Name: müller glia cell activation in a laser-induced retinal degeneration and regeneration model in zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about MÃ¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish at JoVE.com

우리가 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 모델 및 Federica Bisignani 설정에서 그녀의 과학적인 입력에 대 한 마틴 Zinkernagel, 메릴랜드, 박사 학위 및 Reisenhofer, 박사 미리 암 감사 합니다.

모든 실험 성명 안과 및 안과 (ARVO)에 비전 연구를 위한 협회의 비전 연구에서 동물 사용에 대 한 준수 하 고 존중 하는 정부 기관의 관련된 규정.
 1. 동물 <ol><li>유지 TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) 스트레인 26.5 ° C의 온도와 물 표준 조건 하에서 6-9 개월 ~ 14/10 h 명암 주기 18 세.</li>
	<li>정부 당국에 의해 승인 후 동물 실험에 대 한 관련 기관의 동물 보호 지침을 따릅니다.</li>
</ol> 2. 가역 전신 마 취 <ol><li>준비 물 탱크 그리고 트리 스의 1 M의 2.1 mL 97.9 ml tricaine 분말의 400 밀리 그램을 용 해 하 여 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 (tricaine)의 재고 솔루션 버퍼링 식 염 수 (TBS). 어둠 한 달에에서 4 ° C에서 1 M Tris (pH 9)와 저장소 pH 7.0 조정. 
	참고: Tricaine는 동물의 자연 생활 상태 처럼 물에 준비 되어야 한다, 원래 탱크 물 사용 하는 선호.</li>
	<li>재고 솔루션 1시 25분 탱크 물에 희석 하 고 즉시 사용.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 그들이 움직이지 되 고 외부 자극 (약 2-5 분, 무게와 연령에 따라)에 응답 하지 않는 때까지 마 취 솔루션 50 mL를 포함 하는 제 브라 넣습니다.</li>
	<li>전송할 각 물고기 손으로 레이저 치료 ( 그림 1A)에 대 한 맞춤 실리콘 핀 홀더. 
	주의! 물고기 탱크를 10 분만에 외부 마 취 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>치료 및 이미징 후 마 취를, 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에서는 zebrafish 장소.</li>
	<li>Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.</li>
</ol> 3. 망막에 초점 부상 레이저 참고: A 532 nm 다이오드 레이저는 zebrafish의 망막에 초점 빛 피해를 만드는 데 사용 됩니다. 레이저의 실험 설정 수 성인 제 브라에서 재현할 수 초점 망막 상해의 설립.
<ol><li>레이저의 출력 설정: 70 mW; 공중 직경: 50 µ m; 펄스 기간: 100 양 주의! 레이저 빛 사용 하려면 적절 한 개인 보호와 지역의 라벨.</li>
	<li>치료 전에 눈에 붙이기 2 %hydroxypropylmethylcellulose 1-2 방울을 적용 하 고 2.0 m m 저 레이저 렌즈를 사용 하 여 초점을 망막에 레이저를 목표로 빔. 
	주의! hydroxypropylmethylcellulose 방울 점성 있고 아가미에가 경우 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>왼쪽에 시 신경 주위 장소 4 레이저 명소 눈과 눈을 오른쪽, 치료를 사용 하 여 내부 통제로.</li>
</ol> 4. Vivo에서 망막 형태학의 이미징 <ol><li>마 취에서 그들 되살리는 없이 시각화 zebrafish 망막 레이저 유도 후에 직접적으로 0 일에. 전신 마 취를 사용 하는 전혀 다른 시간 포인트 (섹션 2 참조: 가역 전신 마 취). 맞춤 실리콘 핀 홀더 ( 그림 1 B, B.1)에 고정된 zebrafish 장소.</li>
	<li>최적의 이미지를 잘라 zebrafish 눈에 맞게 상용 하이드로 겔 콘택트 렌즈 (Ø 5.2 m m, r = 2.70 m m, 중심 두께 = = 0.4 m m) 구멍 펀치를 사용 하 여. 스 렌즈의 오목한 표면 작성 및 각 막 위에 놓습니다.</li>
	<li>78 D 비 접촉 슬릿 램프 렌즈 OCT 시스템을 장비.</li>
	<li>집중은 IR 적외선 (IR) 이미지 + 10 월 모드 ( 그림 2A)는 적외선을 눈의 저 시각화를 클릭 하 여 그림에서 &#34; 취득 &#34; 버튼 ( 그림 2B) 지역화 하는 레이저 시스템을 사용 하 여 망막에 반점 &#39; s 소프트웨어.</li>
	<li>시각화 IR + 10 월 망막 층의 3 차원 섹션 모드를 클릭 하 여 사진의 찍을 하 고는 &#34; 취득 &#34; 버튼 ( 그림 2B). 외부 핵 층 (ONL)에서 상해의 심각도 관찰 (섹션 3 참조: 레이저 망막에 초점 부상) 이러한 이미지.</li>
	<li>치료 및 이미징 zebrafish는 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에 배치 후 마 취를.</li>
	<li>Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.</li>
	<li>망막 형태론의 비슷한 vivo에서 이미징을 수행 하는 하루에 1, 3, 7, 14 및 주 6.</li>
</ol> 5. 되며 &#38; 오신 (H &#38; E) 얼룩 <ol><li>zebrafish 감기 (4 ° C)에 침수에 의해 안락사 마 취 솔루션 enucleate 및 적어도 10 분 동안 얼음에 눈 즉시으로 의미의 작은 곡선된 겸 자.</li>
	<li>20 h 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 전체 눈을 해결 하 고 다음 등급된 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 (크 실 렌 에탄올 70%, 3 분 두 번에 대 한 에탄올 96%, 에탄올 100 %5 분 두 번, 5 분 두 번에 대 한 100 %3 미 n 한 번). 
	주의! PFA는 눈, 코, 그리고 상부 호흡기 트랙에 자극 수 있습니다. PFA는 알려진된 인간 발암 물질 의심된 생식 위험.</li>
	<li>파라핀에 샘플을 포함, 시 신경 머리의 수준에서 5 µ m 섹션을 잘라 고 유리 슬라이드에 탑재.</li>
	<li>5 분 0.1% 산 되며 솔루션 deparaffinized 섹션 얼룩 및 염 산 믹스에 슬라이드를 찍기 후 두 번 증류수에에서 슬라이드를 찍어 (2 mL 25% HCl 250 ml에서 증 류 물) 및 암모니아 (250 ml에서 2 mL 25% 암모니아를 혼합 소 주 물)입니다. 적어도 10 분에 대 한 수도 물에 의해 얼룩이 지는 hematoxylin의 개발 후 오신 G 용액 0.5 %3 분에 대 한 섹션을 얼룩</li>
	<li>아크릴 수 지 장착 매체에 탈수 슬라이드를 탑재 하 고 가벼운 현미경 슬라이드 관찰.</li>
</ol> 6. MC 활성화 Immunohistochemistry <ol><li>적절 한 기선 또는 10-15 분 동안 전자 레인지에 3 분에 대 한 항 원 검색 버퍼 (트리 스-EDTA + 0.05% 비 이온 세제, pH 9.0)에서 deparaffinized 섹션을 열 및 5 TBS와 세 번 씻어 각 분.</li>
	<li>원형 한 실리콘 섹션 펜 및 100 µ L를 추가 차단 솔루션 (TBS + 10% 염소 정상 혈 청 + 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.6) 1 헤에 대 한 실 온에서</li>
	<li>안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질으로 얼룩 (GFAP) 토끼 polyclonal 항 체 그리고 방지 글루타민 합성으로 (GS) 마우스 단일 클론 항 체, 1: 200 희석 (샘플 당 40 µ L)에서 모두. 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 품 어. TBS + 0.1%로 세 번 세척 5 분 트윈 20.</li>
	<li>완료 시각화와 적절 한 2 차 항 체입니다. 이 프로토콜 사용 하는 염소-토끼 IgG H &#38; GFAP와 염소 반대로 마우스 IgG H L 녹색 이차 항 체 &#38; L GS, 1 헤에 대 한 실 온에서 1: 500 희석에 모두 밝은 빨간색</li>
	<li>DAPI를 포함 하는 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 형광 현미경 슬라이드 관찰.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

제 브라에서 망막 재생/변성 cytotoxin 중재 세포 죽음22, 기계적 상해23, 열 상해24등 다른 방법으로 조사 되었습니다. 우리 고용 zebrafish 망막 손상 532 nm 다이오드 레이저. 따라서, 우리의 모델 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 급속 하 게 외부 망막, PRs 계층에서 특히에 상해의 잘 정의 된 영역을 만들었습니다. 또한,이 실험 설정 안 neovascularization를 유도 Bruch의 막 손상에 의해, 예를 들어 다른 생물 학적 과정을 공부 하는 손상의 더 큰 영역을 생산 하기 위해 수정할 수 있습니다. 최소한의 피해 이며 재생 응답의 타이밍은 정확 하 게 그리고 reproducibly 변조 될 수 있습니다.
Phenotypical 변화 시간이 지남에 따라, 우리는 하이델베르크 Spectralis 시스템 및 하이델베르크 눈 탐색기 소프트웨어 채택. 따라서, 저 IR 이미징 zebrafish에 특히 유용 하 게 발견 되었다. 저 autofluorescence (AF), 레이저 자리와 주변 지역 사이 낮은 대조를 보여주는, 달리 손상 된 사이트는 IR 이미징 하 여 쉽습니다. 변경 내용을 검색 하 고 모니터링 하 재생 vivo에서,는 AF 모드와 함께 가능 하지 않을 것 이라고 수 있습니다. 이전에 보고 된25, 10 월 zebrafish 망막 퇴행 성/재생 프로세스를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 모델에서 망막 레이저 부상 어떤 포유류26에 보고 되었습니다 비슷한 ONL (그림 3)에 하이퍼 반사 밴드 검색 되었습니다. 재생성 하는 동안 하이퍼 반사 신호 감소 하루 14에서 완전히 사라질 때까지.
OCT 이미지 레이저 병 변 (그림 4) 이내에 본 형태학 변화와 상관 했다. 10 월 이미지 (0 일) 확산 반사 하이퍼 신호 레이저 치료 따르는 1 시간 안에 안락사 zebrafish의 INL에서 본 후 레이저 변화를 나타냅니다. 주 3에서 미묘 하 고 잘 delineated 하이퍼 반사 신호 막대 손실로 인해 ONL에 구멍 형성에 해당 합니다. 하루 14, 모두 10 월부터에서 시작 하는 조직학 분석 확인 외부 망막 다시 그것의 정상적인 형태를 설립 했다.
현재 연구에서 우리 또한 망막 재생 (그림 5) 동안 MC 응답 평가. 많은 그룹 이미 손상 초기 재생 반응으로 특히의 MCs, glial 세포의 활성화를 조사 했습니다. 좀 더 구체적으로, 그들은 제안 pathophysiological MC 활성화27망막 손상 된 영역에 통합할 수 있는 새로운 기능 세포 유형의 생 소스를 제공 하는 줄기 세포 특성을 채택 하는 MCs를 유발 수 있습니다. 예상 대로, 우리는 망막 레이저 부상 GFAP의 upregulation에 표시 된 대로 MC 활성화를 자극 발견. 실제로, 증가 GFAP 식 3 일 후 상해에서 현저 하 게 감지 하 고 피해 지역에 제한 되었다. 주 14에서에서 시작, 재생 크게 완료 되었고 GFAP 신호는 피해 지역에서 초기 단계로 downregulated. 따라서, 우리는 MCs 적극적인 역할을 망막 조직 개편, 그리고 잠재적으로 재생, 부상에 따라 증명 하고있다.
결론적으로, 레이저 유도 된 망막 변성/재생 모델은 신속 하 고 초점 zebrafish 망막 손상을 생산 하는 다양 한 도구 및 다음 재생 구상 될 수 있다 비-침략 적 10 월 영상에 의해. 또한, 레이저 망막 변성은 MC 활성화를 동반 하 고 뒤이어 gliosis 재생성 시 반전 보여줄 수 있었습니다. 그러나, 관련 된 세포 유형 (예: microglia, 대 식 세포) 및 통로의 상세한 조사를 수행 해야 합니다. 중요 한 수정 필요할 수 있습니다, 특히 그들이 재생 과정 (예를 들어, PRs 계층에서 특히 외부 망막에는 INL에 그들의 원래 위치에서 마이그레이션) 동작 하는 방법을 이해 하려면 MCs의 추적을 라이브 그리고 그들의 차별화 홍보 세포 쪽 으로입니다. 또는, 가벼운 손상 패러다임 막대와 콘 PRs28의 광범위 하 고 일관 된 감소를 유도 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 그러나, 기술된 모델의 장점은 더 정의 된 상해 지역 어디 하나 악화 대뇌 활성화 MCs 사이 현지 상호 작용을 공부할 수 있습니다.
일반적으로, 우리는 모델 더 나은 감각 망막 퇴행 성/재생 프로세스를 이해 하는 데 도움이 됩니다 및 포유류 시스템과 이러한 발전의 비교 사용 믿습니다. 그것은 또한 타고 난 면역 시스템의 영향 및 효과 neuroactive 물질의 연구 사용 수 있습니다. 미래에, 하나를 사용 하 여 이러한 결과 악화 인간의 시각 시스템을 수정할 수 있습니다.

비전 아마 인간의 가장 필수적인 의미 이며 그 장애는 높은 사회 경제 충격. 공업화 한 세계에서 망막 퇴행 성 질병 시력 손실과 실명 성인 인구1중의 대다수를 위한 계정. 망막 화 (RP)에 영향을 미치는 약 1.5 백만 사람들 전세계2,360와 20의 나가 사이 사람들에서 실명의 가장 일반적인 상속 된 원인입니다. 그것은 상속 된 망막 장애 망막 안료 상피 하 고, 그 후, gliosis의 변성 및 내부 신경4개조 (PRs) 대뇌의 진보적인 손실에 의해 특징의 다른 유형의 가족. 질병의 과정 봉, 희미 한 빛에 콘, 컬러 비전 및 시력5에 필수적인 색 비전에 대 한 책임은 일반적으로 시작 하는 두 홍보 세포 유형에의 증분 손실에 의해 설명 될 수 있다. 단일 유전자 결함은 RP를 일으킬 충분 합니다. 지금까지 45 유전자에서 130 개 이상의 돌연변이 질병6와 연결 되었습니다. 이 다양 한 질병 고기 리드 이며 유전자 치료는 비 일반화할 이유 중 하나 이렇게 복잡 한 치료 접근. 그러므로, 망막 유년에 눈부신 질병 치료에 새로운 일반적인 치료 접근을 개발 하는 긴급 한 필요가 있다.
종종 망막 변성 관련 홍보 손실; 따라서, 홍보 세포 죽음은 망막7에 퇴행 성 프로세스의 특징 이다. 그것은 이미 홍보 세포 죽음 뮐러 명과 셀 (MC) 활성화와 확산8자극 입증 되었습니다. MCs, 척 추가 있는 망막에 주요한 glial 세포 유형 망막 신경 세포 사이 아무것도 "접착제" 보다는 더 많은 것 한 번 고려 되었다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구 MCs 단순한 구조 보다는 더 많은 지원9행동 나타났습니다. 다른 기능 중 MCs 성체에도 참여 하 고10을 복구 합니다. 실제로, 악화 망막에서 diffusible 요소에 대응, MCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 식 크게 증가. 그러므로, GFAP 라벨로 망막 상해 및 변성11응답 보조 MC 활성화에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다.
최근, 우리 개발 zebrafish (Danio rerio) 망막 변성을 유도 하는 레이저를 사용 하 여 초점 상해의 소설을 각 색을 했다. 초점 부상 부상된 사이트에 셀의 이동 및 망막 재생12중 사건의 정확한 타이밍 등 특정 생물 학적 과정을 공부에 대 한 유리 하다. 또한,는 zebrafish가 되고있다 시각적 연구에 중요 한 다른 척추 동물의 시각적 시스템 사이의 유사성 때문에. 인간과 teleost retinae의 심한 형태학 및 조직학 특징 몇 가지 차이점을 표시합니다. 따라서, 인간과 zebrafish retinae 망막 프로젝션 뉴런, 신경 절 세포 안쪽에 거주 하는 동안 빛 감지 대뇌 바깥쪽 레이어를 차지 같은 계층된 패턴에 같은 주요 셀 클래스 포함 신경 층, 렌즈에 인접입니다. 망막 수, amacrine, 바이 폴라, 및 가로 셀, 포토 리셉터와 신경 절 세포 층13사이 지역화합니다. 또한, zebrafish 망막은 콘 지배 하 고 따라서 보다, 예를 들어 집중적으로 공부 쥐 망막 인간의 망막에 더 가까이. 매혹적인 차이 teleost 및 포유류 물고기 망막과 망막 재생 손상 후에 지속적인 성체입니다. Zebrafish, MCs dedifferentiate를 중재 부상된 망막14,15에서 재생 됩니다. 닭, MCs는 또한 세포 주기를 다시 입력 하 고 dedifferentiate 일부 용량을가지고. 성인 물고기에 망막 상해 다음 MCs는 새로운 신경16생산을 손상 된 망막 조직을 마이그레이션할 조상 및 줄기 세포의 특정 특성을 채택. 진 식 포유류 MCs의 프로 파일링 망막 창시자, 예기치 않은 유사점 그리고 닭고기, 설치류, 심지어 인간의 망막에 MCs의 본질적인 neurogenic 잠재력에 대 한 증거는17성장 하 고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 왜 재생 응답 조류와 포유류에 낮은 물고기에 강력한 응답 비교는 아직 이해 되지. 따라서, zebrafish에 내 생 수리 메커니즘을 이해 포유류와 인간 자극 망막 중생에 대 한 전략을 제안할 수 있습니다. 망막 변성 환자 치료를 위한 치료 도구로 MCs의 내 생 수리 메커니즘을 채용 우리 사회에 대 한 뛰어난 영향을 미칠 것 이다.
여기, 우리 안과 연구에서 변성/재생 모델을 고용 하는 데 필요한 단계를 제공 합니다. 우리는 먼저 부상 사이트, 그리고 인접 한 MCs의 마지막으로 머릿속 참여 개발 이벤트의 이미징에 다음 neurosensory 망막에서 초점 손상을 유도에 집중 했다. 일반적인 프로토콜 비교적 쉽게 수행 하 고 다양 한 망막을 나중에 평가 대 한 가능성을 엽니다.

<table><tbody><tr><td>Acid hematoxylin solution</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mounting medium</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G aqueous solution 0.5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Switzerland</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG H&amp;amp;L Alexa Fluor&amp;reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG H&amp;amp;L Alexa Fluor&amp;reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Goat normal serum</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel contact lens</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson AG, Zug, Switzerland</td><td>n.a.</td><td>1-Day Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td><td>n.a.</td><td>Methocel 2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany</td><td>n.a.</td><td>532 nm laser</td></tr><tr><td>Mouse anti-GS monoclonal antibody</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.</td><td>Spectralis</td></tr><tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.</td><td>Version 1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Silicone pin holder</td><td>Huco Vision AG Switzerland</td><td>n.a.</td><td>Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.</td></tr><tr><td>Slit lamp BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp adapter</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus glass slides</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Germany</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris buffered saline (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D non-contact slit lamp lens</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ocular fundus laser lens</td><td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom</td><td>R2100-EU</td><td>Steamer</td></tr></tbody></table>

m&#252;ller glia cell activation in a laser-induced retinal degeneration and regeneration model in zebrafish

매혹적인 차이 teleost 및 포유류 망막 신생 및 심각한 손상 후 재생 teleost 망막의 평생 가능성은. Zebrafish에 재생 경로 조사 포유류에서 망막 퇴행 성 질환의 치료를 위한 혁신적인 전략을 개발 하는 새로운 통찰력을가지고 있습니다. 여기, 우리는 532 nm 다이오드 레이저에 의하여 성인 zebrafish에 외부 망막에 초점 병 변의 유도에 집중 했다. 지역화 된 부상 망막 변성 및 손상의 지역에서 직접 재생 하는 동안 자리를 차지할 생물 학적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 비-침략 적 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여, 우리는 손상 된 지역 및 모니터 후속 중생의 위치를 정의 하 수 있었다 vivo에서. 실제로, 10 월 영상만 사용할 수 있었던 이전 조직학 분석 정보를 제공 하는 제 브라 망막의 고해상도, 단면 이미지를 생성 합니다. 조직학 단면도 수행한 실시간 10 월에서 데이터를 확인, 그리고 망막 상해의 유도 후 재생 응답 immunohistochemistry에 의해 조사 되었다.

실시간 10 월: 망막 수리에 MCs의 역할 분석, 우리 zebrafish 망막에 손상의 잘 delineated 영역 유도 레이저 부상 모델 사용. 손상의 사이트 했다 vivo에서 10 월 처음으로 (0 일) 부상 (그림 3)에 따라 60 분 이내에 의하여 몇 군데. 물고기 눈의 광학에 대 한 보상, 맞춤 콘택트 렌즈는 각 막에 배치 했다. 레이저 치료 후 즉시 확산 하이퍼 반사 신호 외부 망막 (화살표)에 지역화 되었습니다. 그것은 외부 plexiform 레이어 (OPL) 망막 안료 상피 (RPE)에서 연장. 유사한 신호는 또한 1 일에 감지. 3 일 후이 확산 신호는 더 조직 되 고 밀도 되었다. 그것은 지속적으로 외부 핵 층 (ONL) 포토 리셉터 레이어로 확장에 보였다. 첫 주 (7 일)에 따라 평균 병 변 크기에 상당한 감소와만 작은 하이퍼 반사 신호 감지 되었습니다. 최신 시간 포인트 조사 (주 6) 때까지 하루 14에서에서 출발, 레이저 명소 더 이상 IR 및 OCT 이미지에서 볼 수 있었다.
조직학 평가 망막 변성/재생의: 범위와 망막 변성/재생, H의 활동을 조사 하기 위하여 &#38; 손상 유도 (주 0, 1, 3, 7, 14 후 다른 시간 지점에서 고용 되었다 전자 얼룩 그리고 주 6) (그림 4). 실험 3 물고기의 3 개의 눈에서 수행 했다. 그러나,이 원고의 목표는 메서드를 설명 하는 통계 분석 없이 수행 되었다. 안 핵 층 (INL)에 미묘한 변화 ONL 레이저 치료를 다음 60 분 이내 본된 즉시 후 레이저 (는 ONL예, 약간의 부 종)와 INL에 감소 된 세포 공간을 수 있습니다. 퇴보는 레이저 부상의 유도 후 6 주 뒤를 이었다. Morphologic 변경 PRs의 해체와는 ONL subretinal 공간에서 구멍 형성 1 일 후 지속적으로 관찰 되었다. 실제로, 일 1과 7 사이 피해 지역에 ONL 내 핵의 손실이 이었다. 최대 홍보 손실 3 일에 발견 되었다. 14 일에서 6 주에 시작, 외부 망막의 정상적인 형태를 다시 설립 했다.
폐해 참여 동안 망막 변성/재생: 다른 시간 점 (하루 0, 3, 14)에서 MC 활성화를 평가 하기 위해 망막 변성의 유도 따라 우리 glial 세포 마커 GS immunohistochemical 분석 수행 및 GFAP (그림 5)입니다. 실험은 정량 분석 없이 3 물고기의 3 개의 눈에 다시 수행 했다. GS extracellular 조미료의 레벨을 조절에 중요 한 역할 그리고 MC 소마와의 프로세스19,20에 독점적으로 표현 될 것으로 간주 됩니다. GFAP 노화 및 망막 손상 되거나 스트레스 때 upregulated입니다. 그것은 MC 끝 발에 지역화 및21를 처리 합니다. 약한 GFAP 식 또한 다른 glial 세포 유형, 예를 들면, 이다 라벨 쥐는 제어 망막의 안쪽 부분에서 발견 되었다. 홍보 외부 세그먼트의 autofluorescence는 ONL에 신호를 제공 하지만이 명확 하 게 구별 될 수 있습니다. GFAP 신호 upregulated 3 일 후 상해에서 했다. 따라서, 분석 수행 3 일 레이저 치료 후 망막의 ONL에 부상 사이트 내 에서만 GFAP 긍정적인 MCs를 보여주었다. 14 일에서 재생성 크게 완료 되었고 GFAP 신호는 피해 지역에서 초기 단계로 downregulated. GFAP와 달리 GS 식의 수준에 상당한 변화가 있었습니다. 그러나, 상해의 사이트에 GS의 지역화 downregulation 있었을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56249/56249fig1.jpg"> 
그림 1: zebrafish 망막 및 10 월 분석에 따라 레이저 상해의 유도 대 한 설치. (A) 치료 전 레이저 시스템의 배치. (A.1) Zebrafish 그냥 전에 레이저의 응용 프로그램 장소에 저 콘택트 렌즈와 실리콘 핀 홀더에 배치. (B) 이미징 하기 전에 OCT 시스템의 배치. 제 브라 (B.1) 10 월에 의하여 피해 사이트의 감지 하기 전에 78 D 슬릿 램프 렌즈 앞에 배치 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56249/56249fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56249/56249fig2.jpg"> 
그림 2: IR 및 OCT 이미지 획득을 위한 설치. (A) 이미징 동안 소프트웨어 창의 스크린샷. IR 및 10 월 모드 묘사 된다. (B)는 이미지를 수집 하는 데 사용 하는 패널의 개요. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56249/56249fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56249/56249fig3.jpg"> 
그림 3: IR (왼쪽)과 10 월 (오른쪽) 이미지 같은 망막의 손상 및 손상 되지 않은 사이트의 서로 다른 시간에 눈 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 1, 3, 7, 14, 주 6) 점. IR 이미지에서 녹색 상자는 망막의 부분 분석을 나타내고 녹색 선 망막에 OCT 이미지의 위치를 보여줍니다. 화살표 표시 사이트 10 월 눈금 막대에 하이퍼 반사 신호 감지 레이저 반점의 = 200 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56249/56249fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56249/56249fig4.jpg"> 
그림 4: H &#38; 전자 얼룩의 부상과 contralateral 쥐는 다른 시간에서 zebrafish 눈 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 1, 3, 7, 14, 주 6) 점. GC, 신경 절 세포 층; INL, 안 핵 층; ONL, 외부 핵 층 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56249/56249fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56249/56249fig5.jpg"> 
그림 5: MC 활성화의 Immunohistochemical 탐지. GFAP (녹색)와 GS (레드) 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 3, 14)를 포인트 서로 다른 시간에 부상 하 고 손상 되지 않은 zebrafish 망막에 얼룩. 녹색 신호는 ONL에 홍보 o의 autofluorescence은uter 세그먼트입니다. 세포 핵 (파란색) DAPI와 얼룩이 있습니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56249/56249fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K 조회수.  University of Bern. Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

비디오: Müller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

연구

발생학

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

신경과학

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

생물학

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial world. Animal models are of pivotal importance to study such diseases. In this regard the photoreceptor-specific toxin N-methyl-N-nitrosourea (MNU) has been widely used in rodents to pharmacologically induce retinal degeneration. Previously, we have established a MNU-induced retinal degeneration model in the zebrafish, another popular model system in visual research.
A fascinating difference to mammals is the persistent neurogenesis in the adult zebrafish retina and its regeneration after damage. To quantify this observation we have employed visual acuity measurements in the adult zebrafish. Thereby, the optokinetic reflex was used to follow functional changes in non-anesthetized fish. This was supplemented with histology as well as immunohistochemical staining for apoptosis (TUNEL) and proliferation (PCNA) to correlate the developing morphological changes.
In summary, apoptosis of photoreceptors occurs three days after MNU treatment, which is followed by a marked reduction of cells in the outer nuclear layer (ONL). Thereafter, proliferation of cells in the inner nuclear layer (INL) and ONL is observed. Herein, we reveal that not only a complete histological but also a functional regeneration occurs over a time course of 30 days. Now we illustrate the methods to quantify and follow up zebrafish retinal de- and regeneration using MNU in a video-format.

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Herein we demonstrate quantification of retinal de- and regeneration and its impact on visual function using N-methyl-N-nitrosourea in the adult zebrafish. Loss of visual acuity and decreased photoreceptor numbers were followed by proliferation in the inner nuclear layer. Complete morphological and functional regeneration occurred 30 days after the initial treatment.

조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...