단일 분자 힘 분광법은 우리가 힘으로 단 하나 분자를 조작할 수 있게 함으로써 원자 규모의 분자 생물학에 대한 엄청난 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 원자력 현미경을 사용하여 일정한 속도 측정을 보여줍니다. 우리는 궁극적으로 단백질 안정성, 전개 속도 및 전개 경로를 결정하기 위해 데이터를 사용할 수 있습니다.
절차를 시작하려면 비전도성 접착제 탭을 15mm 너비의 깨끗한 철 디스크에 부착합니다. 커버 시트를 제거하고 깨끗하고 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 노출된 접착제에 단단히 누릅니다. 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 슬라이드를 보관합니다.
다음으로, 정제된 다단백을 원심 필터에 농축한 다음 컬럼을 반전시키고 단백질을 실험에 사용되는 완충제로 엘류한다. 280 나노미터의 흡광도에 기초하여 적절한 단백질 농도를 결정한 다음 단백질의 밀리리터 용액당 100 마이크로그램의 100 마이크로리터를 준비합니다. 단백질 용액의 60 마이크로리터 드롭을 슬라이드 중앙에 적용합니다.
이 실험 중에 제어되지 않은 샘플 움직임으로 이어질 것이기 때문에 액체가 슬라이드와 철 디스크 사이에 미끄러지지 않도록주의하십시오. 샘플이 실온에서 최소 10분 동안 앉게 하십시오. 먼저, 캔틸레버를 끝까지 조심스럽게 집어 들고 있는 프로브에 놓습니다.
캔틸레버가 단단히 앉는지 확인합니다. 그런 다음 보유 셀을 AFM 헤드에 놓습니다. 반전 된 현미경 단계에 머리를 설정하고 레이저에 전원을 공급하기 위해 AFM 헤드에 배터리 팩을 연결합니다.
모니터 또는 TV 화면에서 레이저 빛을 시각화하기 위해 현미경 검출기에 대한 카메라를 설정합니다. 현미경에 의해 유도, 그것은 캔틸레버 팁에 지시 되도록 레이저를 배치. 샘플이 준비되면 실험 버퍼10 마이크로리터를 프로브 홀딩 셀의 각 포트에 플러시합니다.
샘플 슬라이드에서 약 40 마이크로리터의 유체를 데수하고 40 마이크로리터의 버퍼를 추가합니다. 한편, 측정을 위한 원자력 현미경을 준비하기 시작한다. 먼저, 슬라이드를 압착 모터 위에 놓습니다.
AFM 스테이지가 높은 위치에 있는지 확인한 다음 샘플 액적 위에 캔틸레버를 사용하여 AFM 헤드를 무대에 배치합니다. 다음으로, AFM 포토다이오드 앞에 작은 종이를 놓습니다. 용지의 반점이 밝고 집중될 때까지 레이저를 조정한 다음 용지를 제거합니다.
포토디오드에서 신호를 보려면 AFM 소프트웨어를 시작합니다. 4개의 포토다이오드 사분면에서 레이저 신호가 최대화되고 상단과 하단 사분면 쌍 사이의 다른 신호가 0이 되도록 AFM 헤드 미러를 조정합니다. AFM 보정을 시작하려면 AFM 헤드 신호의 필터 설정을 전체 대역폭으로 전환하고 압착이 꺼져 있는지 확인합니다.
AFM 소프트웨어에서는 계산당 1, 024 데이터 포인트로 전력 스펙트럼의 평균 512 계산을 측정합니다. 캔틸레버의 주요 진동 모드에 해당하는 첫 번째 피크에 걸쳐 전력 스펙트럼 밀도를 통합합니다. 다음으로, 압전 컨트롤러를 켜고 필터를 500 Hertz로 설정합니다.
다른 신호를 모니터링하는 동안 신속하게 AFM 헤드를 수백 마이크로미터 아래로 이동합니다. 다른 신호에서 일관된 점프를 보면서 한 번에 수백 마이크로미터 아래로 머리를 계속 움직입니다. 신호 점프가 높이가 증가하기 시작하면 팁이 샘플 표면에 매우 가깝습니다.
변압 신호가 표면과의 팁 접촉 시 포화되면 머리를 약간 올린 다음 압전 전압을 조정하여 AFM 헤드를 100~ 5, 000 나노미터로 위아래로 이동하여 샘플 표면을 찾습니다. 그 후, 팁이 표면에 닿을 수 있도록 약 500 나노미터의 스캔 크기로 당기는 실험을 실시하거나 약 100 나노미터의 압조 모터 이동을 수행한다. 결과를 사용하여 스프링 상수 및 감도를 계산합니다.
소프트웨어에서, 전개 폴리 단백의 총 이론적 크기보다 40 % 더 큰 스캔 크기를 설정합니다. 캔틸레버를 배치하여 스캔 크기의 80%가 표면에서 멀리 떨어져 있도록 합니다. 스캔 속도를 초당 300 나노미터로 설정합니다.
당기는 실험을 수행하고 결과 압전 위치와 포토다이오드 신호를 측정합니다. 측정 전반에 걸쳐 시간당 유체 세포에 실험 버퍼를 추가하여 샘플이 건조되지 않도록 합니다. I91 폴리단백질과 3개의 I91 도메인이 양쪽에 NI10C 분자를 측면에 있는 다단백의 기록에서 전개되는 사건은 웜과 같은 체인 모델이 장착되었습니다.
두 녹음 모두 I91의 특징적인 힘과 윤곽 길이 증가가 AFM 교정이 성공적이었음을 나타냅니다. N110C 분자를 포함하는 다단백의 기록은 새로운 사건이 전개관심의 단백질로부터 이었다는 것을 확인하기 위하여 충분한 I91 사건을 보여주었습니다. 안키린 반복의 평균 윤곽 길이는 약 10.5 나노미터였으며, 전개되는 힘은 8~25피코뉴턴 사이였다.
측면 단백질의 전개 이벤트가 단일 분자 이벤트를 지문에 긍정적 인 제어를 제공하기 때문에 다단백을 사용하는 것이 필수적입니다. 이없이, 데이터는 오해에 대한 책임이 있습니다.
