Name: a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
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우리 초기 계측 설치 및 테스트에 대 한 토니 Kulesa, 로빈 캠프 및 Evangelos Gatzogiannis 감사합니다. 우리는 더 상당한 도움 작성 하 고 평가 하는 소프트웨어를 추적 하는 사용자 지정된 단일 입자에 대 한 토니 Kulesa을 감사 합니다. 이 작품 시작 자금과 경력 수상 버로우즈 Wellcome 재단에서 (PCB)에 과학적인 인터페이스에 의해 지원 되었다.

1. biotin-λ-DNA의 준비 참고: Biotin-λ-DNA 분자는 5 biotin 표시 oligonucleotide ligating 준비 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20-비오 틴-3 &#39;를 Λ-DNA 분자 20.
<ol><li>준비 0.1 m m biotin 테 버퍼에 올리고 표시.</li>
	<li>60 65 ° C에서 열 0.5 mg/mL λ DNA 주식 s, 그리고 젖은 얼음 바로 뛰어들. 
	참고: λ DNA concatemerization 감소 빠른 냉각 냉각.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브에 λ-DNA 솔루션의 피펫으로 100 µ L.</li>
	<li>테 버퍼의 9 µ L로 0.1 m m oligo의 추가 1 µ L.</li>
	<li>Λ-DNA를 포함 하는 microcentrifuge 관을 올리고 솔루션의 추가 2 µ L. 철저 하 게 혼합. 
	참고: Oligo는 보완 λ-DNA 끝에 약 12-fold 어 금 니 과잉에.</li>
	<li>60 65 ° C에서 λ-DNA/올리고 혼합물이 열 s.</li>
	<li>천천히 차가운 실내 온도에 혼합물. 
	참고:이 단계 보완 λ-DNA 끝에 anneal를 올리고 있습니다.</li>
	<li>얼음에 있는 혼합물을 놓습니다. T4 DNA 리가 반응 버퍼의 11 µ L 추가 (최종 버퍼 농도 1 x). 부드럽게 혼합. T4 DNA 리가 효소의 2 µ L (800 단위)을 추가 합니다. 부드럽게 혼합.</li>
	<li>2 시간 또는 하룻밤 4 16 ° C에 대 한 혼합물을 품 어 ° c.</li>
	<li>100 kDa의 공칭 분자량도 원심 필터 튜브를 사용 하 여 제품을 정화. 특히, 원심 필터 튜브와 5 분 14000 x g에서 원심 분리기로 단계 1.9 혼합물을 전송, 400 µ L TE 버퍼 두 번 세척 및 정제 제품 수집. 
	참고:는으로 정화 biotin-λ-DNAs 테 버퍼에는-20 ° C에서 안정적인 최대 1 년.</li>
</ol> 2. Coverslip 기능화 참고: 유리 coverslips는 기능성 실 란-말뚝-biotin 반응 하 여. 이 1 단계 반응이 프로토콜은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 우리의 경험에서 표준 2 단계 반응 프로토콜 20 보다 더. Silane-말뚝-biotin과 Coverslip 기능화 streptavidin 바인딩 사이트 만들고 일반적인 DNA 및 단백질 흡착 coverslip 표면에 최소화.
<ol><li>Sonicate 5 no. 1 coverslips 한 얼룩 내부 95% 에탄올에 10 분 동안 자 고 다음 세 번에 대 한 초순 수 린스. 
	참고: 다섯 번째 coverslip 파손 시 예비를 제공 합니다.</li>
	<li>얼룩 항아리 1 m 코, 10 분 동안 sonicate를 다음 세 번 초순 물으로 린스.</li>
	<li>2.1-2.2 주기 두 번 반복.</li>
	<li>건조 깨끗 하 고 마른 N 2 가스 흐름 아래 coverslips.</li>
	<li>더 깨끗 하 고 건조 일 분에 대 한 900 mTorr의 압력에서 공기 플라즈마 처리를 적용 하 여 coverslips</li>
	<li>25 mg/mL silane-말뚝-biotin 특별히 2 헤에 대 한 실 온에서 95% 에탄올에 용 해 된 coverslips를 품 어, 두 개의 깨끗 하 고 마른 coverslips, 사이 50 µ L silane-말뚝-biotin 솔루션 샌드위치와 coverslip 품 어 &#34; 샌드위치 &#34; (coverslips) 접촉 하지 하단에 물 약 10 mL와 함께 닫힌된 피 펫 팁 상자 안에 용 매 증발을 최소화 하기 위해.</li>
	<li>씻어 초순을 못 코팅 아래 coverslips 청소와 초과 못 분자 N 2 가스 흐름 건조. 
	참고: 기능성된 coverslips 저장 될 수 있다 주위 조건 하에서 3 일.</li>
</ol> 3. 흐름 세포 건설 참고: 흐름 세포 사이 사이의 미리 잘라 채널 이중 접착 테이프에 의해 생성 되는 페그 기능성 coverslip 및 PDMS 슬 래 브 인 레트와 출구 구멍을 포함 하. 여러 채널은 흐름 세포 당 통합.
<ol><li>CAD 소프트웨어에서 흐름 채널을 디자인 하 고 테이프 커터를 사용 하 여 이중 접착 테이프 (폭, 깊이, 각 채널의 길이 1, 0.13, 12 m m, 각각) 채널을 잘라 (일반적으로 8 채널은 통합 흐름 셀 당). 흐름 채널 테이프 오차 제거.</li>
	<li>PDMS 석판을 철저 하 게 혼합 5 g (12-5mm 두꺼운 PMDS 석판 주변 조건에서 무기한 저장할 수 수를 만들기 위한 충분) 가교 시 약의 PDMS의 45 g 2 10 cm 배양 접시에 혼합물을 부 어 믹서를 사용 하 여, 그리고 두고는 기본적으로 모든 공기 거품 때까지 진공 챔버 내부 요리가 사라 (수동으로 제거 공기 방울 어떤 요리는 진공 약 실에서 제거 될 때 남아 있는 경우). PDMS 굳은 (약 2 시간)까지 80 ° C 오븐에 요리 전송.</li>
	<li>미리 잘라 채널 이중 접착 테이프의 크기와 일치 하는 PDMS 석판을 잘라. 껍질 1 보호 필름 이중 접착 테이프와 필름 PDMS 슬 래 브의 평평한 얼굴을 준수. 23 게이지 바늘 생 검은 구멍 펀칭기를 사용 하 여 PDMS 슬 래 브에 출구와 입구 구멍을 펀치.</li>
	<li>껍질 이중 접착 테이프에서 두 번째 보호 필름 및 준수는 coverslip의 기능성 표면 PDMS 테이프 어셈블리 (는 coverslip 평평 있는지 확인 합니다. 그림 1a에서 완벽 하 게 조립된 흐름 셀의 그림 참조).</li>
</ol> 4. TIRF 이미징 참고: Biotin-λ-DNAs는 흐름 채널 표면에 닿는 곳에 및 층 류 흐름에 적용 됩니다 흐름 스트레칭 DNA 분자 ( 그림 1b). &#62; 80% 붙일 레이블된 분자의 바인딩 및 수송 활동을 관찰에 대 한 공간적 확장 템플릿으로 DNA 분자 서브를 뻗어. 단일 분자의 궤도 추적 경과 TIRF 이미징 하 여 ( 그림 1 c &#38; e).
<li>수정 현미경 스테이지 및 부하 미리 degassed 빈 버퍼 (10 m m 인산 나트륨, 2 m NaCl m, 50 µ M EDTA, 20mm 에탄올 5% (v/v) 글리세롤, 0.01% 트윈 20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4)에 흐름 셀 <ol>0.2 mg/mL streptavidin 솔루션, 1 mg / mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션 및 각각 Tygon 튜브 솔레노이드 값에 연결 되어 있고 다른 Tygon 튜브 작은 픽 튜브 (이상 Tygon 튜브를 sleeving 여 엿 봄 배관에 연결 된 4 개의 저수지로 100 오후 biotin-λ-DNA 솔루션 시 약의 역류 방지). 진공에 하룻밤 노출 또는 진공 교 반 (때까지 거품이 더 이상 볼 수 없습니다)와 짧은 노출에 의해 버퍼의 작은 볼륨 드.</li>
	<li>빈 버퍼 저수지의 엿 봄 배관 흐름 셀의 한 입구 구멍 삽입. 빈 버퍼에서 흐르는 채널 프라임 고 입구 구멍 각 시 약의 흐름을 구동 공기 압력 솔레노이드 밸브에 의해 제어와 완전히 컴퓨터 스크립트를 통해 자동으로 다른 3 픽 튜브를 삽입 합니다. 채널에서 공기 거품 형성을 유발 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>는 Tygon 튜브 콘센트 구멍에서 짧은 픽 튜브 폐기물 컨테이너를 연결합니다. 콘센트에 짧은 픽 튜브 채널 안에 긍정적인 압력을 유지 하 여 주입 하는 동안 공기 거품 형성을 억제 도움이 됩니다.</li>
	<li>흐름 채널 표면에 biotin-λ-DNA 분자 tethering.
	<ol><li>흐름 0.2 mg/mL streptavidin 솔루션, 5 분 동안 품 어 하 고 다음 언바운드 streptavidin를 빈 버퍼에서 흐름.</li>
		<li>흐름 1 mg/mL BSA 솔루션에 1 분 동안 품 어 그리고 다음 언바운드 BSA를 빈 버퍼에서 흐름. 
		참고: 추가 BSA 억제 DNA 및 샘플 표면에 흡착.</li>
		<li>흐름 100 오후 biotin-λ-DNA 솔루션, 10 분 동안 품 어 고 다음 언바운드 DNAs를 빈 버퍼에서 흐름. 
		참고: DNA 표면에 바인딩되어, 후 방지 테더 DNA 분자에 손상을 방지 하기 위해 빠른 흐름.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>기능성된 coverslip의 품질을 확인 하려면 DNA에 Sytox 같은 염료 시험 조건 하에서 주황색 얼룩 사용 될 (4.6 아래 읽기) 흐름과 형광 이미징 아래 532 nm 레이저 조명 시작. 
	참고: 기능성된 coverslip의 품질은 일반적으로 좋은 하 고 뻗어 흐름 DNA 분자의 밀도 높을 것 이다. DNA 바인딩 및 슬라이딩/1 D 보급 이벤트를 관찰할 수 있다 흐름 뻗어 DNA 분자의 높은 밀도가지고 필수적입니다.</li>
	<li>벌금 최고의 신호 대 잡음 비 뻗어 DNA 분자 ( 그림 1의 d)의 이미지를 달성 하기 위해 TIRF 각도 조정.</li>
	<li>단일 분자 DNA를 따라 이동의 궤적을 기록 (염료를 착 색 하는 DNA의 경우) 없이 새로운 채널 내부 단계 4.2-4.4 반복 다음 달 미리 degassed 하위 nanomolar fluorophore는 주사기 펌프를 사용 하 여 충분히 높은 흐름 율에 분자를 분류 하 고 100 Hz의 프레임 속도와 경과 형광 이미지 수집. 
	참고: 흐름 속도 Weissenberg 수와 동일 (Wi: 긴 폴리머 휴식 시간-약 0.2의 치수 제품 λ-DNA-고 전단 속도-coverslip 표면에서 거리와 흐름 속도 변화에 대 한 s) 안으로 500의는 채널 100 Hz 21의 프레임 속도와 단일 분자 이미징에 대 한 것이 좋습니다.
	<li>수집 10000 프레임 생산 하는 영화 고 샘플 당 여러 (일반적으로 10) FOVs에서 비슷한 영화를 수집 한 보기 필드 (FOV)를에 <ol>. 
		참고: 한 FOV에 단일 입자의 밀도 이어야 한다도 너무 높은-는 DNA에 단일 분자 이벤트의 낮은 발생으로 이어질 수 있습니다 모호 하거나 너무 낮은-프레임 개체 할당 함으로써 데이터 분석을 복잡 하 게 합니다.</li>
		<li>최적화 조명 강도 coverslip 표면에 바인딩된 분자 긴 궤적을 감지할 수 있도록 분자 DNA에 확산은 너무 빨리 표백 하지 하는 동안 백그라운드를 억제를 신속 하 게 사진 표백. 
		참고: 우리가 일반적으로 사용 하 여 200-800 W/c m 2 전력 밀도 FOV에.</li>
	</ol></li> <li>4.6 단계의 끝에, DNA DNA 분자 흐름 뻗어 수 아직도 있습니다 확인를 얼룩 염료를 달 이다.</li>
	<li>실행 모두 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 샘플. 
	참고: 좋은 긍정적인 컨트롤은 tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR는 N 맨끝 아민에 결합)는 10.5 ± 0.7 (표준 오차) M의 평균 1 일 확산 상수는 (bp 2/s) 중립 pH 11에서. 좋은 부정적인 제어 채널을 아무 DNA에 DNA 보급 활동이 탐지는 곁에 분석 결과 버퍼의 레이블된 샘플을 측정 하는.</li>
</ol> 5. 데이터 분석: 참고: 사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어는 단일 분자 DNA를 따라 확산의 궤적을 확인 하 고 확산 상수를 추정 하는 데 사용 됩니다. 이 소프트웨어는 먼저 높은 정확도 가진 단일 입자의 중심 위치 coverslip 표면에 붙어 입자를 식별 하 고 다음 시간 경과 궤도를 다른 프레임에 입자를 링크를 결정 합니다. 이러한 궤도에서 1 D 확산 상수 추정 됩니다.
데이터 분석 시작 스크립트 소프트웨어를 열고를 <ol><li>(재료의 표 참조) 단일 입자 추적 소프트웨어의 디렉토리에가 서. 라는 스크립트를 열고 &#34; largedataprocess3.m &#34;. 정의 되어야 한 중요 한 매개 변수는 단일 입자 검출을 위한 임계값 값.</li>
	<li>최적의 임계값 값을 확인 하려면 실행 된 &#34; Determine_threshold_value.m &#34; 스크립트. 이 스크립트는 임계값 값 단일 입자 감지에 미치는 영향을 나타낼 것 이다. 최적의 임계값 값을 결정 한 후 실행에 &#34; largedataprocess3.m &#34; 재구현</li>
	<li>단일 입자의 완료 후 분석, 추적 필터링 원시 궤적 실행 하 여는 &#34; Trajectory_filtering.m &#34; 스크립트. 필터링 단계를 시각화 하기 위해 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 만들어집니다.</li>
	<li>GUI에 패널, 2 픽셀에 따라 DNA, MinXDisp, 최소 변위를 설정, 최대 변위 가로 dna, MaxYDisp, 2 픽셀로 설정, 10 프레임, minFrames, 최소 수를 설정, 세 개, minTriplets의 국가의 최소 수를 설정 10; 0; DNA, D_par에 따라 최소한의 확산 상수 설정 설정 최대 예상된 확산 상수 가로 dna, D_trans, 10 M (bp 2) S -1; -5; 치 2 _stat, 최소한의 통계 매개 변수 설정 2 dna, 할 망 구/Y, 그 가로 DNA 따라 변위의 최소 비율 설정. 
	참고: 이러한 매개 변수를 필터링을 통과 하는 모든 원시 궤도 표 1에 나열 되 고 하지 않는 표 3에 나열 된.</li>
	<li>클릭 궤적에 번호 표 1에, 궤적 그래픽 1에 전치 될 것입니다 &#38; 2. 클릭은 &#34; 재생 &#34; 원시 형광 이미지를 재생 하는 버튼. 클릭은 &#34; Add_to_Table2 &#34; 단일 분자 궤도 슬라이딩으로 궤적을 확인 하. 결국, 모든 궤도 테이블 2에 추가 저장 됩니다 GUI를 닫을 때.</li>
	<li>의미 확산 상수를 계산 하는 스크립트 실행 &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. 말은 확산 상수 모든 필터링 단계를 통과 하 고 표 2에 추가 된 궤도의 세트에서 추정 된다.</li>
</ol>

<ol>
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Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates.</a> J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).</li><li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+II.+Adenovirus+proteinase+is+activated+in+an+unusual+one-dimensional+biochemical+reaction.">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction.</a> J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).</li><li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space:+I.+binding+to+DNA+and+to+hexon+of+the+precursor+to+protein+VI,+pVI,+of+human+adenovirus.">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus.</a> J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).</li><li>Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+TALE+protein+dynamics+reveals+a+two-state+search+mechanism.">Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism.</a> Nat Commun. 6, 7277 (2015).</li><li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE+proteins+search+DNA+using+a+rotationally+decoupled+mechanism.">TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism.</a> Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

광범위 한 연구소는 여기에 제시 된 작품의 측면을 포함 하는 파일 특허 응용 프로그램을 선택할 수 있습니다.

1 단계 반응 프로토콜을 전통적인 2 단계 coverslip 기능화 반응 프로토콜에서 전환할 때 우리는 coverslip 기능화의 안정성이 크게 향상 됩니다 것으로 나타났습니다. Coverslip 준비에 대 한 총 실습 시간 30 분 미만으로, 계획은 각 주 단일 분자 이미징 신선한 coverslips를 준비 하는 것이 좋습니다. Silane-말뚝-비오 틴의 저하를 최소화 하기 위해 시 약 aliquoted 및 접수-20 ° C에서 건조 N2 가스 아래 저장 해야 합니다. 여기 못 분자-- 쿠를 생성 하는 또는 과거20에 사용 된 채널3 터미널 그룹을 사용 하지 마십시오. -- 쿠 그룹 및 소수 채널3 그룹의 부정적인 요금 각각 표면에 DNA 분자와 특정 단백질 샘플의 일반적인 흡착을 방지 하기 위해 활용 했다. 우리 완전히 biotin 종료 말뚝 표면에 작은 펩 티 드 샘플에 의해 매우 낮은 표면 흡착 관찰 실-말뚝-COOH 또는 silane PEG 채널3 특정 단백질 견본의 분석에 유용할 수 있습니다 또는 때 시험의 조건 (pH 등 &#60; 7.5) DNA-표면 상호 작용을 촉진 합니다.
PDMS 흐름을 유리 슬라이드 흐름 셀에서 shift 셀 속도 흐름 셀 구조를 하 고 여러 채널의 쉬운 통합을 허용 한다. 우리는 종종 기능성된 coverslip 당 8 개의 독립적인 실험 수 있도록 흐름 셀 당 8 채널 엔지니어. Coverslip 당 처리량을 더욱 높이기 위해 마이크로 조작 채널의 더 큰 숫자를 사용할 수 있습니다.
그것은 초기 작성 후 언제 든 지 채널 내부 공기 거품 형성을 방지 하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 기포 발생 하지 않는 테더 DNAs의 손실 (비록 이것이 가능), 하지만 오히려 흐름을 방해 하 고 가능성이 발생할 DNAs는 coverslip에 충실. 버퍼 degassing 및 작은 계면 활성 제 수량 추가 일반적으로 튜브와 흐름 채널 내의 거품 형성 방지에 효과적입니다. 어디 공기 방울 튜브를 도입 하는 경우에 하려고 느린 흐름에서 밖으로 거품을 제거 하 고 그들이 DNAs는 테더 링 하는 영역을 통해 흐름 하지 않습니다 있는지 확인 합니다.
간소 하 고 효율적인 데이터 분석 소프트웨어는 생성 된 데이터의 엄청난 금액으로 인해 중요 한. 우리가 일반적으로 우리의 사용자 정의 단일 입자 쿼드-코어 프로세서와 32 Gb 메모리와 데스크톱 컴퓨터에 1 일 안에 추적 소프트웨어를 사용 하 여 처리할 수 있는 하나의 흐름 셀에 측정에서 700000 고해상도 이미지를 수집 합니다. 소프트웨어 (단계 5.5) 1 D 확산 궤적을 탐지의 거짓 긍정적인 평가 샘플 종속 이며 주어진 매우 낮은 수: 1)는 FOV에 단일 입자의 밀도 충분히 낮은 프레임 (전체 입자를 연결 하는 작은 모호성이 단백질 견본 일반적 펩 티 드 샘플 보다는 coverslip로 일반적인 흡착 하는 경향이 있으며 따라서, 버퍼 및 각 단백질에 대 한 전력 밀도 샘플 최적화가 필요); 2) 단일 입자의 잡음 비율로 신호는 충분히 높은 입자의 false-식별의 가능성은 낮다. 하지만, 소프트웨어는 가끔 실수를 할 수 있습니다 그리고 소프트웨어 성능을 평가 하기 위해 제공 된 GUI를 사용 하 여 데이터의 수동 검사 것이 좋습니다. 허위-긍정 궤적 탐지에 특히 민감한 응용 프로그램 프로세스 매개 변수 임계값, minFrames, minTriplets, 및 치2_stat을 포함 하 여 설정할 수 있습니다 더 엄격 하 게 진정한 바인딩에 대 한 더 낮은 감도 비용 이벤트와 궤적 식별에 잠재적으로 큰 통계 편견. 여기에 우리가 공유 하 고 우리의 단일 입자 추적 데이터 분석 방법 표준화 및 모범 사례에 대 한 토론을 자극 도움의 희망으로 소프트웨어를 설명.
그들은 도약 메커니즘에 의해 확산 또는 이미징 DNA 템플릿 분자의 기지개 된 상태를 유지 하는 동안 지속적인 흐름을 요구 한다, 우리의 프로토콜에서 유체 흐름 DNA 서식 파일에 따라 어떤 단백질의 수송 바이어스 수는 유체 레이블이 fluorophore의 반지름은 큰22,23입니다. 이러한 바이어스 측정 하 고 대부분의 데이터 집합에서 수정 수 있습니다, 하는 동안 단백질의 수송 작은 fluorophore와 고 슬라이딩 메커니즘에 의해 확산 되지 일반적으로에 편향 되어 감지 범위 흐름2,4, 24. 특히, DNA에 따라 단백질의 수송에 흐름 속도의 영향 단백질 DNA23따라 확산의 메커니즘을 연구에 사용 되었습니다. A 밀접 하 게 관련 흐름의 부재에서 측정을 가능 하 게 다른 접근 활용 흐름에서 뻗어 뚜렷이 두 테르미니에서 biotin 서식 파일 DNA와 coverslip 등을 양 끝에 의해 곁에 DNA 분자에 남아 있는 확장된 구성 흐름25,26,,2728을 해제 한 경우. 이중 밧줄 접근 DNA 템플릿 분자, 밧줄, 및 두 테더 사이트 간의 거리 동안 주의 흐름 제어의 양쪽 끝을 수정 하지만 흐름 무료 전송 실험을 허용의 이점이 있다. 또한, 이기종 긴장과 단일 분자 분석 결과에 DNA 분자에서 DNA 구조적 역학의 영향을 평가 해야 합니다.
전부, 뿐만 아니라 공부 따라 DNA 분자의 1 D 보급, 단일 분자로 보고 분석 결과 많은 생체 외에서 생 화 확 적인 혜택을 받을 수와 DNA를 포함 한 단일 분자 수준에서 생물 연구 대상으로 하 여 검색 프로세스 단백질, 효소, DNA에 활동과 더.
문제 해결
문제 1: 흐름 채널 누출.
해결 방법: 먼저, 확인 하십시오 그 흐름 채널의 디자인 적어도 1.5 m m 마진 씰링 및 채널; 사이 다음, 흐름 셀의 조립 하는 동안 확인는 coverslip, 이중 접착 테이프와 PDMS 슬 래 브 사이의 접촉 표면은 평면, 건조 하 고 잔해, 물개를 형성 하는 압력은 균일, 무료 하 고 씰링 작업 실 온에서 수행.
문제 2: 테더 DNAs의 밀도 너무 낮은.
해결 방법:이 문제 못 기능화 효율은 낮은 또는 DNA 분자는 하지 기능성 비타민 b 복합체와 때 발생 합니다. 우리의 경험에서 속박 되 DNA의 밀도 높은 해야 합니다에 대 한 &#62;는 coverslips의 90% 신선한에서 준비 또는 제대로 silane-말뚝-비오 틴 시 약 저장. 경우에 때 속박 되 DNA의 밀도 biotin-λ-DNA의 입증 된 배치와 함께, DNA 테더 링 하는 동안 못 기능화와 streptavidin과 비오 틴-λ-DNA의 농도 중 실-말뚝-비오 틴의 농도 증폭 시도. 이 실패 하는 경우이 고 streptavidin 시 약 교체 합니다.
문제 3: DNAs는 coverslip에 충실 한d 흐름으로 신축 할 수 없습니다.
해결 방법: 못 기능화 효율 낮은, 낮은 분석 결과 pH에 의해 악화 됩니다 때이 문제가 발생도 수 있습니다. 시도 더 BSA에 흐르는 또는 DNA (4.3.2 단계) 표면에 흡착을 억제할 수 있도록 pH (8.0)에 예를 올리는. DNA 흡착 특정 시험 조건 하에서 지속적인 문제는를 포함 하 여 90 %silane-말뚝-COOH를 못 기능화 동안 보십시오.
데이터 분석 참고 사항:
사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용 하 여 단일 분자에서 DNA를 따라 확산의 궤적을 식별 하는 우리는 그들의 1 D 확산 상수, D1 추정. 데이터 분석, 개선 하기 위해 우리가 구현 입자 및 극적으로 타협 하지 않고 데이터 분석 빨라 1 D 확산 상수 추정을 위한 공분산 기반 견적19 지역화에 대 한 방사형 대칭 알고리즘18 정확도입니다. 우리는 이전11시뮬레이션 된 데이터 분석 하 여 사용자 지정 소프트웨어를 검증. 아래는 주요 단계를 설명 합니다.
입자 식별:
이 단계는 검색 및 입자-회절 제한 된 관광 명소-배경에서 세그먼트입니다. 첫째, 공간 대역 통과 필터링에 3-5 픽셀 범위 (는 우리의 시스템에 포인트 확산 함수의 크기에 해당) 다음 임계값 강도에 따라 입자의 신호를 향상 시키기 위해 이미지 (스크립트 참조: spt2_SD_sandbox.m).
중심 할당
픽셀 수준의 공간 해상도를 분자 localizes만 이미지를 세그먼트. 훨씬 더 높은 정밀도로 분자를 지역화 하려면 위와 같이 방사형 대칭 슈퍼 해상도 알고리즘18 이미지 필터링을 사용 합니다. (이 분석 계산 기반 방법과 크게 2D 가우스 피팅 등 다른 인기 높은 정확도 방법과 비교해 계산 부담 감소 시킨다 (스크립트 참조: spt2_SD_sandbox.m).)
입자 추적:
그들은 프레임 간의 이동 시간을 통해 입자의 궤적을 추적, 우리는 다시 동일한 입자를 식별 해야 합니다. 우리는 궤적의 구성 요소를 시작, 깜박임, 및 종료 단계를 고려 하십시오. 우리는 현재 프레임 이전 프레임에 프레임 마다 허용 하는 최대 변위에 의해 나타나는 그 입자의 결합을 제한 합니다. 여러 연계 가능한 경우에서 Jonker Volgenant 알고리즘을 세계적으로 최적의 링크 세트를 사용 (스크립트 참조: traceTraj4_kx.3.m).
D1 추정:
궤도에서 D1 값을 추정, 우리 공 기반 견적 (CVE)19을 사용 합니다. 분석 계산을 바탕으로,이 방법은 계산 더 효율적 이며 통계적으로 다른 보다 엄격한 통용 평균 제곱된 변위의 회귀 같은 방법 (스크립트 참조: runspt5_SD.m).
궤적 필터링:
일부 궤도 표면 바인딩된 분자 결합 등의 아티팩트를 포함 하 고 제거 해야 합니다. 우리 DNA, dna, 궤적, triplet 연속 감지 위치 및 최소 확률 점수 (참조 Xiong 외11의 최소한의 최소한의 길이 가로 최대 변위를 병렬 최소 변위와 같은 여러 기능을 구현 정의 대 한) 그 궤적을 나타내는 분자 DNA에 확산 가능성이 최소한 편견된 집합을 필터링 할 수 있습니다 (스크립트 참조: sptViewFig2_update3x.m).

생물학에서 오랫동안 문제는 어떻게 내 생 단백질 특정 행동을 게놈에서 사이트 신속 하 게 생존 하 고 환경에 효과적으로 대응 유기 체에 대 한 그들의 DNA 목표를 찾을 수 있습니다. 지난 40 년 동안 연구 하 고 DNA의 활동 단백질에 의해 검색 대상 가설에 의해 가속 될 수 있다 지원 크게 촉진 된 유포는 단백질 대량에서 3D 보급와 번갈아 1 D 보급 (포함 슬라이딩 및 프로세스를 호핑) DNA1따라. 그것은 지금 많은 단백질 유전자 규칙, 핵 산 물질 대사, 및 기타 프로세스에 관련 된 DNA2,3,,45,6,7에 슬라이딩 할 수 있다 알려져 ,,89. 또한, 최근 연구 보고는 작은 펩 티 드 수 바인딩할; 화물을 운반 하는 기능, DNA에 슬라이드 예를 들어 단백질 분자 또는 DNA10,11,12,,1314따라 PCR 뇌관.
지난 15 년 동안 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과 바인딩 및 DNA2,,1516함께 분자의 확산 연구를 널리 사용 되었습니다. 이 유형의 분석 결과에서 biotinylated 이중 가닥 DNA 분자는 표면에 움직일 수 및 층 류 흐름에 적용 됩니다 흐름 스트레칭 DNA. &#62; 80% 뻗어 DNAs 서브 fluorophores로 표시 하는 분자의 바인딩 및 수송 활동 공부에 대 한 공간적 확장 템플릿으로 DNA 따라 단일 분자의 궤도 시간 경과 형광 영상에 의해 추적 됩니다. 재현성 및 사용의 용이성에 최적화 된 우리의 구현에서이 분석 결과 5 개의 주요 단계로 구성 됩니다: biotin-λ-DNA, coverslip 기능화, 흐름 셀 건설, 형광 이미징 및 데이터 분석의 준비. 이전 프로토콜17, 유리 coverslips 했다 공업화 첫 번째 반응 (3-Aminopropyl)와 triethoxysilane (항)에 의해 그리고 아민 반응 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 시 약 (예를 들어, 보 건국-말뚝-비오 틴) 저항 못 층을 형성 하 일반적인 흡착 coverslip 표면 구성 요소 분석 결과의. 기능성된 coverslips의 품질은 크게 못 시 약 및 반응 조건 각 단계에서의 품질에 의존합니다. 우리의 프로토콜 단순된 기능화 프로토콜 및 아무 액체 접착제 또는 경화 시간 날짜 흐름 셀에 조립 되는 다중 흐름 셀 건설에 설명 합니다. 우리 또한 간소 하 고 강력한 데이터 분석 절차11 중심 지역화18 및 공분산 기반 확산에 대 한 방사형 대칭 메서드를 적용 하 여 계산 집중적인 회귀 단계를 제거 하는 설명 일정 견적19.
여기, 우리 보고 간단 하 고, 강력한과 높은 처리량 단일 분자 스트레칭 분석 결과 구현 coverslip 기능화, 흐름 셀 건설 및 데이터 분석에 중요 한 개선 합니다. 특히, 우리는 깨끗 하 고 마른 coverslips silane-말뚝-biotin과 직접 반응 단계 coverslip 기능화 프로토콜을 개발 했다. 이 프로토콜 coverslip 준비를 단순화 하 고 표준 2 단계 반응 프로토콜에 비해 기능성 표면 품질의 안정성을 향상 시킵니다. 멀티 채널 PDMS 흐름 셀 강력한 튜브 연결 접착제 없이 만들 수 있도록 그래서 기능성된 coverslips 사용 하 여를 설명 합니다. 이러한 흐름 셀 추가 여러 컴퓨터 제어 후미 각 흐름 챔버에 대 한 설치 및 증가 분석 결과 처리량 동안 실습 시간을 줄이기 위해 자동된 시 약 흐름을 포함 합니다.

<table><tbody><tr><td>Biotin labeled oligo, 5&amp;rsquo;-AGGTCGCCGCCC(A)&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;-biotin-3&amp;rsquo;</td><td>IDT</td><td>Custom oligo synthesis</td><td>Standard desalting purification is sufficient</td></tr><tr><td>&amp;lambda;-DNA</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N3011S</td><td>Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 glass coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Pure ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silane-peg-biotin</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>Store at -20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C in dry nitrogen gas</td></tr><tr><td>A CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Double-adhesive tape</td><td>Adhesive Applications</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS and crosslink reagent kit</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>Degassing chamber, model No. F42010-0000</td><td>BEL-ART Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer, model No. ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>0.020&quot; ID, 0.060&quot;OD</td></tr><tr><td>Peek tubing</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>0.007&quot; ID, 0.031&quot;OD</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox orange nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td></tr><tr><td>100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS camera</td><td>Hammamatsu</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>Select wavelength to correspond to stain of choice</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR, &gt;=85% purity</td><td>MIT Biopolymer lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B, HPLC purified</td><td>A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Script programming software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

우리는 간단 하 고 강력 하 고 높은 처리량 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과 1 D 확산 따라 DNA 분자의 공부에 대 한 설명 합니다. 이 분석 결과에 유리 coverslips는 기능성 실 란-말뚝-biotin과 1 단계 반응에서. 흐름 세포는 미리 잘라 채널 기능성된 coverslip 및 입구와 출구 구멍을 포함 하는 PDMS 석판 사이 접착 테이프 사이 의해 구성 됩니다. 여러 채널은 하나의 흐름 셀에 통합 하 고 각 채널에 시 약의 흐름 자동화 될 수 있다 완벽 하 게,는 크게 분석 결과 처리량을 증가 하 고 분석 결과 당 실습 시간. 각 채널 내부 biotin-λ-DNAs는 표면에 움직일 하 고 층 류 흐름-스트레치는 DNAs에 적용 됩니다. DNA 분자는 뻗어 &#62; 윤곽선 길이 서브의 80%는 공간으로 붙일 레이블된 분자의 바인딩 및 수송 활동 공부에 대 한 템플릿 확장. 단일 분자의 궤도 추적 경과 총 내부 반사 형광 (TIRF) 영상에 의해. Raw 이미지는 자동으로 단일 분자 DNA를 따라 확산의 궤적을 확인 하 고 그들의 1 D 확산 상수 추정을 간소화 된 사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다.

그림 2a 보여준다 pVIc Cy3B의 감지 된 궤도 (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B는 시스테인 잔류물에 활용 된) 2 m NaCl DNA에 확산 하는 분자는 pH 6.5에서 버퍼. PVIc의 보급은 양방향 주변 열 에너지에 의해 구동. 이 궤도에서 1 D 확산 상수 (D1 값)은 각 궤적에 대 한 추정 ( 그림 2b에서 막대 그래프 참조). D1 값이 pVIc 공액의 평균 궤도 triplet 연속 위치 호출 각 궤도에 포함 된 수에 의해가 중에서 22.2 ± 0.9 (표준 오차) M (bp2/s) 각 D1 값을 평균 하 여 계산 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
그림 1 : DNA에 따라 단일 분자의 움직임을 추적 하기 위한 기구. 8-채널 PDMS)는 미세 칩을 DNA (규모에 대 한 미국 쿼터 동전)와 닿는 수; 기능성된 coverslip 준수 b) 흐름 셀 줌 회로도 보여주는 흐름 뻗어 λ-DNA 분자; c) DNA; 스트레칭 TIRF 현미경과 흐름 시스템의 회로도 d) TIRF 이미지의 흐름 뻗어 λ-DNA; pVIc-Cy3B의 e) TIRF 이미지 (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B는 시스테인 잔류물에 활용 된) 분자 흐름 뻗어 λ DNA에 바인딩된. 이 그림은 권한2,12수정 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
그림 2 : DNA에 따라 pVIc (GVQSLKRRRCF)의 1 차원 확산. a). 흐름을 따라 pVIc의 보급 pH 6.5에서 2 mM NaCl 버퍼에 λ-DNAs (137 궤적)을 뻗어. x(t) 및 y(t)은 각각 치환 따라와 λ-DNA를 통과. 수평 점선된 라인 깜박이 염료에서 발생 누락 포인트를 나타냅니다. b). 히스토그램의 확산 상수, λ DNAs 따라 확산 하는 pVIc에 대 한 d 1. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

이 프로토콜에서는 간단 하 고 강력 하 고 높은 처리량 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과를 1 차원 (1d) 확산 따라 DNA 분자의 공부에 대 한 보여 줍니다.

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

a-simple-robust-high-throughput-single-molecule-flow-stretching-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.1K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. 이 프로토콜에서는 간단 하 고 강력 하 고 높은 처리량 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과를 1 차원 (1d) 확산 따라 DNA 분자의 공부에 대 한 보여 줍니다.

비디오: A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

연구

생체공학

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

생화학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

생물학

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Tract Growth에서 관찰된 CMG 매개 DNA 풀기

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Dynamics of Eukaryotic DNA Replication Through Single-Molecule Visualization (단일 분자 시각화를 통한 진핵생물 DNA 복제의 역학 규명)

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

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상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화