Name: analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
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이 연구는 AH에 NIH 보조금 R01 HL119984에 의해 지원되었다

마우스 배아 섬유 아 세포의 (1) 문화 (MEFs에) <ol><li> MEF 매체를 준비, 15 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM, 고 글루코스). </li><li> 실온에서 30 분 (RT) 0.5 % 젤라틴 용액 코트 100mm 세포 배양 접시. </li><li> 세포 계측기를 사용하여 MEFs에를 계산합니다. 젤라틴 용액을 제거하고 즉시 MEF 매체는 37 ° C로 미리 예열 붓는다. 급속 다음, 2 분 동안 37 ° C의 물 배스에서 마이 토마 이신 C 처리 된 MEFs의 바이알을 해동 100mm 젤라틴 코팅 접시 당 2.8 × 106 MEFs에 시드. 다른 크기의 접시를 사용하는 경우 그에 따라 세포 수를 조정합니다. 밤새 37 ° C, 5 % CO 2에서 MEFs에 부화. </li><li> 다음날 매체를 변경합니다. MEF의 계층까지 2-3 일 동안은 문화 합류한다. </li></ol> 2. 마우스 ESC 문화 <ol><li> ESC 매체를 준비 Iscove 개변 둘 베코 배지 (IMDM)를 15 % FBS가 보충 된 103 U / ㎖ 백혈병 억제 인자 (LIF), 0.1 mM 비 필수 아미노산, 55 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), 겐타 마이신 (200 ㎍ / ㎖), 0.2 % 마이코 플라즈마 항생제. </li><li> 단계 1에서 제조 한 접시 MEF에서 배지를 제거하고 37 ° C 예열 ESC 배지로 교체한다. </li><li> MEF의 층의 상부에 ESC 바이알 종자 세포 제상. 는 ESC가 합류에 도달 할 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션. </li><li> MEFs에의 합류 단일 층을 포함하는 새로운 세포 배양 접시를 준비합니다. 통과하기는 ESC는 PBS로 한번 세척하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 2-5 분 / 0.25 % 트립신 EDTA로 분리. 상기 세포 분리에 15 % FBS와 신선한 IMDM을 첨가함으로써 트립신을 중지 RT에서 5 분 동안 160 XG에서 세포 15 ㎖의 튜브에 현탁하고, 원심 분리기를 옮긴다. </li><li> 상등액 신선한 IMDM 통로 및 각각의 새로운 MEF 코팅 접시에 세포를 1/5로 재현 탁의 제거는 ESC; 세포까지 품다합류 (일반적으로 4~5일)에 도달. </li></ol> 3. 젤라틴 코팅 플레이트에 MEFs에와 문화는 ESC를 철회 <ol><li> 이개 상피가 합류에 도달하면, 새로운 IMDM에서 세포를 재현 탁 단계 2.4에서 0.25 % 트립신 / EDTA로하고 MEFs에 분리 비 접착 세균 배양 접시로 전송하고, 37 ° C, 5 % CO에서 40 분 동안 배양 2. </li><li> 조심스럽게 피펫 반복을 피하기는 ESC 및 5 ㎖ 피펫을 사용하여 새로운 젤라틴 - 코팅 된 플레이트에 배지를 함유 MEFs에 옮긴다. 는 ESC가 준수하지 않기 때문에 배양 접시에 남아있는 세포는, MEFs에 있습니다. </li><li> 통로는 ESC 3-4 일마다. 덜 자주 계대는 ESC의 다 능성을 줄일 수 있습니다. 이 차별화를 선호 할 수있다로, 60 %의 합류를 초과하지 마십시오. </li><li> MEFs에 확실 MEFs에이 존재하지 않는 수 있도록, 20 배 목표를 사용하여, 세포 배양 현미경으로 더 이상 감지 될 때까지 반복하여, 필요에 따라 3.2-3.3 3 회 이상 단계를 반복합니다. </li><li> ESC를 확인하여 ESC의 분화능을 확인세포가 전형적인 ESC 다각형 형태 (그림 1A)와 밀도 식민지를 형성하는 경우의 문화를 확인합니다. 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (17)을 면역 블 (QRT-PCR) (17) 또는 코어 능성 전사 면역하여 테스트 셀 stemness 17 (도 2) 인자. </li></ol> 4. EB 형성 <ol><li> 1.5ml의 광 보호 된 미세 원심 분리 튜브에 올 - 트랜스 RA-DMSO 스톡 10mm의 용액으로하고, 분취 액을 준비한다. 이 솔루션은 최대 2 주 동안 -80 ° C에서 안정적이다. 빛으로부터 보호. </li><li> 단계 2.4에서와 같이를 Trypsinize는 ESC; 단일 세포 현탁액으로, LIF없이 신선한 IMDM에 replate. </li><li> 혈구를 이용하여 세포 수 및 0.5 μM의 RA와 IMDM에서 5 × 105 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다. </li><li> 플레이트 (100)는 8 채널 피펫으로 100 mm 페트리 접시 당 20 μL 방울 200 μL 팁, 반전요리 및 건조에 매달려 방울을 방지하기 위해 PBS와 반전 뚜껑을 입력합니다. 빛 RA 함유 배지를 보호한다. </li><li> 매달려 문화 사채 4 일 동안, 37 ° C, 5 % CO 2에서 떨어진다. </li></ol> 5. 2D EB 문화 <ol><li> RT에서 30 분 동안 30 ㎍ / mL의 피브로넥틴 코트 12mm 원형 유리 커버 슬립. 24- 웰 플레이트의 각 웰에 커버 슬립을 배치하고, 웰 당 1 ㎖의 추가의 IMDM. </li><li> 수확 삼일 성장한 200 μL 피펫 팁 하나 드롭 사채 하나 걸려와 같은 피펫 팁을 사용하여, 잘 당 피브로넥틴 코팅 커버 슬립에 20 EBS을 (를)을 씨앗. 주 :이 커버 슬립에 더 나은 준수하기 때문에 3 일 교환 사채는 4 일 사채를 통해 바람직하다. </li><li> LIF없이 IMDM-15 % FBS와 문화를 계속합니다. 3-4 일마다 중간 교체합니다. 필요한 단백질 분비 분석을 위해 사용 된 배지를 수집한다. </li></ol> 분비 단백질 6. 검출 <ol><li> EB의 메디 500 μL로 이동UM-10 kDa의 원심 컷오프 필터, 4 ° C에서 60 분 동안 20,000 XG 스핀. </li><li> 원심 필터 내부 과도한 농축을 방지하기 위해 모든 15-20 분 잔여 매체를 조사한다. 나머지 매체의 볼륨은 25 μL로 떨어진 경우 원심 분리를 중지합니다. </li><li> 필터를 반전 및 39 ° C에서 160 XG에서 회전, 제조자의 지침에 따라 후 남은 농축 매체를 수집한다. </li><li> 특이 항체로 면역 블 (17)에 의해 분비되는 단백질을 검출한다. </li></ol> 7. 3D EB 문화 <ol><li> 단계 5.2에 기재된 바와 같이 드랍 걸려 4 일 동안 성장시킨 EB를 수집하고, 1.5 mL의 원심 분리 튜브 (튜브 당 30 사채)에 배치. </li><li> 3 차원 콜라겐 문화 키트의 지시 (/ 장비 표 자료 참조) 다음과 같은 콜라겐 겔 용액을 준비합니다. 콜라겐 용액 배 DMEM (키트 성분)의 적절한 부피를 희석; n 개의 추가eutralization 솔루션 (키트의 구성 요소) 잘 즉시 혼합하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> EB를 함유 1.5 ㎖의 튜브에 냉장 콜라겐 용액의 적절한 용적을 피펫 부드럽게 1 mL를 피펫 팁을 사용하여 6 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 거품을 피합니다. </li><li> 즉시 콜라겐 중합을 개시 60 분, 37 ° C, 5 % CO 2 플레이트를 옮긴다. </li><li> IMDM와 EB 함유 플레이트 오버레이. </li><li> 3-4 일마다 중간 변경합니다. </li></ol> 제 EB 해리 <ol><li> 200 μL 피펫 팁 하나씩 (4 단계)를 4 일 EB를 수집하고 15 % FBS와 비 - 접착 성 세균 배양 접시에 함유 IMDM로 전송; 37 ° C, 4 일 이상, 5 % CO 2에서 배양. 그들은 바닥에 부착하지 않도록 만들기 위해 사채을 두 번 매일 확인; 부드럽게 아래로 EB 부착을 방지하기 위해 접시를 흔들. </li><li> 5 분에서 185 XG에서 사채를 원심RT, 벤치 탑 원심 분리기한다. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 각 튜브에 100 μL를 초과하지 않아야한다. </li><li> PBS에 20 % FBS가 보충 된 I 튜브 당 1 ㎖의 콜라게나 사채 0.25 % 유형, 펠릿에 추가. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2에서 1 시간위한 EB-콜라게나 인큐베이션 혼합물을 1 mL의 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매 20 분을 피펫. </li><li> PBS로 부드럽게 배 세포를 씻으십시오. 세포 집합체가있는 경우,이를 제거하기 위해 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 사용합니다. </li><li> IMDM에 젤라틴 코팅 60mm 요리에 세포를 Replate. 이어서 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li></ol> 해리 사채 항 형질 <ol><li> QRT-PCR과 면역 코트 0.5 % 젤라틴과 6 웰 플레이트. </li><li> 면역, RT에서 30 분 동안 30 ㎍ / mL의 피브로넥틴 코트 커버 글라스를 들어. 24- 웰 플레이트의 각 웰에 커버 슬립을 놓는다. IMDM를 추가합니다. </li><li> 시드 4.75 × 105, 1 × 105 </각각 SUP&gt; 해리 EB 셀 (8.4-8.7 단계) 6- 웰 또는 24 웰 플레이트 당. </li><li> 형질 감염 전에 70 % 합류로 세포를 성장한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, (/ 장비 표 자료 참조) nonliposomal 지방 줄기 세포 - 최적의 시약 (17)에 의해 세포를 형질. 참고 : 우리는 사용되는 시약은 일반적으로 50 %의 형질 전환 효율에 도달 (대표 결과를 참조). </li><li> QRT-PCR에 의해 또는 각각 17 2, 3 일 후 형질 발현 수준으로 샘플을 분석한다. </li></ol> 면역 형광에 의해 EB 분화 10. 분석 <ol><li> 워시 사채 2D 또는 3D PBS로 해리 사채 및 RT에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 고정한다. 고정 된 세포가 세포 파편을 떠 제거하는 PBS로 3 배 씻으십시오. 참고 : 파라 포름 알데히드는 피부와 눈에 자극이다; 그것을 취급시주의하십시오. </li&gt; <li> 그 후, 실온에서 20 분간 세포를 Permeabilize 하시려면 PBS로 3 회 세척 PBS에 1 % 트리톤 X-100을 추가한다. </li><li> PBS를 제거하고 30 분 동안 PBS 중 5 % BSA로 차단. </li><li> 1 % BSA에서 희석 차 항체를 준비 / PBS 0.03 % 트리톤 X-100을 보충. 차 항체 용액 차단 솔루션을 교체합니다. RT에서 3 시간 동안 배양 또는 밤새 4 ℃에서, 그 다음 세포를 PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 PBS에서 이차 항체를 적용합니다. RT에서 1 시간 동안 배양 한 후 세포를 PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 마운트는 광학 현미경을위한 안티 - 페이드 매체와 유리 슬라이드에 커버 슬립. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가없는 선언

이 프로토콜에서 우리는 생쥐는 ESC의 신경 분화를 연구하는 비교적 간단한 접근 방법을 제시한다. 이전의 프로토콜에서는, RA가 제 2 일 또는 EB 매달려 드롭 (8)의 제 4 일 또는 현탁 배양 물 (7)을 배지에 첨가하고, EB 드롭 집합 (21)에 걸려 각각 또는 직후. 우리가 고안 한 프로토콜에서, RA는 이전 하였다. 현탁 배양에 의해 형성 사채 RA의 초기 도...

는 ESC는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래. 그들이 기원의 유기체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고 즉,이 세포는 만능이다. ESC 체외 분화 발달 경로와 메커니즘을 조사하는 실험적인 시스템으로 폭 넓은 관심이다. 그것은 세포와 조직 기능 장애의 교정을위한 새로운 치료 방법을 테스트 할 수있는 강력하고 유연한 모델 시스템을 제공합니다. 교환 사채는 초기 배 발생 동안 세포 분화의 여러 측면을 요점을 되풀이. 배아 치사가 어려운 배아 결함 (1, 2)의 셀룰러 기반을 결정하게 될 때 특히 EB를 사용할 수있다. 사채가 매달려 드롭 또는 액체 현탁액 기술 (3) 중 어느 하나를 형성 할 수있다. 전자의 이점은, 따라서 실험 재현성을 용이 일관된 크기 및 밀도 사채를 생성하는 능력이다. 4 인테그린 세포 표면의 10 개 종류로 인식 기저판 성분이다. RA는 신경 분화 (5, 6)을 유도하는 비타민 A의 작은 친 유성 대사 산물이다. RA 고농도 신경 유전자 발현을 촉진하고 EB 형성 7, 8 중 중배엽 유전자 발현을 억제한다. RA는 레티 날 탈수소 효소 (9)에 의해 최종 제품 레티 산화 다음 중 알코올 탈수소 효소, 레티놀, 레티 날에 의해 산화 비타민 의해 제조된다. 신경 분화는 세포질에서 RA의 전송을 필요로<html> 셀룰러 RA 결합 단백질 2 (CRABP2)에 의한 핵. 핵에서, RA는 RAR-RXR 헤테로 10 이루어진 동종 수용체 복합체에 결합한다. 이 전사 공동 활성제의 모집 및 전사 (9), (11)의 시작을 초래한다. 또한, RA 따라서 BMP 및 SMAD 12 시그널링 길항 인산화 (활성) SMAD1의 분해를 촉진시킨다. 이러한 활동 외에, RA는 PAX6 식 신경 분화 13을지지하는 전사 인자를 증가시킨다. RA 시그널링 시르-1 (SIRT1) 핵 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드 (NAD +)에 의해 변조되고, - 핵으로의 전좌 방해 CRABP2을 deacetylates 의존성 효소, 따라서 RA가 RAR-RXR 헤테로 14 (15)에 결합하여, (16). e_content은 &quot;&gt; 여기에 설명 된 RA 처리 EB 프로토콜을 설계하는 우리의 목표는 신경 전구 세포에 ESC 분화를 조절하는 신호 전달 경로의 체외 분석을 용이하게하기 위해 신경 분화를 최적화하는 것입니다.이 프로토콜의 장점 중 하나의 촉진이다 면역. 3D 사채 의한 세포 기능의 분석은 또한 항체 관통 신경 분화를 공 초점 현미경에 의해 immunolabeling 및 세포 이미징을 용이하게하는 동안 특정 시점에서 2 차원 단층으로 이미지. EB 해리하기 어려운 것은 아니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEFs</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>ESC feeder layer</td></tr><tr><td>ESC</td><td>EMD Millipore</td><td>CMTI-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (60 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Cell culture dish (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Hanging drops</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>2D EBs</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Eppendorf</td><td>30720113</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Dark 1.5 mL centrifuge tube</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229437</td><td>RA stock solution</td></tr><tr><td>Microscope cover-glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td>Circular, 12 mm diameter</td></tr><tr><td>Superfrost-plus microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>3D collagen culture kit</td><td>EMD Millipore</td><td>ECM675</td><td>3D culture</td></tr><tr><td>Effectene Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301427</td><td>Stem cell transfection</td></tr><tr><td>Microcon&amp;nbsp;Centrifugal Filters (10 kDa)</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCPRT010</td><td>Protein concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>MEFs culture</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>ESCs culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td>ESCs culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625</td><td>Dish coating</td></tr><tr><td>LIF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>8878-LF-025</td><td>To maintain ESC pluripotency</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solutions</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-PR</td><td>Lonza</td><td>VZA-2022</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Induction of neural differentiation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td>Blocking and antibody dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Cell membrane permeabilization</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI</td><td>Life Tech.</td><td>P36931</td><td>Mounting reagent</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Cell fixation</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1030-FN</td><td>Dish coating</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington Biochem. Corp</td><td>LS004196</td><td>EB dissociation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin (Rat-401)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-33677</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-5279</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-398A</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Sox2</td><td>Cell Signaling</td><td>3579</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Tubulin b3 (AA10)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-80016</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse-Alexa555</td><td>Life Tech.</td><td>A31570</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-Alexa488&amp;nbsp;</td><td>Life Tech.</td><td>A21202</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide-field microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Cell culture imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td>Immunofluorescence imaging</td></tr></tbody></table>

analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies

배반포 (일반적으로 일 E3.5에서)의 내부 물질로부터 격리 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 초기 배아 발달을 연구하기위한 체외 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)가 없을는 ESC를 신경 전구 세포로 분화 기본적. 이들은 인해 초기 단계 배아의 유사성 구형 집합체 배아 체 (EB)을 지칭 삼차원 (3D)에 축적 될 수있다. 교환 사채는 두 가지 차원 (2D) 확장을 성장으로 확장 곳, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립에 시드, 또는 그들이 회전 타원체로 성장을 계속하고 3 개 개의 배엽으로 분화 3D 콜라겐 매트릭스에 이식 할 수 있습니다 내배엽, 중배엽과 외배엽. 3 차원 콜라겐 문화는 2D 사채보다 더 밀접하게 생체 내 환경을 모방. 2 차원 EB 문화는 면역과 차별화를 추적하기 위해 면역 블에 의해 분석을 용이하게합니다. 우리는 두 단계 신경 differentia을 개발했다기 프로토콜입니다. 첫 번째 단계에서, 사채 동시에, 레티노 산 (RA)에 대한 노출에 의해 분화 유도되고, 상기 걸이 드롭 방법에 의해 발생하고있다. 두 번째 단계에서, RA의 부재 2D 또는 3D 포맷에서 신경 분화를 진행한다.

Oct4는, Nanog를, 및 SOX2는 ESC 자기 갱신과 다 능성을 부여하는 핵심 전사 인자이다. 우리는 야생형과 SYX 상기에서 RhoA 특정 과거 SYX 인자를 코딩하는 유전자가 파괴되어 유전자 변형 마우스의 균주는 ESC의 신경 분화를 비교하기 위해 상기 프로토콜을 적용 하였다. 우리는 혈관 신생 18 SYX을 내포했다. - / -는 ESC를하고 SYX의 신경 ?...

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

analysis-retinoic-acid-induced-neural-differentiation-mouse-embryonic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K 조회수.  Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University.  우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다. 

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

신경과학

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

인간 배아 줄기 세포에서 향상된 3D 신경 망막 분화

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

저자 스포트라이트: 질병 모델링을 위한 간단하고 효율적인 신경 망막 오가노이드 생산

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest in studying the mechanisms regulating cell fate decisions and plasticity. Originating in the dorsal neuroepithelium, this cell population is transient and relatively rare in the developing embryo - making functional tests, genomic screens, and biochemistry assays challenging to perform in vivo. To overcome these limitations, several methods have been developed to model CNCC development in vitro. Neurosphere (NS) based culturing methods provide a complex microenvironment that recapitulates the developing anterior neuroepithelium in 3D. These systems allow the growth of many NS in the same plate to generate a large amount of CNCC, but the produced NS present a high variability in shape, size, and number of CNCC formed - making quantitative assays difficult to perform. This protocol outlines a reproducible method for generating NS from mouse embryonic stem cells (mESC) in a 96-well format. NS generated in 96-well plates produce cranial neural crest cells (CNCC), which can be further cultured. By controlling the number of starting cells, this approach reduces variability in the size and shape between NS and increases reproducibility across experiments. Finally, this culture system is adaptable to several applications and offers a higher degree of flexibility, making it highly customizable and suitable for multiplexing experimental conditions.

We present a three-dimensional (3D) in vitro differentiation protocol generating neurospheres of reproducible size to produce cranial neural crest cells from mouse embryonic stem cells. We show that this methodology reduces variability compared to previous protocols and how it can be used for multiplexed assay to study cranial neural crest cell development.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...

생물학

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

요약

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혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

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Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

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