트로보 어셈블리와 회전자 지켜질 수 있다 실행 사이의 원심 분리기에.</li>
	<li>회전자 확보 되 면 인감 어셈블리와 장착 플레이트를 회전로 터에 elutriation 챔버, 카운터 밸런스, 포함 된 빠른 릴리스 어셈블리를 놓습니다.
	<ol><li>밀어 균등 하 게 한 손으로 elutriation 챔버와 카운터 밸런스에 다른 한편에는 터 볼트 장착 플레이트에 구멍에 스냅 될 때까지.</li>
		<li>는 마지막으로, 회전 씰 어셈블리에 있는 구멍에 케이블의 1 개의 측에 핀을 배치 하 고 왼쪽 o에 브라켓 십자 머리 나사 (2.1.1에 언급 된) 중 하나 케이블의 다른 쪽에 eyehole를 확보 하 여 고정 케이블을 연결 f 챔버.</li>
	</ol></li> <li>다음, 가변 속도 펌프를 사용 하 여 흐름 시스템을 조립 하 고는 elutriation에 펌프 버퍼 튜브 챔버 elutriation 챔버의 흐름으로 버퍼를 수집.
	<ol><li>삽입 크기 16 입력된 튜브 상단에 포트를 통해 변속 펌프에서 오는 왼쪽 원심 분리기 약 실 챔버에 들어가 있도록.</li>
		<li>입력된 튜브의 무료 끝에 피팅을 부착 하 고 회전 씰 어셈블리 측면 입력된 구멍에 피팅을 삽입.</li>
		<li>삽입 크기 16 출력 포트를 통해 튜브와 회전의 상단에 전송 관에 봉인 어셈블리. 
		참고: 흐름 시스템 또한 남아 있을 수 있습니다 elutriation 실행 사이의 조립.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로,는 원심 분리기를 설정 하 고 실험에 필요한 사양 설정.
	<ol><li>변경 회전자 id입니다.</li>
		<li>는 원심 분리기 시간 입력 하는 경우, 설정 된 elutriation 실행을 완료 하는 데 충분 한 더 보다는 2 h.</li>
		<li>설정 온도 20 ° c 24의 최대 온도 ° c.</li>
		<li>맥스 가속과 감속을 위해 느리게 설정.</li>
		<li>마지막으로, 867 x g.를 속도 설정</li>
	</ol></li></ol> 3. Elutriation 시스템의 못쓰게 <ol><li>elutriation 시스템 소독, 5% 표 백제를 포함 하는 500 mL 플라스틱 병에 저수지 튜브를 놓고 출력 튜브는 빈 1 L 플라스틱 폐기물 병에 배치 하려면 먼저.
	<ol><li>펌프를 켜고 25 mL/min로 속도 설정 하 고 5% 표 백제 폐기물 병으로 출력 튜브 펌핑은 때까지 줄곧 elutriation 시스템을 통해 흐름을 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 켜고 거품 및 배 압 순서 속도 (867 x g)를 지정 하는 최대와 서 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 중지합니다. 로 터 회전 중지, 일단 뚜껑 열고 어떤 누출에 대 한 챔버 검사.</li>
		<li>아무 누출 경우 게 표 백제 솔루션 최소한 5 분에 대 한 시스템을 통해 흐름</li>
	</ol></li> <li>로 표 백제는 수는 세포의 응집으로 이어질 뿐 아니라 세포에 해를 입힐 elutriation 버퍼에서 침전의 형성으로 이어질 수 있습니다 다음, 압력가 마로 소독 물 시스템을 플러시.
	<ol><li>장소 압력가 마로 소독의 1 리터 병으로 저수지 튜브 물 하 고를 통해 적어도 10 분에 대 한</li>
	</ol></li> <li>물으로 홍 조, 후 elutriation 버퍼 시스템에 도입. Elutriation 버퍼 및 셀에 대 한 저수지를 만들 압력가 되었습니다 150 mL 유리병을 사용 합니다.
	<ol><li>Elutriation 버퍼의 100 mL 병에 추가 하 고 튜브 맨 아래에 되도록 유리 병 저수지 튜브 이동.</li>
		<li>는 원심 분리기를 시작 하 고 물 밖으로 플러시 시스템을 통해 흐름에 버퍼가.</li>
		<li>저수지 병 거의 비어 일단 물 시스템에서 완전히 붉 어 지는 출력 튜브 폐기물 병에서 저수지에는 버퍼 시스템을 통해 재활용 되 고 있도록 이동.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로 조정 보기 창을 elutriation 챔버 현재 속도로 볼 수 있습니다.
	<ol><li>보도 스트로보 램프 램프 켜 하는 원심 분리기의 외부에 버튼 전원. Elutriation k를 설정노브를 왼쪽 원심 분리기의 외부에도.</li>
		<li>천천히 보기 창을 통해 보고 차례 elutriation 챔버 보기 및 스트로브 빛에 올 때까지 오른쪽 노브는로 터의 회전 시간. 
		참고: elutriation 시스템 남아 있을 수 있습니다이 상태에서 셀 준비 될 때까지.</li>
	</ol></li></ol> 4. 셀 샘플의 준비 <ol><li>수 전지와 여러 50 mL 원뿔 튜브에 aliquot 300 400 백만 성장 매체. 3 분 위한 1210 x g에서 셀 아래로 회전</li>
	<li>25 ml를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 elutriation 버퍼의 성장 매체 및 resuspend 세포 aspirate.</li>
	<li>줄이기 위해 세포 응집, 패스는 25 통해 두 번 셀 게이지 바늘.
	<ol><li>10 mL 주사기를 사용 하 여 셀을 그릴 25 게이지 바늘을 연결 하 고 내부에는 셀을 통과 살 균 50 mL 원뿔 튜브의 벽. 이 모든 25 mL 바늘 통과 될 때까지 반복.</li>
		<li>새 바늘과 주사기를 한 번 위의 과정을 반복. 
		주의: 주사기 바늘은 sharps 용기에 배치 되어야 합니다. 
		참고:이 중요 그 셀 올려집니다 바늘을 통해 elutriation 시스템에 그들을 소개 하기 전에 즉시 세포 응집을 최소한 유지.</li>
	</ol></li></ol> 5. Elutriation 시스템 및 분수의 컬렉션에 셀 샘플의 소개 <ol><li>소개 통해 재활용 나머지 elutriation 버퍼는 저수지 탱크에 셀 샘플을 붓는 의해 elutriation 시스템으로 셀 샘플 .
	<ol><li>셀 시스템에 입력 하 고 elutriation 챔버 내에서 평형에 도달 하자. 
		참고:이 과정은 약 5 분 소요 됩니다 그리고 그들이 보기 창을 통해 챔버를 입력으로 셀을 보면서 진행을 추적할 수 있습니다. 모든 셀에에서 있도록 챔버, 걸릴 드롭 eluent의 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 볼. 이 챔버에 그들의 보존을 확인 하는 샘플 그대로 셀의 무료 이면.</li>
	</ol></li> <li>일단 모든 셀 챔버에 입력 한 있는 셀 균형 있는 챔버의 가장 넓은 부분에 뚜렷한 경계가 분수를 수집 하기 시작.
	<ol>출력 관 50 mL 원뿔 관으로 이동 하 여 <li>시작 레이블이 W1. 이 분수, 저수지 탱크에 고 elutriation 버퍼 필요한 경우 보충를 위한 elutriation 버퍼의 50 mL 수집. 
		참고: 모든 셀 시스템에 입력 했습니다 있는지 확인 하기 위해 저수지 탱크를 처음으로 저수지를 채우는 전에 거의 빈 될 수 있습니다. 첫 번째 리필 후 그것 거의 비어 될 저수지에 대 한 기다릴 필요가 되지 않습니다. 또한, 하지 마십시오 있도록 허용 될 빈이 시스템에 거품과 백 프레셔를 만들 것입니다 탱크.</li>
		<li>일단 50 mL가 w 1에 대 한 수집, 동시에 821 x g 속도 변경 표시 W2 원뿔 튜브에 출력 관 고 이동 50 mL이이 속도에서 더 많은 수집.</li>
		<li>계속 속도 변경 하 고 표 1에 표시 된 대로 분수를 수집 합니다. 저수지에서 미디어 탱크와 모든 시간에 얼음에 원뿔 관을 유지 있는지 확인 합니다. 마지막으로, 천천히 속도 감소로 오른쪽 노브를 설정 하 여 보기 창 조정.</li>
		<li>일단 모든 20 분수 수집 되어, 있는 원심 분리기를 중지 및 정지를 표시 하는 원뿔 튜브에 50 mL 수집.</li>
	</ol></li></ol> 6. Elutriation 시스템의 플러싱 <ol><li>는 원심 분리기 멈춘 후 완전히 플러시 시스템 저수지 튜브 압력가 물과 폐기물 병에서 다시 출력 관의 1 리터 병에 넣어.
	<ol><li>50 mL/min까지 펌프 속도 설정 하 고 있도록 그것 고갈 될 때까지 시스템을 통해 실행 물.</li>
	</ol></li> <li>설정 펌프, 빠른 릴리스 어셈블리에서 입력 및 출력 호스를 제거 하 고 고정 케이블에서 핀을 꺼내.
	<li>제거로 터에서 빠른 릴리스 어셈블리 <ol>. 
		참고: 무엇는 원심 분리기 사용 됩니다, 따라서 elutriation 시스템 수 지금 남아 있을 이다. 그렇지 않으면, 전체 어셈블리 수 내려올 반대 순서에 따라 위에서 설명한 대로. Elutriation 챔버 빠른 릴리스 어셈블리에서 제거 하 고 초음파 물 목욕을 사용 하 여 실행 사이의 청소 수 있습니다. 이 이후 실행에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 챔버 벽에서 파편과 오염 물질을 제거.</li>
	</ol></li></ol> 7. 분수와 G1 또는 G2/M 풀의 컬렉션의 분석.
 참고: elutriation의 효과 설명 하기 위하여 각 분수 세포 수, 세포 직경, 및 DNA 콘텐츠 분석 및 풀 셀에 만들어집니다 immunoblot 분석에 대 한 G1 또는 G2/M 단계에 설명 된 대로 대표 결과입니다. 이 프로토콜 섹션 이러한 풀을 만들 및 실험적인 사용을 위해 그들을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
<ol><li>2000 x g 4 ° C와 elutriation 버퍼에서 aspirate에서 5 분 동안에 각 분수를 스핀.</li>
	<li>G 1 단계 풀와 G2/M 단계 풀을 얻기 위하여 함께 결합 분수.
	<ol><li>G 1에 대 한 수영장 단계, 총 1 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 및 15 mL 원뿔 튜브에 661 x g (f 1-f 5) 788 x g의 속도 범위에서 수집 된 분수를 resuspend. G2/M 단계 풀 resuspend g x 333 x g (F17-F20) 387의 속도 범위에서 수집 된 분수.</li>
		<li>2000 x g 4 ° C와 PBS에서 aspirate에서 5 분에 셀 아래로 회전.</li>
	</ol></li> <li>셀 성장 매체의 10 mL에 resuspend 하 고 세포 수.</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 얼룩 통해 콘텐츠 dna 분석 각 풀에서 한 약 수를 받아 고 cytometric 분석 15. 
	참고: 각 풀의 나머지는 추가 실험을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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Anisha Kothari 전지와 세인트 주드 어린이 연구 병원 분자 생물학의 부에 현재 있다.

우리 CCE를 사용 하 여 세포 주기의 다른 단계에 기본을 얻기위한 방법 모든 셀을 설명 했습니다. 최적의 조건에서 셀 g 1 단계에의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구 쉽게 얻어질 수 우수한 수율, 그리고 셀 S 단계에서 매우 풍성 하 게 얻어질 수 있다 또한 원하는 경우. 여기에 제시 된 결과 독립적인 문화, 모든-215주 모든 문화 (특히, 모든-5), 그?...

배양된 세포는 일반적으로 비동기적으로 성장 하 고 개별 세포는 세포 주기의 다른 단계에 존재. 일부 생물 자연스럽 게 동기 세포 주기 전시 또는 특정 생리 적인 자극에 의해 동기화 할 수 있습니다. 예를 들면 점액 형 Physarum polycephalum 의 거 대 한 plasmodia 내 핵 매우 동기 패션1와 Desmodesmus quadricauda 는 빛과 어둠을 번갈아 하 여 동기화 할 수 있습니다 녹색 조류의 세포 분 기간2. 이러한 생물 독특한 실험 특성을 제공, 그들은 부적당 하 게 포유류 세포의 복잡 한 모델. 포유류 세포 인구를 인위적으로 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해 및 세포 주기 검문소의 분자 기준 발전 중심 되었습니다. 일반적인 방법에는 혈 청 부족, 화학 블록 및 릴리스 또는 물리적 특성3,4악용 포함 됩니다. 혈 청의 철수 자주 세포 정지, 입력 하 고 g 1 단계5에 세포 주기 재입국을 촉진 하는 혈 청의 다시 추가 합니다. 화학 억제제 초과 티 미 딘 또는 G1/S 경계에서 세포를 차단 hydroxyurea microtubule 억제제는 일반적으로 M 단계3,4에 셀을 체포 대리인을 포함 합니다. Mitotic 쉐이크-오프 이후 그들은 덜 interphase 셀6보다 부착에 mitotic 세포에 대 한 풍부 하 게 사용할 수 있는 물리적 특성을 악용 하는 방법이 포함 합니다. 그러나, 이러한 모든 기술 잠재적인 단점이 있다. 예를 들어 모든 셀 형식 mitotic 억제제와 사전 동기화 없이 제한 mitotic 쉐이크-오프 후 혈 청 또는 화학 억제제의 존재의 부재와 셀의 수익률에서 생존을 유지 합니다.
어디 셀 점차적으로 감소 크기에 그들은7분할 초기 배아 세포 주기를 제외 하 고 대부분의 세포 주기를 통해 발전 성장 단계를 받아야 더 큰 되 고. 이 속성은 특히 원심 elutriation (CCE) 크기에 서로 다른 세포를 분리 하는 데 사용할 수 있으며 따라서 세포 주기에서8,9단계 기법에 악용 됩니다. CCE, 동안 세포는 2 개의 반대 세력의 영향 아래: 회전의 축에서 셀 드라이브, 원심력과 유체 속도 (특히), 회전 (그림 1)의 축으로 셀 드라이브. Elutriation 챔버에 셀이이 힘 같은지는 평형 위치에 도달 합니다. 평형 위치를 지시 하는 핵심 요소는 셀 직경 및 밀도 있습니다. 버퍼 솔루션의 속도 증가 흐름으로 원심력을 능가 하는 특히 끌기 힘, 새로운 균형을 설립, 챔버 내부 셀의 위치에 변화를 일으키는. 모든 세포는 특히 속도 충분히 증가 하 여 그들의 출구를 홍보를 때까지 더 큰 셀 챔버 내에 유지 하는 반면 먼저 챔버를 떠나 작은 것 들의 결과로 챔버 출구 쪽으로 이동 했다. 특히 속도 연속 증가와 elutriation 챔버 탈출 셀 특정 분수에 수집 될 수 있습니다 고 각 분수 순차적으로 증가 하는 크기의 셀을 포함 합니다. 특히 속도 증분 증가와 elutriation 실시, 대신 원심 분리 속도 감소 하 여 원심력에 순차 감소 동일한 결과 달성할 것 이다. Elutriation 과정 세포 유형과 elutriation 버퍼, 사용 하는 특정 장치에 따라 최적화를 있어야 합니다. 이러한 조건에서 셀의 침전 속도 최고의 Stokes 법칙에 의해 설명: SV = [d2(ρp-ρm) / 18η].ω2r, 어디 SV = 침전 속도; d =; 입자의 직경 Ρp =; 입자의 밀도 Ρm = 버퍼;의 밀도 Η =; 버퍼의 점성 Ω; 회전자의 각 속도 = 그리고 r = 입자의 방사형 위치. 따라서, SV는 셀 직경 및 밀도에 비례 하 고 직경 두 번째 전력 발생, 이후 그것은 일반적으로 세포 주기를 통해 상수는 밀도 보다 더 크게 기여.
CCE의 중요 한 장점은 셀 화학 치료 또는 영양 부족의 가혹한 조건에 적용 되지 않습니다 우수한 수익률 본질적으로 교란된에 복구할 수 있습니다. 요구는 문제의 세포 직경, 적어도 30%의 상당한 증가 받게 세포 주기 통과. 주요 단점은 특수 원심 분리기, 회전자, 및 액세서리의 비용입니다. 그럼에도 불구 하 고, 셀 CCE에 의해 특정 세포 주기 단계에서 풍성 하 게 준비 하는 능력은 크게 포유류 세포9,10에서 효 모 유기 체에서 세포 주기 연구를 촉진 했다. 또한, 최근 발전 암 조직, 이질적인 혼합물에서 특정 종류의 세포 immunotherapy9에 대 한 생산을 다른 세포 유형의 분리 대 건강 한에서 세포의 분리에 사용을 확산 되고있다.
우리의 주요 관심 vinca 알 카 로이드, taxanes 등 에이전트 (Mta)를 대상으로 하는 microtubule의 행동의 메커니즘을 이해 하고있다. 이 약은 유사 분열, 스핀 들 microtubule 함수11,12, 차단에 독점적으로 행동 생각 했다 하지만 최근 증거 그들은 또한 interphase microtubules13,14을 대상 수 있습니다 나왔다. 우리는 최근 주 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) 셀 받 다 죽음에 g 1 단계 또는 m에서 vincristine, 세포 주기 의존적인 방식으로15에서 다른 Mta로 치료 하면 단계를 했다. CCE에 의해 다른 세포 주기 단계에 모든 세포를 분리 하는 기능은이 결론에 도달에서 쓸모 있었다. 이 문서에서는, 우리는 기술적인 세부 사항을 설명 하 고 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본 준비에 CCE의 응용 프로그램에 대 한 실용적인 팁을 제공.

<table><tbody><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L bottle</td></tr><tr><td>Fetal Plus bovine serum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL bottle</td></tr><tr><td>2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g powder</td></tr><tr><td>50 mL concial tubes</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/case</td></tr><tr><td>PES Membrane 0.22 &amp;micro;m filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>centrifuge compatible with elutriation system</td></tr><tr><td>JE 5.0 elutriator rotor kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td></tr><tr><td>Chamber, standard, 4-mL, &quot;A&quot;</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>standard elutriation chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td>sterile, single-use needles</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>sterile, single-use syringes</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase staining buffer</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>propidium iodide/RNase staining buffer</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

셀을 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해를 발전의 중심이 되었습니다. 일반적인 기술이 포함 혈 부족; 화학 물질 세포에서 다른 세포 주기 단계; 체포 또는 mitotic 쉐이크-오프는 그들의 감소 된 준수 악용의 사용. 그러나, 이러한 모든 단점이 있다. 예를 들어 혈 청 기아 잘 정상 세포에 대 한 하지만 덜 oncogene 활성화 나 종양 억제기 손실로 인해 손상 된 세포 주기 검문소와 종양 세포에 대 한 잘 작동합니다. 마찬가지로, 화학적 치료 세포 인구는 약물 유발 손상 항구 하 고 스트레스 관련 변경 표시 수 있습니다. 이러한 문제를 circumvents는 기술 셀 2 개의 반대 힘, 원심력과 유체 속도, 크기 및 밀도 기준으로 셀의 분리에 어떤 결과를 받게 됩니다 특히 원심 elutriation (CCE) 이다. 때문에 세포 주기를 통해 일반적으로 발전 확대, CCE 다른 세포 주기 단계에 셀을 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포에이 기술을 적용. 최적의 조건에서 우수한 수익률에 g 1 단계 셀의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 세포 인구를 항 암 제 약물의 행동의 공부 세포 주기-종속 메커니즘 및 다른 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다. 우리는 또한 어떻게 표준 절차 수 있습니다 수정 최적이 아닌 성능 결과 보여 하 고 기술의 한계를 논의. 응용 프로그램 및 다른 종류의 세포에 기술 탐구 상세한 방법론 제시 용이 해야.

기본 모든 셀 (3-4 × 108) 원심 elutriation 대상이 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 두 세척 분수와 20 메인 분수, 수집. 표 1 각 분수 해당 회전자 속도 있는 셀의 총 수 제시는 대표 데이터를 보여 줍니다. 전반적인 항복이 했다 일반적으로 80% 이상. 개별 분수에 셀 직경의 측정 확인 해당 셀 직경 elutriation (그림 2) 진출 증가. 이러한 결과 두 개의 독...

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Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.2K 조회수.  University of Arkansas for Medical Sciences. 이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

연구

암 연구학

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

의학

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

면역학 및 감염병학

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

생물학

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Subcellular Fractions from Leukemic Cells: A Method to Generate Cellular and Nuclear Fractions from Leukemic Cells

Source: Hay, J., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the preparation of subcellular fractions from leukemic cells which is a method to generate cellular and nuclear fractions from leukemic cells. The nuclear and cytoplasmic fractions can be used for further downstream analysis.

백혈병 세포에서 Subcellular Fractions의 준비: 백혈병 세포에서 세포 및 핵 분획을 생성하는 방법

Source: Hay, J., et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Leukemia

In vitro techniques & assays

Density Gradient Centrifugation: A Method to Isolate CLL Cells from Peripheral Blood

Source: Hay, J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of isolating chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells from peripheral blood. With this protocol, we will isolate CLL cells from human patient blood sample for subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions.

밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

Source: Hay, J. et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. ...

Cell isolation & characterization

Leukemic Subpopulation Harvest: A Method for Spatial Separation of Leukemic Cell Subpopulations from 2D Co-culture

Source: Slone, W. L., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/t/53645">Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation of three leukemic cell subpopulations: the suspended leukemic cells freely floating in the media, phase bright leukemic cells adhered to the surface of the mesenchymal stromal cell monolayer, and the phase dim leukemic cells that have migrated beneath the mesenchymal stromal cell monolayer from 2D co-culture.

Leukemic Subpopulation Harvest: 2D 공동 배양에서 백혈병 세포 하위 집단의 공간적 분리 방법

Source: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation ...