Name: an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood at JoVE.com

이 연구는 부분적으로 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 및 캐나다 보건 연구원 (CIHR)의 연구비 지원에 의해 지원됩니다. 위니펙의 빅토리아 종합 병원 (Victoria General Hospital)과 위니펙의 세븐 옥스 종합 병원의 임상 연구 및 응용 연구소 (Clinical Institute of Applied Research and Education)에 감사드립니다. Hagit Peretz-Soroka 박사에게 분석 작동 전략에 대한 도움이되는 토론에 감사드립니다. <style type="text/css">
</style> 워털루 대학교 (University of Waterloo)의 캐롤린 렌 (Carolyn Ren) 교수와 닥터 (Xiaoming, Cody) Chen 박사는 촬영 과정에서 관대 한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

모든 인간 샘플 수집 프로토콜은 위니펙의 매니토바 대학 (University of Manitoba)의 공동 연구 교수 윤리위원회 (Joint-Faculty Research Ethics Board)의 승인을 받았습니다. 1. 미세 유체 장치 제작 ( 그림 1A ) <ol><li> 디자인 및 인쇄 투명 마스크. <ol><li> 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오. 참고 :이 장치에는 두 개의 레이어가 있습니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하는 셀 도킹 차단 채널을 정의합니다. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 마크는 2 개의 층을 위해 설계된다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 길이와 너비구불 구불 한 입력 채널은 각각 6 mm와 280 μm입니다. </li><li> 고해상도 프린터를 사용하여 투명 필름 마스크에 첫 번째 및 두 번째 레이어 피쳐를 인쇄합니다. 참고 : 인쇄 해상도는 디자인의 최소 기능에 따라 다릅니다. 현재 디자인에서 10μm 최소 피쳐에 대해 32,000dpi가 선택되었습니다. </li></ol></li><li> 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. <ol><li> 실리콘 웨이퍼를 플라즈마 세정기에 넣으십시오. 3 분간 진공을가한다. </li><li> 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 30 분 동안 실리콘 웨이퍼를 처리하기 위해 산소 플라즈마를 사용하십시오. </li><li> 플라즈마 세정 장치를 끄고 실리콘 웨이퍼를 꺼냅니다. 실리콘 웨이퍼는 디바이스 몰드를 제조 할 준비가된다. </li></ol></li><li> 클린 룸 시설에서 사진 석판 술을 사용하여 첫 번째 레이어를 제작하십시오. 참고 : 정확한 제조 매개 변수는 제조 시설에 따라 다를 수 있습니다. <ol><li> 10 mL SU-8 2025를 10 mL SU-8 2000을 유리 브레이커로 사용하여 설계된 포토 레지스트를 준비한다. 거품이 사라질 때까지 퓸 후드에 혼합물을 10 분 동안 두십시오. </li><li> 조심스럽게 적절한 척으로 스피너에 세척 된 실리콘 웨이퍼를 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼 중앙에 포토 레지스트 혼합물 3 mL를 붓습니다. 500rpm에서 5 초 동안 스핀합니다. 그런 다음 30 초 동안 3,000 rpm으로 회전시켜 실리콘 웨이퍼에 최종 4 μm 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻습니다. </li><li> 조심스럽게 스피너에서 실리콘 웨이퍼를 꺼내고 핫 플레이트에서 95 ° C로 4 분간 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬기에 놓고 UV 노출 시간을 6 초로 설정합니다. 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 첫 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다. </li><li> 부착 된 마스크가있는 투명 유리판을 정렬 장치에 천천히 올려 놓고 마스크를 실리콘 웨이퍼에 맞 춥니 다. 시를 드러내시오.licon 웨이퍼를 UV에 연결하여 셀 도킹 구조를 패턴 화합니다. </li><li> 조심스럽게 유리판을 제거하고 노출 된 실리콘 웨이퍼를 꺼내십시오. 95 ° C에서 4 분간 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 흄 후드에 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 30 초 동안 부드럽게 흔드십시오. </li><li> 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 이소 프로필 알콜 (IPA)을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. 흄 후드 내부의 질소 가스로 실리콘 웨이퍼를 건조시킨다; 첫 번째 레이어가 준비되었습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 레이어에 두 번째 레이어를 만듭니다. <ol><li> 접착 테이프를 사용하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 덮으십시오. 조심스럽게 첫 번째 레이어와 함께 실리콘 웨이퍼를 스피너의 진공 척 위에 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼에 3 mL의 SU-8 2025 포토 레지스트를 붓습니다. 5 초 동안 500 rpm으로 실리콘 웨이퍼를 회전시킵니다. 그런 다음 2000 rpm으로 30 회전실리콘 웨이퍼 상에 최종 60㎛ 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻는다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 조심스럽게 스피너에서 꺼내 핫 플레이트로 옮깁니다. 65 ° C에서 2 분간 구우십시오. </li><li> 부드럽게 접착 테이프를 제거하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 노출하십시오. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 95 ° C에서 6 분 동안 베이킹합니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬 장치에 놓고 UV 노출 시간을 18 초로 설정합니다. </li><li> 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 두 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다. </li><li> 부착 된 마스크가있는 유리판을 조심스럽게 정렬 장치에 놓고 마스크와 정렬 장치의 검사 현미경을 사용하여 교차 정렬 표시로 실리콘 웨이퍼의 첫 번째 레이어를 정렬합니다. </li><li> 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 UV에 노출시켜 셀 로딩 및 그래디언트 채널을 패턴 화하십시오. </li><li> 조심스럽게 유리판을 제거하고 실리콘을 꺼내십시오.어퍼. 실리콘 웨이퍼를 2 분 동안 65 ° C에서 핫 플레이트에 베이킹 한 다음 실리콘 웨이퍼를 다른 95 ° C 핫 플레이트로 옮기고 6 분 동안 베이킹합니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 연기 후드로 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 부드럽게 6 분 동안 이것을 흔드십시오. </li><li> 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 IPA를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. </li><li> 흄 후드 내부에 질소 가스를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 건조시킵니다. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 금형을 150 ° C에서 30 분 동안 하드 베이킹합니다. 두 번째 레이어가 준비되었습니다. </li></ol></li><li> 마스터 몰드 표면 수정. 참고 : silanization 표면 수정 단계는 soft-lithography에서 금형으로부터 PDMS (polydimethylsiloxane) 방출을 촉진하기 위해 SU-8 몰드에 적용됩니다. <ol><li> Micropipette tip에 트리 데카 플루오로 -1,1,2,2- 테트라 히드로 옥틸 (트리클로로 실란) 용액 10 μL를 넣습니다. 15 ML 플라스틱 튜브에 micropipette 팁을 넣어튜브의 캡을 느슨하게하십시오. </li><li> 튜브와 SU-8 패턴 실리콘 웨이퍼를 데시 케이 터 내부에 놓고 1 시간 동안 진공을가한다. 마스크 몰드는 PDMS 장치를 제조 할 준비가된다. </li></ol></li><li> PDMS 장치를 제작하십시오. <ol><li> 플라스틱 비커에 PDMS베이스 40g과 경화제 4g을 혼합하여 PDMS 솔루션을 준비하십시오. 페트리 접시에 준비 SU - 8 마스터 금형을 놓고 조심스럽게 금형에 44 g PDMS 솔루션을 부어. </li><li> 페트리 접시를 데시 케이 터에 넣고 20 분 동안 PDMS 용액을 탈기시키기 위해 진공을가하십시오. 그런 다음 페트리 접시를 오븐에 넣고 PDMS를 80 ° C에서 2 시간 동안 경화시킵니다. </li><li> 굽기 후에, 페트리 접시를 가지고 가고 청결한 벤치에 두십시오. 조심스럽게 자르고 SU - 8 곰팡이에서 PDMS 슬랩을 벗겨. </li><li> 직경 3mm의 펀처를 사용하여 셀로드 포트를 펀치 아웃합니다. 직경 6mm의 천공기를 사용하여 화학 물질 주입구 저장소와 폐기물 배출구를 펀치하십시오. </li><li> 에 먼지를 제거접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브의 표면 플라즈마 기계에 PDMS 슬래브와 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 진공을 3 분 동안 적용하십시오. </li><li> 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 부드럽게 공기 밸브를 조정하고 3 분 동안 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드 plasmatreat. </li><li> 플라즈마 전원을 끄고 진공을 해제하십시오. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드를 꺼내십시오. </li><li> 유리 슬라이드 위에 PDMS 슬라브 (채널 구조가 아래를 향한 상태)를 즉시 놓습니다. 부드럽게 PDMS 슬래브를 눌러 유리에 접착시킵니다. 즉시 마이크로 유체 채널을 탈 이온수로 채 웁니다. 미세 유동 장치 제조 및 조립이 완료된다. </li></ol></li></ol> 2. Microfluidic 세포 이동 분석 준비 <ol><li> 미세 유체 장치 준비. <ol><li> 950에 재고 fibronectin 솔루션 (1 MG / ML)의 50 μL를 희석하여 50 μg / ML fibronectin 솔루션을 준비81; 바이오 안전성 캐비닛 내 Dulbecco의 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS). </li><li> 로스웰 파크 기념 연구소 (Rotwe Park Memorial Institute) 배지 (RPMI-1640) 9 mL와 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 첨가 된 RPMI-1640 1 mL를 혼합하여 이동 배지를 준비합니다. </li><li> 장치에서 탈 이온수를 제거하십시오. </li><li> 콘센트에서 100 μL의 fibronectin 용액을 장치에 첨가하십시오. 모든 채널이 fibronectin 용액으로 채워지는지 3 분간 기다립니다. 덮인 페트리 접시에 microfluidic 장치를 실온에서 1 시간 놓습니다. </li><li> 장치에서 피브로넥틴 용액을 꺼냅니다. 콘센트에서 100 μL 이동 매체를 추가하십시오. 모든 채널이 이동 매체로 채워지는지 3 분간 기다리십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 더 장치를 품는다; 장치는 화학 주성 실험을위한 준비가 완료됩니다. </li></ol></li><li> chemotaxis 실험을위한 chemoattractant 솔루션 준비. <ol><li> t에서 100 nM fMLP 용액 준비1mL 이동 매체. 1.5 ML 튜브 fMLP 솔루션 주식 ​​FITC - Dextran (10 kDa, 1 MM) 5 μL를 섞는다. 참고 : FITC-Dextran은 기울기 측정에 사용됩니다. 또는 그라디언트 표시기로 Rhodamine을 사용하십시오. fMLP 화학 유인 물질 용액은 화학 주성 실험을위한 준비가 완료되었습니다. </li></ol></li><li> Sputum 샘플 준비. 참고 : COPD 환자의 객담 검체로 유도 된 호중구 주 화성을이 올 온칩 방법의 임상 진단 응용으로 테스트했습니다. <ol><li> COPD 환자로부터 객담 샘플을 수집하기위한 인간 윤리 규약을 얻습니다. 참고 : 우리는 위니펙의 Seven Oaks General Hospital (매니토바 대학 승인)에서 샘플을 수집 할 수있는 승인을 받았습니다. </li><li> 모든 과목에서 정보에 근거한 서면 동의서를받습니다. </li><li> COPD 환자의 자발적 객담 샘플을 수집하십시오. 500 mL의 가래 샘플을 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. </li><li> 500 μL 0.1 % 디 첨가thiothreitol을 1.5 mL 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 튜브를 37 ° C의 수조에 15 분간 놓습니다. </li><li> 753 XG에서 10 분 동안 시료를 원심 분리 한 후 상등액을 수집한다. 상등액을 865 xg에서 5 분간 원심 분리하고 최종 상등액을 수집한다. 사용하기 전에 수집 된 상등액을 -80 ° C의 냉동고에 보관하십시오. </li><li> 주 화성 실험 준비가되었을 때, 객담 용액을 녹인다; 900 μL 이동 매체를 1.5 mL 튜브에 옮기고 바이오 안전성 캐비닛 안의 100 μL 가래 용액과 혼합하십시오. 가래 용액은 화학 주성 실험을 위해 준비된다. </li></ol></li><li> 혈액 샘플 수집. <ol><li> 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 채취하기 위해 인간 윤리 강령을 취득하십시오. 모든 헌혈자로부터 서면 동의서를받습니다. 참고 : 위니펙 빅토리아 종합 병원 (Winnipeg)의 샘플 (University of Manit의 공동 교수 연구 윤리위원회 승인)오바). </li><li> 정맥 천자에 의해 혈액 샘플을 수집하고 EDTA 코팅 튜브에 샘플을 넣으십시오. 실험 전에 튜브를 바이오 안전성 캐비닛에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 3. All-on-chip 화학 주성 분석 실험 <ol><li> 온칩 셀 분리 ( 그림 1B ). <ol><li> 바이오 안전성 캐비닛 안에 1.5 mL 튜브에 10 μL 전혈을 놓습니다. 참고 : 혈액 샘플 채취의 세부 사항은 2.4 절에 있습니다. </li><li> 호중구 격리 키트 (물질 표 참조)에서 2 μL 항체 칵테일 (Ab)과 2 μL 자성 입자 (MP)를 1.5 ML 튜브에 넣고 부드럽게 섞으십시오. 이것은 호중구를 제외한 혈액 세포를 표시합니다. </li><li> 상온에서 5 분간 혈액 - Ab - MP 혼합물을 품어. 참고 : 이것은 혈액 내 항체 표지 세포를 자기 적으로 표시합니다. </li><li> 두 개의 작은 자기 디스크를 셀 로딩 p의 양면에 부착하십시오.장치의 오르 트. 장치의 모든 포트에서 매체를 토출하십시오. </li><li> 세포로드 포트에서 microfluidic 장치로 천천히 피펫 2 μL 혈액 - Ab - MP 혼합물. 참고 : 자기 적으로 분류 된 세포는 호중구가 장치로 흘러 들어가고 세포 도킹 구조에 갇히게되는 동안 세포 로딩 포트의 측면 벽에 갇혀 있습니다. </li><li> 충분한 호중구가 세포 도킹 영역에 갇힐 때까지 몇 분간 기다립니다. </li></ol></li><li> 화학 주성 분석 ( 그림 1C ). <ol><li> 37 ° C에서 온도 제어 현미경 스테이지에 microfluidic 장치를 놓습니다. </li><li> 2 개의 피펫 터를 사용하여 지정된 입구 저장소에 100 μL 화학 유인 물질 용액 (fMLP 또는 가래 용액)과 100 μL 이동 매체를 첨가하십시오. 이것은 압력에 의해 보조되는 연속적인 층류 - 화학적 혼합에 의해 구배 채널에서 화학 유인 물질 구배를 생성 할 것이다균형 구조. 참고 : 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 가래 수집에 대한 자세한 내용은 2.3 절에 나와 있습니다. <ol><li> 배지 대조 실험의 경우, 유입 배지 모두에 이동 배지를 첨가하십시오. </li></ol></li><li> 그라디언트 채널에서 FITC-Dextran의 형광 이미지를 얻습니다. </li><li> &quot;File | Open&quot;명령을 사용하여 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다. </li><li> &quot;Analyze | Plot Profile&quot;명령을 사용하여 그라디언트 채널에서 형광 강도 프로파일을 측정합니다. </li><li> 추가 플로팅을 위해 측정 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다. </li><li> 온도 제어 현미경 스테이지 또는 15 분 전통적인 세포 배양 보육에서 장치를 품어. </li><li> 10X 대물 렌즈를 사용하여 데이터 분석을 위해 셀의 최종 위치를 기록하는 그래디언트 채널을 이미지화합니다. </li><li> 필요한 경우 시간 경과 현미경으로 장치에 세포 이동을 기록하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 세포 이동 Data 분석 ( 그림 1C ) <ol><li> 아래 설명 된대로 도킹 구조에서 세포 이동 거리를 계산하여 주 화성 분석을 분석합니다. 그림 1C를 참조하십시오. </li><li> 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다 (버전 1.45). </li><li> 그라디언트 채널로 이동 한 각 셀의 가운데를 선택합니다. </li><li> 최종 위치에 대해 선택한 셀의 좌표를 측정합니다. 도킹 구조의 가장자리에있는 점의 좌표를 초기 참조 위치로 측정하십시오. </li><li> 측정 된 좌표 데이터를 스프레드 시트 소프트웨어 ( 예 : Excel)로 내 보냅니다. 셀의 이동 거리를 셀의 최종 위치와 그라디언트 방향을 따른 초기 참조 위치의 차이로 계산합니다. </li><li> 마이크로 미터까지의 거리를 보정하십시오. chemotaxis의 측정으로 모든 세포의 이동 거리의 평균과 편차를 계산합니다. </li><li> Mig 비교Student &#39;s t -test를 사용하는 배지 대조 실험에 대한 화학 자극기 기울기가있는 배양 거리. </li><li> 세포 이동의 시간 경과 이미지가 기록되면, 세포 이동 분석 및 chemotaxis는 세포 추적 분석 15 로 더 분석 할 수 있습니다. 참고 : all-on-chip chemotaxis assay를 만들고 수행하는 데 필요한 자료는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis.">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-on-chip+method+for+testing+neutrophil+chemotaxis+induced+by+fMLP+and+COPD+patient's+sputum.">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li></ol>

공개 할 이익 충돌이 없습니다.

이 논문에서는 호중구를 전혈에서 직접 분리하고 화학 주성 테스트를 단일 미세 유체 칩에 직접적으로 분리하는 상세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이 방법은 간편한 조작, 고순도 호중구의 부정적 선택, 신속한 샘플 - 결과 화학 주성 테스트, 감소 된 시약 및 샘플 소비 및 정확한 세포 이동 데이터 분석에서 유용한 기능을 제공합니다. 대략적으로, 입력 된 전체 혈액 샘플로부터의 호중구의 적어도 25 %가 장치의 도킹 구조에 효과적으로 들어가고, 우리는 칩식 Giemsa 염색에 의해 호중구 순도가 높다는 것을 발견했다. 이 개발 된 all-on-chip chemotaxis 분석 방법은 다양한 세포 이동 연구 및 임상 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법의 연구 응용은 배지에서의 호중구 주 화성을 fMLP 구배와 비교함으로써 입증되었다. 마찬가지로,이 방법은 COPD spu에서 호중구 화학 주성을 시험하는데 사용될 수있다임상 진단을위한 세포 기능성 바이오 마커를 개발하는 사례로서 이 방법으로 연구자는 호중구의 화학 주성을 서로 다른 화학 유인 물질에 대해 개별적으로 또는 조합하여 쉽게 테스트 할 수 있습니다. 연구원은 또한이 방법을 사용하여 잠재적으로 변경된 주 화성 반응에 대해 환자의 복잡한 주 화성 요소에 대한 호중구 화학 주 화성을 테스트하거나 질병 환자의 호중구를 테스트 할 수 있습니다. 이 통합 올 온칩 방법은 특별한 세포 배양 및 살아있는 세포 이미징 시설이없는 연구 또는 임상 실험실에서 테스트를 수행하는 데 특히 유용합니다. 시험은이 프로토콜에 따라 연구자 또는 임상의가 쉽게 수행 할 수 있습니다. 더 진보 된 리서치 어플리케이션을 위해,이 방법은 시간 경과 현미경으로 개별 세포 운동을 추적 할 수 있습니다. 일반적으로이 온칩 방식은 작동하기 쉽고 그 결과는 견고합니다. 몇 가지 기술적 인 알림은 성공적인 실험을 보장합니다. 첫째, th매우 얇은 배리어 채널을 손상시키지 않도록 플라즈마 결합 중에 PDMS 복제물을 클래스 기판 위에 가볍게 눌러야합니다. 둘째로, 세포 로딩 포트에서 배지의 증발은 화학적 구배를 방해 할 수 있습니다. chemotaxis 테스트 동안 셀 로딩 포트를 밀봉 탭으로 덮는 것이 좋습니다. 셋째, chemotaxis 실험 전에 배리어 채널을 통해 세포를 밀어 수있는 높은 압력을 피하기 위해 혈액 샘플은 장치에 부드럽게로드해야합니다. 넷째, 현재 설정에서, 우리는 바람직하지 않은 세포가 채널을 입력하지 않도록 chemotaxis 분석하는 동안 세포로드 포트에 첨부 된 자석을 유지하는 것이 좋습니다. 대안 적으로, 관통 구멍 및 자기 디스크가 부착 된 PDMS의 분리 된 부분은 장치의 셀 로딩 포트에 정렬 될 수있다. 이 경우, 자기 디스크 및 갇힌 셀이있는 상단 PDMS 부품을 셀 분리 후 장치에서 제거 할 수 있습니다. 이 올 온 채널ip 방법은 현재의 한계를 극복하고 그 기능을 개선하고 확장하기 위해 추가로 개발 될 수 있습니다. 첫째, 현재 장치는 한 번에 하나의 분석 만 허용하므로 처리량이 제한됩니다. 다중 병렬 테스트 유닛을 갖춘 디바이스의 추가 개발은 실험 처리량 요구 사항을 향상시킵니다. 두 번째로, 현재의 흐름 기반 화학 구배 생성기는 1D에서 구배 생성을 제한합니다. 2D 또는 3D 플로우 프리 그라디언트 생성기의 추가 개발은 생리적 그라디언트 조건을 더 잘 나타냅니다. 셋째, 호중구 외에도 원칙적으로이 올 온칩 방법을 사용하여 유사한 자성 세포 격리 키트를 사용하여 T 세포, B 세포 및 NK 세포와 같은 다른 백혈구 유형을 테스트 할 수 있습니다. 이 방법이 저주파수에서 혈액 세포 집단을 시험하는데 효과적으로 사용될 수 있는지, 그리고 화학 주성 테스트 전에 온칩 활성화 및 배양이 필요한 세포를 연구하는 것이 중요 할 것이다. 그런 다음 온칩 셀 격리 방법 can 다른 응용 프로그램을 위해 더 확장되어야합니다. 다른 장벽 채널 두께를 테스트 한 결과, 호중구 이동 실험에 3-4 μm가 가장 적합하다는 결과가 나타났습니다. 즉, 자극받지 않은 세포를 충분히 갇히고 세포가 자극시 장벽 채널을 통과하도록 허용합니다. 장벽 채널 치수는 다른 셀 유형에 맞게 최적화되어야합니다. 마지막으로,이 빠르고 통합 된 화학 주성 테스트를 통해 연구자는 관련 임상 응용 분야를 탐구 할 수 있습니다. 클리닉에서 실용적인 테스트를 가능하게하기 위해 마이크로 유체 장치, 온도 및 스테이지 제어는 물론 스마트 폰 기반 광학 이미징 및 데이터 분석 모듈을 통합하는 휴대용 시스템이 개발되었습니다. 이 논문에서 제시된 COPD 관련 연구 외에도, 만성 신장 질환과 같은 다른 관련 질병에 대한 세포 이동은이 올 온칩 (all-on-chip) 방법으로 시험되고있다.

화학 주성은 용해성 화학 물질 농도 구배로 이동하는 세포 이동 과정으로 면역 반응 1 , 2 , 3 , 조직 발달 4 및 암 전이 5를 포함한 많은 생물학적 과정에 결정적으로 관여합니다. 호중구는 가장 풍부한 백혈구 하위 집합이며 신체의 타고난 숙주 방어 기능을 가능하게하고 적응 면역 반응을 중재하는 데 중요한 역할을합니다 6 , 7 . 호중구에는 고도로 조절 된 주 화성 기계가 장착되어있어이 운동성 면역 세포가 병원체에서 유도 된 화학 유인 물질 ( 예 : fMLP)과 호스트 유래 화학 유인 물질 ( 예 : 인터루킨 -8)을 통과 할 수 있습니다. 호중구의 이동과 주 화성은 다양한 생리 학적 문제를 매개한다.염증 및 암과 같은 질병 1 , 9 . 따라서, 호중구 주 화성의 정확한 평가는 호중구 생물학 및 관련 질병 연구에 중요한 기능적 판독을 제공한다. 널리 사용되는 기존의 chemotaxis assays ( 예 : transwell assay 10 )와 비교하여 microfluidic 장치는 정확하게 제어 된 화학 구배 생성 및 소형화로 인해 세포 이동 및 화학 주성의 정량적 평가에 큰 가능성을 보여줍니다 11 , 12 , 13 . 지난 20 년 동안 다양한 생물학적 세포 유형, 특히 호중구의 화학 주성을 연구하기 위해 다양한 미세 유체 장치가 개발되었습니다. Spatiotemporally complex che에서 호중구의 이동을 특성화하는데 많은 노력이 기울여졌다.<html> 마이크로 유체 장치 ( 14 , 15)에 구성된 미세 기울기를 나타낸다. 흥미로운 전략은 또한 microfluidic 장치를 사용하여 neutrophils에 의해 방향 결정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 생물 학적 연구 이외에도, microfluidic 장치의 응용 프로그램은 질병 평가 17 , 18 , 19 임상 샘플을 테스트하기 위해 확장되었습니다. 그러나, 많은 미세 유체 장치의 사용은 전문 연구 기관에만 국한되어 많은 양의 혈액 샘플로부터 오랫동안 호중구를 분리해야합니다. 따라서, 신속한 호중구 주 화성 분석을위한 통합 마이크로 유체 장치를 개발하는 추세가있어왔다. 20 , 21 , 22 ,ef &quot;&gt; 23 , 24 . 이 방향으로, 단일 음향 소자에 자기 음성 호중구 정제와 후속 화학 주성 분석을 통합 한 all-on-chip 방법이 개발되었습니다 25 . 이 올 온칩 방법은 다음과 같은 새로운 특징을 가지고 있습니다. 1) 접착 기반 세포 포착이나 세포 크기 기반 필터링을 통해 혈액으로부터 호중구를 분리하는 이전의 온칩 전략과는 달리,이 새로운 방법은 높은 chemoattractant 자극에 chemotaxis 측정뿐만 아니라 전체 혈액의 소량에서 neutrophils의 고순도, 온 - 자기 분리, 2) 세포 도킹 구조는 화학 기울기 채널에 가까운 호중구의 초기 위치를 정렬하는 데 도움이되며 단일 세포 추적없이 간단한 화학 주성 분석을 가능하게합니다. 3) 호중구 격리와 chemot의 통합axis 분석은 실험 단계 사이에 중단이 없을 ​​때 25 분 안에 빠른 시료 - 결과 주 화성 분석을 가능하게합니다. 이 백서는이 온칩 주 화성 분석의 구성, 작동 및 데이터 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 논문은 알려진 재조합 화학 주성분 및 복잡한 chemotactic 샘플을 환자에게 테스트 한 다음 호중구 화학 주 화성을 수행하기 위해 개발 된 방법을 효과적으로 사용하고 문제 해결 전략, 한계 및 향후 방향에 대한 토론을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Device fabrication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Digital scale</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 thinner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 developer</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane&lt;br/&gt; (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Cutting pad</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>Punchers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Source&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;On-chip cell isolation and chemotaxis assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&lt;br/&gt; (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic disks</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm in diameter,&lt;br/&gt; 1 mm thick</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain solution</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human&lt;br/&gt; Neutrophil Isolation&lt;br/&gt; Kit</td><td>STEMCELL&lt;br/&gt; Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope environmental chamber.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood

호중구의 이동과 주 화성은 우리 몸의 면역계에 중요합니다. 미세 유체 장치는 실시간 시각화, 화학 물질 농도 구배 생성의 정확한 제어, 시약 및 시료 소비 감소 등의 이점 때문에 호중구 이동 및 주 화성을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 최근에, 전체 혈액으로부터 직접적으로 통합되고 용이하게 작동되는 미세 유체 주 화성 분석 시스템을 개발하기위한 노력이 마이크로 유체 연구원에 의해 이루어졌다. 이 방향에서, 첫 번째 all-on-chip 방법은 작은 혈액량 샘플에서 호중구의 자기 음성 정화와 주 화성 분석을 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 방법은 25 분 내에 신속한 시료 - 결과 호중구 주 화성 시험을 허용합니다. 본 백서에서는 문제 해결 전략, limi에 대한 토론과 함께 온칩 주 화성 분석을위한 상세한 구성, 작동 및 데이터 분석 방법을 제공합니다미래 방향. 이 all-on-chip 방법을 사용하여 정의 된 chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 및 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 환자의 객담을 테스트하는 호중구 주 화성 분석의 대표 결과가 표시됩니다. 이 방법은 많은 세포 이동 관련 조사 및 임상 적용에 적용 가능합니다.

호중구는 미세 유체 장치에서 직접 한 방울의 전체 혈액에서 부정적으로 선택됩니다. 분리 된 호중구의 순도는 Giemsa 염색에 의해 확인되었으며, 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보였다 ( 그림 2A ) 25 . 이것은 소량의 전혈에서 고순도의 효과적인 칩 중성구 분리를 나타냅니다. 또한, 도킹 구조는 화학 구배 ( 그림 2B ) 25 를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆의 셀을 효과적으로 정렬 할 수 있습니다. 기울기 생성은 연속적인 층류 화학 약품 혼합을 기반으로하며, 흐름은 입구 및 출구 용액의 서로 다른 레벨로부터의 압력 차에 의해 유도됩니다. 외부 펌프가 필요 없습니다. 화학적 인 그라디언트t는 그라디언트 채널을 가로 지르는 FITC- 덱스 트란의 형광 강도 프로파일을 특징으로하는 미세 유체 장치에서 수분 이내에 설정된다. 농도 구배는 적어도 1 시간 동안 안정적이며, 이는 현재 호중구 주 화성 실험을위한 충분한 시간입니다 ( 그림 1C ). 세포 이동 연구를위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법의 사용을 입증하기 위해, 배지 단독 또는 fMLP 구배에서의 호중구 주 화성을 비교 하였다. 실험 결과 배지 조절 실험에서 장벽 채널을 통과하는 세포는 거의 없다는 것을 보여 주었다. 대조적으로, 많은 호중구는 빠르게 장벽 채널을 통해 이동하고 100 NM fMLP 그라디언트 ( 그림 2B ) 25로 마이 그 레이션. 세포 이동 시험은 이동 거리에 의해 정량적으로 측정되며, 이는 매체 대조군보다 fMLP 기울기에 대해 상당히 더 높다 ( 25 . 또한, 온 - 칩 방법은 매체 단독에서의 호중구 이동과 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 객담 구배를 비교함으로써 잠재적 인 임상 적용에 대해 입증되었다. 그 결과는 COPD 가래 구배에 대한 강한 세포 이동을 보였으며, 이는 중형 대조군 ( 그림 2B - C ) 25에 비해 현저히 높은 이동 거리로 정량적으로 나타냅니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55615/55615fig1.jpg" /> 그림 1 : 호중구 주 화성 분석을위한 all-on-chip 방법의 예. ( A ) 미세 유체 장치의 그림. 이 장치는 두 개의 레이어를 포함합니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 셀을 정의합니다l 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하기위한 장벽 채널 도킹. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 표시는 두 레이어에 대해 설계되었습니다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 사행 형 입력 채널의 길이와 폭은 각각 6 mm와 280 μm입니다. ( B ) 온칩 세포 분리 방법의 예; ( C ) chemotaxis 테스트의 그림. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55615/55615fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55615/55615fig2.jpg" /> 도표 2 :의 대표 결과all-on-chip 호중구 주 화성 분석 25 . ( A ) Giemsa 얼룩진 이미지 (60X 대물 렌즈 사용) - 마이크로 유체 채널에서 온 - 온 격리 세포의; ( B ) 배지 조절에서의 세포 분포, 100 nM fMLP 기울기 및 COPD 객담 기울기의 비교; ( C ) 매체 제어에서 그라디언트 채널의 평균 세포 이동 거리, fMLP 그라디언트 및 COPD 가래 그라디언트. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타냅니다. *는 Student &#39;s t -test에서 p &lt;0.05를 나타냅니다.이 수치는 World Scientific Publishing의 허락을 얻어 참고 문헌 25 에서 수정되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55615/55615fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K 조회수.  Chinese Academy of Sciences.  이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다. 

비디오: An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

연구

생체공학

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

면역학 및 감염병학

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

인간 호중구에서 β2 Integrin Activation Inhibitors의 스크리닝

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

저자 스포트라이트: β2 Integrin 활성화의 소분자 길항제를 식별하는 방법 개발 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

요약

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단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

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인간 호중구 유량 용기 접착 분석

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합