Name: creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

PJA1 플라스 미드의 종류 선물에 대 한 조지 교회 연구소 감사합니다. 난 감사 합니다 Fabienne 햄버거와 Urs Jenal 연구소에서 알렉스 Boehm 바젤에서 Biozentrum에 세균성 활용에 대 한 BW20767 긴장을 제공. 나는 또한 도움이 편집에 대 한 올린 Silander 감사합니다. 이 연구에 대 한 자금 스위스 바젤 대학에서 뉴질랜드에서 메시 대학교 시스템 생물학 (프로젝트 "전투 X" 더크 Bumann에 게 수 여) 스위스 이니셔티브에서 기금에 의해 제공 했다.

주의: S. flexneri 받는 사람 부담, 사용 하는 경우는 참고 하시기 바랍니다 S. flexneri 위장 질환을 일으킬 수 있는 인간 병원 체. 적절 한 biosafety 주의 (유럽 및 미국에서 BSL-2 또는 뉴질랜드에서 PC2 지정)와 S. flexneri 관련 실험을 수행 되어야 합니다. 이 프로토콜와 관련 된 비디오에서 수행 하는 모든 실험 끝났다 비 병원 성 대장균의 특징이 잘 받는 사람 긴장을 사용 하 여 p c 1에 MG1655. 6에 설명 된 대로 Shigella flexneri 작업 이전 바젤, Biozentrum에 BSL 2 lab에서 수행 되었다.
 참고: 다음 실험은 두 번 수행 하 고 효과적으로. 첫 번째 부분 (4.5 단계 1.1-단계)는 라이브러리, 목표 잔디 양식을 주는 접시, 당 많은 개별 식민지 하지만 그리 많은 그 활용의 희석을 찾기 위해 도금에 대 한 최고의 희석을 수행 됩니다. 이 크게 감소 피트 니스와 함께 돌연변이 더 강력한 피트 니스와 그 간의 경쟁을 줄이는 것입니다. 두 번째 부분 (단계 5.1-7.4) 최종 라이브러리, 많은 접시는 라이브러리의 적절 한 희석의 확산은의 창조 이다.
 1.를 준비 1 일 이전에 실험 <ol><li>Inoculate, 냉동된 재고, 파운드 국물의 2 개 mL에 기증자 스트레인에서 밀러 레시피 (10 g/l NaCl) 미디어에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함. 여기 사용 기증자 스트레인은 대장균 스트레인 BW20767 15 pJA1 플라스 미드 11 은닉. 암 피 실린의 사용 유지 pJA1 플라스 미드에 대 한 선택.</li>
	<li>단일 식민지 또는 냉동된 주식, 암 피 실린 또는 대 저항 표시와 함께 파운드 미디어의 2 mL에 받는 사람 긴장에서 Inoculate. 여기에 사용 되는 받는 사람 긴장은 대장균 &#34; 야생 타입 &#34; MG1655 17 , 18 nalidixic 산에 자연 저항 돌연변이와 스트레인. 30 µ g/mL nalidixic 산에서 재배.</li>
	<li>준비 20 Luria 국물 1.5 %agar 포함 하는 (에서 90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL) 접시. 항생제를 부족 한 천 배지는 4 ° C에서 사용까지 몇 달 동안 저장 될 수.</li>
	<li>20 Luria 국물 준비 포함 1.5% 한 천 배지 (90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL)에 포함 된 두 nalidixic 산 30 µ g/mL에서 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50)에 대. 항생제를 포함 한 천 배지 사용까지 몇 달 동안 4 ° C에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>살 균 파운드 미디어의 200ml를 준비합니다. LB 미디어는 몇 달 동안 실내 온도에 저장 될 수.</li>
	<li>제조 업체에 따라 100 m m의 1 mL IPTG, 살 균 재고 준비 &#39; s 지침.</li>
</ol> 2. 세균성 Mating 또는 활용 실 온에서 <ol><li>14000 x에서 1 분간 기증자 스트레인의 숙박 문화의 원심 분리기 1 mL g. 성장 매체를 버리십시오. 이 단계는 항생제를 포함 하는 모든 성장 매체를 제거 이루어집니다.</li>
	<li>110 µ L의 파운드 (항생제를 포함 하지 않는), 따라서 문화 집중으로 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 살 균, 살 균 nitrocellulose 필터 위치 (또는 살 균 압 종이 조각을 사용할 수 있습니다 참조 하십시오 자료 목록)는 LBA 플레이트 (항생제를 포함 하지 않는)의 중간에. 접시를 라벨 &#34; 부정적인 제어: 기증자 &#34;.</li>
	<li>는 피 펫을 사용 하 여 드롭 필터에 집중된 기증자 문화 50 µ L.</li>
	<li>반복 단계 2.1-4 받는 사람 긴장을 위한 접시를 라벨 &#34; 부정적인 제어: 받는 사람. &#34;</li>
	<li>라이브러리, 드롭 (이 번호판 없어야 항생제)는 LBA에 단일 살 균 필터에 (2.5 단계)에서 받는 사람 긴장의 (2.2 단계)에서 기증자 및 50 µ L의 50 µ L. 이 접시를 레이블 &#34; 라이브러리. &#34; Mating 기증자와 받는 사람 필터에 가까운 신체 접촉에서 때문에 발생 합니다.</li>
	<li>장소 6 h. 위해 37 ° C에서 필터를 포함 하는 한 천 배지</li>
</ol> 3. PJA1는 Transposase의 IPTG 유도 함으로써 Transposon의 활성화 <ol><li>준비 3 15 mL 원뿔 튜브 1mm (즉, IPTG의 100 m m 재고 20 µ L)의 최종 농도에 IPTG와 파운드의 2 개 mL를 포함 하. 각 레이블: 기증자 제어 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리.</li>
	<li>성장 (단계 2.4)에서 37 ° C에서의 6 h 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 일부 세균 성장 필터에 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 살 균, 기증자 컨트롤에서 필터 종이 제거 하 고 기증자 제어 (3.1 단계)에서 라고 표시 된 15 mL 원뿔 유리병에 넣습니다. 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리에 대 한 동일한 작업을 수행.</li>
	<li>15 mL 원뿔 유리병의 하단에 필터 종이 고 파운드에 완전히 빠져들 수 있도록 튜브를 누릅니다</li>
	<li>적어도 전체와 동 관을 nitrocellulose 필터에서 박테리아를 끊을 높은 분. LB 세균 세포 ( 그림 2)와 흐린 될 해야 합니다.</li>
	<li>LBA Nal30 Kan50 플레이트 표시에 기증자 컨트롤에서 vortexed 박테리아 서 스 펜 션의 200 µ L 플레이트 메 마른 유리 구슬 또는 살 균 분산기를 사용 하 여 &#34; 기증자 제어, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>(3.6)의 위 단계를 반복 하 여 라벨 번호판 받는 사람 컨트롤에 대 한 &#34; 받는 사람 컨트롤, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>(3.7) 위 단계를 반복 하 여 판 라벨 라이브러리에 대 한 &#34; 도서관, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>확인 추가 희석 (즉, 1:5, 1시 10분과 1: 100 희석, 파운드는 희석제로 항생제를 포함 하지 않는 사용 하 여) 라이브러리의. 플레이트 200 µ l undiluted 라이브러리에 추가 희석의 적절 하 게 표시 LBA Nal30 Kan50 판.</li>
	<li>37 ° C에 장소 접시 인큐베이터 transposons 피트 니스의 큰 손실이 발생 하는 유전자에 삽입 된 함께 18 헤 클론에 대 한 성장과 플레이트에 표시 하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 다양 한 식민지 크기 ( 그림 3) 이어야 한다. 기증자와 받는 사람 부담 접시 그들에 아무 식민지 있어야.</li>
</ol> 4. 선택 하는 최종 돌연변이 라이브러리에 사용할 라이브러리의 적절 한 희석 <ol><li>다양 한 크기의 많은 식민지를 생성 하는 단계 3.9에서 라이브러리의 희석은 적절 하 게 간격을 확인. 목표는 식민지 서로로 병합 및 리소스에 대해 경쟁 한 접시에 가능 하지만 너무 많은 많은 식민지를 얻는 것입니다. 이 번호는 접시 당 약 500-2000 식민지 이어야 한다. 접시에 적절 한 서식 밀도의 예는 그림 3에 표시 됩니다.</li>
	<li>접시에 식민지의 수를 기록.</li>
	<li>활용 (conjugants 받는 사람 셀 당 수)의 주파수를 계산합니다. 이것을 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4의 범위에 있어야 한다.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에 따라 마지막 라이브러리에서 원하는 돌연변이의 수를 결정 합니다. 많은 사용자는 단순히 가능한 많은 돌연변이와 라이브러리가 필요합니다. 많은 transposon 삽입 이론적으로 가능한 생성 하 (하나의 삽입 모든 기본적인 쌍), 대략적인 목표로ly (즉, 대장균에 대 한 ~4.5 x 10 6) 게놈에 있는 기본적인 쌍으로 식민지의 동일한 수 완전히 모든 가능한 transposon 삽입 된 게놈을 포화. 그것은, 많은 돌연변이 에센셜에 삽입을 은닉 또는 이러한 돌연변이 받는 사람에 게 치명적인 것으로 기능적으로 중요 한 유전자 복구할 수 없게 됩니다.</li>
	<li>얼마나 많은 양의 초기 라이브러리 원하는 크기의 라이브러리를 만드는 데 필요한 계산 합니다. 예를 들어 원하는 라이브러리 크기는 5 x 10 4 돌연변이입니다. 단계 3.9에서 식민지의 최고의 간격으로 희석은 1시 10분의 200 µ L 희석. 이 접시에 식민지의 수는 약 2000 식민지를 것으로 추정 됩니다. 5 x 10 4 돌연변이 필요 하 고 각 플레이트는 2000 식민지 경우 25 접시가이 희석에 필요 합니다.</li>
</ol> 5. 최종 돌연변이 도서관의 창조 <ol><li>반복 단계 1-3.8 (단계 4.4 참조)을 필요에 따라 단계 1.4에서 격판덮개의 수를 조정.</li>
	<li>단계에서 3.9, 접시 원하는 크기의 라이브러리를 작성 하는 데 필요한 만큼 접시에 4.1 단계에서 선택 하는 희석 (단계 4.4 참조).</li>
</ol> 6. 라이브러리 밀도 추정 <ol><li>거기 얼마나 많은 식민지는 접시 당 계산 하 고 그로 인하여 얼마나 밀도 도서관은의 대략적인 견적을 얻을. 예: 2 x 10 5 식민지의 총 도금. 대장균 MG1655 게놈은 약 4.5 x 10 6 기본적인 쌍. 따라서, 약 2 × 10 5 라이브러리 삽입 한 삽입 평균 이다 모든 22 기본적인 쌍 그리고 각 유전자 해야 변경 될 약 45 배, 주어진 그 한 유전자는 약 1 × 10 3 기본적인 쌍. 필수 유전자에 삽입이이 라이브러리에서 아주 underrepresented 될 것 이며 따라서 비필수 유전자 밀도 이것 보다 더 큰 될 가능성이 높습니다. 계산의이 종류는 transposon 밀도의 광범위 한 견적 하나를 제공 합니다.</li>
</ol> 7. Transposon 라이브러리 및 스토리지 풀링 <ol><li>식민지, 계산 후 라이브러리 플레이트에 파운드 (또는 더, 필요에 따라)의 1 mL을 추가 하 고 메 마른 분산기를 사용 하 여 접시에서 박테리아를 다쳤어요. 세균 현 탁 액을 제거 하 고 50 mL 또는 15 mL 원뿔 유리병에. 모든 플레이트에 대 한 반복.</li>
	<li>소용돌이 풀링된 박테리아 서 스 펜 션 전체 분에 대 한 현 탁 액을 균질 하.</li>
	<li>최종 농도 20%의 살 균 글리세롤 추가.
	<ol><li>100 x 20 µ L aliquots 0.25 mL 튜브에 쉽게 다시 성장에 대 한 준비.</li>
		<li>적어도 두 개 이상의 1 mL cryovials에서 aliquot 준비.</li>
	</ol></li> <li>-80 ° C에서 모든 aliquots 저장</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. 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저자는 공개 상관이 있다.

여기에 설명 된 프로토콜 밀도 삽입 라이브러리의 건설에 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 아래 문화 볼륨6의 5 mL을 사용 하 여 2 x 10 이상의5 독특한 transposon 돌연변이와 transposon 도서관의 창조에 대 한 수 있습니다. 비교적 쉽게 수행 하는, 가장 기본적인 미생물학 실험실에서 사용할 수 있는 시 약을 사용 하 여, 확장 이며 고가의 장비 또는 소모품 electroporation 큐 벳 등의 방법으로 약간을 요구 한다.
이 방법의 중요 한 이점은, 이론적으로, 사용자가 넓은 위도 enterobacterial 받는 사람 종자의 선택에서입니다. 그러나이 종이, 다른 사람 뿐만 아니라11, pJA1 플라스 미드 Shigella flexneri6 와 살 모 넬 라 enterica 다른 enterobacterial 받는 사람 종으로 성공적으로 사용 된 받는 사람 부담으로 대장균 을 사용합니다 serovar Typhimurium 변형 SL134410. 이론적으로, 복제 (오 라R6Kγ) pJA1에서의 γ 기원이 플라스이 미드는 광범위 한 호스트 범위19, 수 있도록 받는 사람 긴장은 유지 될 수 pir +. 최근, 새로운 방법은 설명는 pir + enterobacterial 긴장20, 추가 융통성을 주는 범위에서의 건설을 허용 하는. 또한, pJA1에서 RP4 플라스 미드에서300 자료 쌍 폭도 지역 그램 부정적인 박테리아 긴장19의 광범위에이 플라스 미드의 conjugative 전송을 허용합니다. 간단히 말해서,이 방법은 이론적으로 사용 될 수 다양 한 받는 사람 긴장, 여러 조건으로: 긴장은 pir+, 기증자 스트레인 이외의 대 이외는 항생제 저항으로 표시 됩니다.
프로토콜에 중요 한 단계 단계 4.1에서에서 밖으로 접시를 셀의 적절 한 수를 추정에 놓여 있습니다. 식민지는 너무 밀접 하 게 간격을, 그들은 접시에 양분을 위한 경쟁 하 고 덜 맞는 돌연변이 outcompeted. 이 돌연변이의 총 수에서 감소 될 수 있습니다. 또는 경우 식민지 간격 너무 멀리 떨어져, 접시를 너무 식민지가 될 것입니다 하 고 한 천 배지는 큰 도서관을 달성 하는 데 필요한 총 수 부담이 된다. 따라서, 접시 당 식민지 숫자 측면에서 적절 한 균형을 달성 것이 중요 합니다.
그것은 단계 설명 된 대로 작동 하도록 프로토콜에 나열 된 컨트롤을 수행 해야 합니다. 특히, 기증자 스트레인에 대 한 카운터 선택으로 nalidixic 산을 사용할 때 부정적인 기증자 제어 격판덮개는 식민지의 무료 보장 하는 것이 중요 하다. 이 때문에 낮은 속도 (약 1 x 10-10)21 의 가양성을 생성 하는 nalidixic 산 자연 저항 될 수 있습니다. 일반적으로, 활용 및 전위의 속도가 약 2 x 10-4 19입니다. 따라서, 활용 및 전위의 속도가 몇 배나 nalidixic 산에 자연 저항 속도 보다 큰입니다. 따라서, 진정한 이항 이벤트에 비해 잘못 된 반응의 속도 매우 낮은 프로토콜 작동 될 때 무시할 수 간주. 그러나, 활용 또는 이항의 속도 크게 감소, (에서 낮은 짝짓기 효율 및 IPTG와 transposase 유전자의 감 응 작용의 부족) 및 프로토콜 최대 크기를 조정 하는 경우이 다음 잘못 된 반응의 수에 대 한 보상 (복제 하는 삽입 하는 transposon 하지 않아도) 늘릴 수 있습니다.
일부 수정 단계 3.2 및 3.10에서 보육 시간을 만들 수 있습니다. 3.2 상태 활용 6 h에 대 한 발생 해야 하는 단계 지만 우리의 경험에서는,이 시간 단계 수 (즉, 4-7 h) 결과 크게 변경 하지 않고 다양 한. 또한, 3.10 단계에서 식민지 한 천 배지에서 알을 품는 시간 또한 조정할 수 있습니다. 이 받는 사람 긴장의 시간이 나 성장 속도 두 배로 하는 평균에 따라 변화 될 수 있습니다. 또한, 우리의 경험에 18 h 나왔고 다양 한 식민지 크기, 다양 한 피트 니스의 라이브러리를 나타내는. 그러나, 크게 감소 피트 니스와 식민지 성장 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 및 따라서 보이지 않을 수 있습니다 후 18 h. 이 메서드는 매우 감소 피트 니스의 클론을 찾는 데 사용 되는 경우 더 이상 보육 시간과 적은 식민지 (즉, 48, 50-300 식민지) 크롤 링을 줄이기 위해 접시에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 추가 함정 포함 하는 이미 대 한 받는 사람 부담을 사용할 수는 없습니다. PJA1 플라스 미드에이 장애물을 극복 하기 위해 페니 저항 등 대체 선택 가능한 마커 마커 저항 대에 밖으로 스왑 수 있습니다. 그것은 또한 이론적으로, 그것은 암 피 실린 저항 하는 받는 사람 긴장을 사용 하 여, 지적 가치가 있을 수 있습니다, 그리고는 pJA1로 포함 하는 암 피 실린 저항 감 적 플라스 미드 이항 후 손실 됩니다.
선택의 유전 배경에서 조밀한 transposon 도서관의 창조는 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 잠재적으로 유리한. 예를 들어 auxotrophic 돌연변이 복제 도금22 를 사용 하 여 식별 하거나 감염1,2에서 결함이 있는 돌연변이 식별 밀도 transposon 라이브러리 사용할 수 있습니다. 더 최근에, DNA 시퀀싱 비용 떨어졌다 고 다음 세대 시퀀싱 등 새로운 기술 되 평범한 transposon 라이브러리 사용 되었습니다 깊은 DNA 시퀀싱과 진 본성, 유전자 기능에 대 한 통찰력을 얻을 수 및 유전 상호 작용입니다. 이러한 방법 중 일부 23 에서 검토 하 고 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS), transposon 시퀀싱 (테네시-seq), 높은 처리량 삽입 딥 시퀀싱 (안타), 그리고 삽입 시퀀싱 (추적 방법 포함 INSeq)입니다. 이러한 모든 다운스트림 메서드 밀도 transposon 삽입 라이브러리의 건설에 의존합니다. 다른 특정 다운스트림 방법을 사용 해야 할 수도 있습니다, 하는 동안 여기에 설명 된 프로토콜 따라 현저한 절차 포인트에 대 한 개요를 제공 합니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
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An erratum was issued for: <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

박테리아에서 transposon mutagenesis 라이브러리의 창조는 세균성 병원 체1,2, 독성 유전자의 발견에서 필수 유전자3, 의 연구에 이르기까지 응용 프로그램의 다양 한 유용 4 , 5 , 6, 유전자 상호 작용의 id에7,,89네트워크. 이러한 연구에 중요 한 돌연변이의 큰 도서관을 만드는 기능이입니다. Transposons (짧은 조각 DNA의 게놈에 무작위로 삽입)의 사용은 유전자 기능을 방해 하는 간단한 수단으로 열려있는 독서 프레임 또는 유전자의 규제 지역 내의 transposon의 삽입 함수 또는 식에 자주 중단 됩니다. 유전자.
여기에 설명 된 플라스 미드 pJA110를 사용 하 여 세균성 활용 하 여 대장균 또는 S. flexneri transposon 도서관의 창조를 위한 방법이입니다. 이 플라스 미드를 사용 하 여 두 가지 주요 이점이 있다. 첫 번째 장점은 pJA1 플라스 미드에서 표현 Tn10 transposase의 변종 유도할 수 있는 이며 낮은 삽입 바이어스11,12는 transposon 게놈에 무작위로 통합할 것입니다 의미 했다 때 이소프로필 Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)는 미디어에 추가 됩니다. transposon 대 저항 마커를, 받는 사람 긴장의 염색체에 돌연변이 transposon 삽입과 선택에 대 한 수 있도록 포함 되어 있습니다. PJA1 플라스 미드의 두 번째 장점은 그것 포함 하는 복제의 R6K 돌연변이 기원입니다. 복제의 R6K 돌연변이 출처 람다 pir 유전자를 플라스 미드13의 유지 보수에 대 한 순서 대로 필요합니다. 플라스 미드는 pir- 긴장에 복제할 수 없습니다로 받는 사람 부담 (그림 1)에서 손실 될 것입니다. 이렇게 하면 Tn10 transposase 셀에서 제거 되 고 더 이상 활성 상태 인지, 초기 전위 이벤트 후 추가 변이 감소 시키기.
받는 사람 부담을 기증자 긴장에서 pJA1 플라스 미드 이동 세균성 활용을 사용 하 여 여러 가지 이유로 유리 하다. 활용은 간단 하 고 저렴 한 수행 하 고는 electroporator와 같은 특별 한 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 세균성 활용의 고효율 대용량 라이브러리에 대 한 허용 (&#62; 2 x 105 독특한 삽입) 하룻밤 세균성 문화6의 단지 몇 밀리 리터 (mL)와 함께 달성. 프로세스는 약 두 시간의 실습 보육에 대 한 시간 함께 하 고 박테리아의 성장을 걸립니다. Langridge 외. 14 라이브러리를 만드는 transposon mutagenesis는 크기의 것과 유사한 130 electroporations 수행을 보고 설명 여기8, 단일 활용으로 이루어집니다. 130 electroporations 사용 하 여 electrocompetent 세포의 노동 집중 하 고 시간이 걸리는 준비와 많은 비싼 물질 (예, electroporation 큐 벳), 비용의 이상의 $1000 달러 혼자 소모품에 사용 해야합니다. 다른 연구10 사용 유사한 방법, 그러나 다른 세균성 긴장, 및 달성된까지 작은 라이브러리 크기 (5 x 104 콜로 니 형성 단위) 보다 여기에서 보고 된.
기증자 스트레인에 노트: 여기 사용 기증자 변형 대장균 스트레인 BW2076715 pJA1 transposon 플라스 미드16를 포함 하는. 스트레인 BW20767 pJA1 플라스 미드의 양도 매우 효율적인 다른 긴장을 단백 결합 수 있습니다. 또한, 중요 한 것은, BW20767는 람다 pir +. 앞에서 설명 했 듯이, 플라스 미드 pJA1는만 람다 pir 유전자 포함 된 긴장에 유지 될 수 있다. 이 긴장 대 이며 암 피 실린 내성입니다. PJA1 플라스 미드 암 피 실린 저항 마커를 포함 하 고 대 저항 마커는 transposon 포함. 이 긴장에서 100 µ g/mL 암 피 실린을 사용 하 여 플라스 미드에 선택과 성장 이다. 그것은 또한 constitutively 표현 transposase 유전자를 품고 다른 긴장을 안정, 알려져 있다 지적 가치가 및 transposase 사용 하는 동안 여기에서 유도할 수 있는 제어, 새 식의 낮은 위험이 남아 있다. 이러한 이유로, 그것은 좋습니다이 긴장의 통과 최소화 해야 하 고 신선한 행진 각 새로운 라이브러리 준비에 대 한 고정 된 문화에서가지고 야 한다. 여기에 사용 되는 기증자 스트레인 요청 시 우리 연구소에서 제공 됩니다.
받는 사람 스트레인에 대 한 정보: 받는 사람 부담 선택, S.flexneri (또한, 토론 참조)의 변종 대장균 의 K12 파생 실험실 긴장 등의 변형 수. 기증자 스트레인에 대 한 선택할 수 있도록 받는 사람 긴장 대 저항, 그는 추가 항생제 저항 표식이 있어야 합니다. 받는 사람 스트레인에 대 한 대장균 MG1655 긴장 여기 소개 자연 nalidixic 산 돌연변이 함께 사용 됩니다. 자발적인 nalidixic 산 돌연변이 30 µ g/mL에서 nalidixic 산을 포함 하는 접시에 200 µ L aliquots에서 하룻밤 문화의 2 mL에 밖으로 도금에 의해 선정 되었다. MG1655의 단일 복제 받는 사람 긴장 되기 nalidixic 산에 저항 했다 선정 됐다. 또한, 위에서 설명한 대로 받는 사람 부담 람다 pir 부정 되어야 합니다.
개요: 세균성 활용 자리를 차지 하 고 pJA1 플라스 미드는 받는 사람 긴장으로 기증자 스트레인에서 이동, 미디어 IPTG의 추가 것의 표현을 유도 IPTG-유도할 수 있는의 통제, tnp 유전자 lacIq/Ptac 발기인 (그림 1). PJA1에 tnp 유전자 돌연변이 transposase 핫스팟6,,1011에 삽입의 낮은 주파수를가지고 이다. 추가와 IPTG와 유도 transposon는 활성화 하 고 게놈에 무작위로 삽입. 플라스 미드는 람다 pir 받는 긴장에 유지 될 수 없습니다 하 고 손실 됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td></tr><tr><td>Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td><td>GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &amp;times; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td></tr><tr><td>Metal Forceps, sterile</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&amp;nbsp; 12.5 mL working volume.</td><td>Interlab New Zealand</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>Sterile glass spreaders</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>NZNZSPREADER</td><td>Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td></tr><tr><td>Sterile glass beads</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>HERE1080603</td><td>Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td></tr><tr><td>Nalidixic acid (optional)</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA0839.0025</td><td>prepare according to manufacturer recommendation</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside)&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher New Zealand</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar granulated</td><td>Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base (Miller&#039;s LB Broth Base)</td><td>Thermofisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol bidistilled 99,5 %</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropelene sterile conical vials&amp;nbsp;</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator at 37C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave for sterilizing media&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

Transposon mutagenesis는 transposon 라는 DNA의 조각의 무작위 게놈 삽입을 통해 유전자 중단을 허용 하는 방법입니다. 프로토콜 아래 대 저항 마커를 포함 하는 transposon 은닉 하는 플라스 미드의 세균 변종 사이의 높은 효율 전송 하는 방법을 설명 합니다. 플라스 미드 부담 transposase 변형 tnp 유전자는 transposon 매우 낮은 insertional 바이어스 받는 사람 긴장의 게놈으로 삽입 하 여 인코딩됩니다. 이 메서드는 따라서 있는 transposons 대장균 또는 Shigella flexneri 박테리아의 받는 사람 부담에 독특한 게놈 위치에 삽입 된 큰 돌연변이 라이브러리의 생성을 수 있습니다. 세균성 활용, electroporation 또는 화학 변환 같은 다른 방법에 반대를 사용 하 여 독특한 클론의 수천의 수백을 가진 큰 라이브러리를 만들 수 있습니다. 이 비 필수적인 유전자에 있는 모든 4-6 기본 쌍으로 자주 발생 하는 삽입 된 고밀도 삽입 라이브러리를 생성 합니다. 이 메서드는 다른 방법에 우수한 조밀한 transposon 삽입 도서관의 창조에 대 한 저렴 한, 사용 하기 쉬운 고 능률 방법에 대 한 수 있습니다. 유전 상호 작용 네트워크, 유추 (Tn-Seq), 연속 transposon 같은 다운스트림 응용 프로그램 또는 더 간단 하 게, mutational transposon 라이브러리를 사용할 수 있습니다 (앞으로 유전) 화면.

18 시간 후 성장, 번호판 식민지 크기의 다양 한 많은 식민지를 포함 한다 (그림 3). 다른 식민지 크기 다양 한 피트 니스의 클론을 나타냅니다 그리고 프로토콜 왔다 좋은 징조. 기증자와 받는 사람 컨트롤 플레이트에 성장이 있어야 합니다. 위의 프로토콜을 사용 하 여 이상의 2 x 105 콜로 니 형성 단위 (CFU) 항복 한다. 한 번에 5 복제 활용형을 프로토콜 확장 약 1 x 106 CFU 항복 한다. 이전 작업에서 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석을 확장된 라이브러리 양보 해야 표시 &#62; 2 x 105 독특한 삽입6. 매우 높은 CFU (즉, 1 x 106 CFU)에서 독특한 삽입의 속도으로 예상 된다 고원, 모든 사용 가능한 (사소한) 삽입 표시 될.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
그림 1 : 세균성 활용 및 염색체로 transposon의 삽입의 도식. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
그림 2 : Vortexing 전후 파운드 미디어에서 submersed 필터의 이미지. Vortexing, 전에 셀 필터에 붙어있는 고 언론은 분명 하다. Vortexing, 후 미디어 셀 필터 떨어져와 서 하 고 미디어에 흐린 된다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
그림 3 : (A) 후 성장의 18 h transposon 라이브러리의 대표적인 접시. (B) 가까이 식민지 크기의. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

15.8K 조회수.  Massey University. 여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

비디오: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

연구

유전학

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

생체공학

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

면역학 및 감염병학

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

생성<em&gt; 엔테로 박터</em&gt; SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

생물학

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.