Name: in vitro imaging and quantification of the drug targeting efficiency of fluorescently labeled gnrh analogues
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues at JoVE.com

The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).

세포 배양 및 시약 1. 준비 <ol><li> 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지 불리는) 보충 제조자의 권장 배지에서 세포 배양을 유지한다. 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 세포 배양 플라스크 유지. 거꾸로 현미경으로 세포의 증식 및 포화 상태에 따라 (10X 위상 대비 목표를 사용). </li><li> 세포가 적절한 포화 상태에 도달하면, 배지를 제거하고 2-3 ㎖, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 배양을 씻는다. PBS를 제거하고 세포 배양 물 0.5 ㎖, 멸균 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 추가하고 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 트립신을 중지하고 멸균 원심 분리기 튜브로를 전송하는 데 3 ~ 4 mL의 멸균 완전 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 실온에서 4 분 (RT) 150 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 무시하고 페이지를 일시 중단2 ~ 3 mL의 멸균 완전 배지에서 ellet. </li><li> 세포 현탁액 100 μL를 가지고 죽은 세포를 얼룩, 100 μL 0.4 % (m / V를) 트리 판 블루 용액을 혼합한다. 로드 혈구로이 혼합물을 10 μL와 도립 현미경으로 생존 세포의 수를 결정한다. </li><li> 4 × 104 세포 / ㎖를 함유하는 멸균 완전 배지 10 ㎖에 13 단계에서 제조 된 세포 현탁액의 요구량을 희석. </li><li> 첫 번째 유리 바닥 8 잘 현미경 슬라이드의 일곱 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 의 GnRH 흡수 방법이 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 제 8 잘 현미경 슬라이드의 다섯 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 이 슬라이드는의 GnRH-IR 발현 방법에 사용된다. </li><li> 추가 1도 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액의 용액 (4 × 104 세포 / 웰) 일곱 아에12 웰 플레이트의 LS. 이 판은 GnRH의 정량 방법에 사용된다. </li><li> 세포는 두 현미경 슬라이드 플레이트에 부착하자. 48 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서이를 부화. </li><li> 배양 후 (10X 위상 대비 목표를 사용) 거꾸로 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 건강하고 연결된 경우 다음 단계를 계속 진행합니다. </li><li> 세 접합체 (18)의 각각에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 밀리미터의 GnRH-FITC 스톡 용액을 제조 하였다. 의 GnRH-I, 16.97 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II 및 16.47 μg의 / μL [리스 8 (16.43 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] : (이 희석 농도를 사용하여 FITC)] -의 GnRH-III)을 실온에서 어두운 장소에서 이러한 재고 솔루션을 유지하고 몇 주 이내에 그들을 사용합니다. </li><li> 1.7 μL 1.7 mL를 완전 배지에서 10 세의 GnRH-FITC mM의 스톡 용액을 각각 희석. 이러한 솔루션을 흔들어. (살전전자 미디어의 치료 10 μM의 GnRH-FITC 수 있습니다.) 1.35 mL를 완전 배지에 150 μL 세 10 μM의 GnRH-FITC 치료 매체의 각 희석. 뿐만 아니라 이러한 솔루션을 흔들어 (이것들은 1 μM의 GnRH-FITC 치료 중간). 주 : 치료 매체를 포함하는 모든의 GnRH-FITC가 빛으로부터 보호하고 몇 시간 내에 사용하여야한다. </li><li> 37 ° C까지 6의 GnRH-FITC 처리 매체 (단계 1.12에서 제조) 및 4 mL의 완전 배지를 예열. </li><li> 5 mM의 형광 프로브 솔루션의 3 μL 5 μm의 3 mL의 PBS에 (재료 목록에 언급 된 핵 Counterstain과)를 희석. 이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li></ol> 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) <ol><li> GnRH에 흡수 방법 <ol><li> 단계 1.6에서 제조 된 최초의 현미경 슬라이드를 타고 잘 칠 각각에서 전체 매체를 피펫. 예열이 완료 메디칼의 250 μL를 추가제 1 웰에 음. 음성 대조군으로 사용합니다. (1 μM, 3과 10 μM로 3 우물) 향후 6 우물 각 (1.13부터) 미디어를 처리 예열의 GnRH-FITC의 250 μL를 추가합니다. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 고정 용액 (10 % 중성 완충 포르말린)의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫, 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 마지막으로, 각 웰에 장착 매체의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 이미징 때까지 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. </리&gt; </ol></li><li> 의 GnRH-IR 발현 방법 <ol><li> 단계 1.7에서 제조 된 제 8 잘 현미경 슬라이드를 타고 다섯 우물에서 각각 전체 매체를 피펫. </li><li> 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가이 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 너무 두 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가하고 GnRH에 처리하기 전에의 GnRH-IR 발현을 조사 할 때 사용합니다. </li><li> 향후 3 우물에 250 μL 세 예열 된 10 μM의 GnRH-FITC 치료 미디어의 각을 추가합니다. 의 GnRH-IR 발현을 조사하기 전에의 GnRH-FITC 접합체와 세포를 전처리하는이 우물을 사용합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> GnRH의 처리 후는 GnRH-IR의 발현을 조사하고 예열 된 완전 배지 250 μL 이러한 웰을 세척하는 데 사용되는 각각의 3 개 웰로부터 처리 매체를 피펫. 250 추가μL의 세 각 웰에 완전 배지를 예열. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 다섯 우물 각각의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 솔루션을 고정의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫과 PBS 250 μL와 세포를 씻는다. 1 시간 동안, 각각의 웰에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블록 함유 PBS 용액 250 μL를 첨가하고 RT에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> (: 100 비율 1) 1 mL의 PBS에서의 GnRH-IR 차 항체의 10 μL를 희석. RT에 그것을 유지하고 몇 시간 내에 그것을 사용합니다. </li><li> 음성 대조군 (제 1도)를 제외한 각 웰에서 BSA 차단 솔루션을 피펫. (음성 대조군 잘 제외) 250 μL PBS로 세포를 씻으십시오. 250 μL PBS는 EAC로 단계 2.2.7에서 제조의 GnRH-IR 차 항체를 포함의 추가(음성 대조군 제외) 시간 잘. 어두운 곳에서, 1 시간 동안 RT에서 슬라이드를 부화. </li><li> (: 500 비율 1) 1.25 mL의 PBS에 알렉사 546 레이블 차 항체의 2.5 μL를 희석. 참고 :이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 다섯 우물 각각의 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 2.2.9에서 제조 된 AF 546 레이블 차 항체를 포함하는 PBS 250 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 용액을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 RT에서 10 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 후, 각 웰에 장착 미디어의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 어둠 속에서 슬라이드를 유지RT의 미세한 이미지까지. </li></ol></li><li> 영상 <ol><li> 이미지 (63X 오일 침지 대물 사용) 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 세포 <ol><li> 다음 여기 / 방출 파장을 사용합니다. GnRH에 콘쥬 게이트 : 514분의 488 nm의 알렉사 546 표지 된 항체 : 546분의 488 나노 미터 (만의 GnRH-IR 표현 방법 사용), DRAQ5 형광 프로브 : 680분의 633 nm의. </li><li> 음성 대조군 세포를 이용한 촬상 파라미터를 설정한다. 이미지 처리 된 세포에 이러한 매개 변수 (그림 3)를 사용합니다. 재조정 분석의 시작에서 각각의 미세한 슬라이드에 촬상 파라미터. 필요한 경우 제조업체가 제공하는 소프트웨어와 미세 조정과 수출 이미지. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) <ol><li> GnRH에 정량 방법 <ol><li> 단계 1.8에서 제조 된 판을 가지고 개에서 완전 배지를 피펫일곱 우물 채널. 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 1 ML을 추가합니다. 음성 대조군으로 사용합니다. 추가 1 mL의 향후 6 우물에 미디어 (1 μM, 10 μM 3 우물 3 우물)을 치료 예열 여섯의 각. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫. 조심스럽게 2 mL의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 우물에 트립신 EDTA 용액 500 μL를 추가합니다. 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 트립신을 중지 아니라 각에 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. 접시를 흔들어. 피펫으로 부드럽게 세포를 일시 중지하고, FACS 튜브에 각 우물에서 현탁액을 전송합니다. 4 ℃에서 4 분 동안 150 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 하나의 움직임으로 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 세포를 일시 중지 다시 부드럽게 각 FACS 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μL를 추가하고. 이 끝날 때까지 얼음에 튜브를 유지실험. </li></ol></li><li> 분석 및 계산 <ol><li> 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. 여기 들어, 488 nm의 아르곤 레이저 파장을 사용하여 검출을위한 530 nm 파장을 사용한다. 음성 대조군 세포를 실행하여 매개 변수 흐름 cytometer를 설정합니다. 처리 된 세포 (그림 4A)을 분석하려면이 매개 변수를 사용합니다. 제조업체의 소프트웨어와 데이터를 평가 중간 형광 세기 (MFI) 값을 결정하고, MFI 상대 값을 계산한다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한...

<html> 펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 1, 2를 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 -4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 (5, 6)에 대한 기회를 제공한다. 많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F &quot;&gt; 7, 8, 9. 이러한 펩티드는 악성 종양 세포에 높은 선택성을 가진 항암제를 제공 할 수있는 위에 표현의 GnRH-IR 6. 대응하는 접합보다 높은 선택성 및 더 나은 효율 몇몇 GnRH의 공액 항암 약물 무료 약물, 9 8 7보고되었다. 의 GnRH 펩타이드 및 그 수용체에 대한 이전 서적은의 GnRH-IR은 GnRH에 10 유사체에 대해 서로 다른 선택이 다양한 입체를 가정 할 수 있다고보고했다. 고도로 변수의 GnRH-IR은 복잡하고 다양한 신호 전달 경로는 자연과 인공 리간드 (11)에 대한 다른 활동이 부여되어있다. 이러한 사실은 GnRH에 기반 시스템의 조사가 도전합니다. 한편,<html> Y는 유망한 치료 가능성을 가지고있다. 방사성 표지의 GnRH 펩티드와 몇 가지 실험을 이전하는 형광 표지의 GnRH 유사체가 사용 된 12, 13, 14, 15,하지만 실험을보고되었다 여전히 제한되어 있습니다. 방사성 표지는 고감도를 제공하는 동안, 형광 표식은 여러 다른 장점, 예를 들면, 취급이 용이하고, 다른 형광체와 Counterstain과 능력을 갖는다. 성공적 약물 전달에 사용 된 일반적인 세의 GnRH 유사체는 -GnRH-I, [D-리스가 6] -GnRH-II와의 GnRH-III 있지만 타겟팅 잔기 이들 펩타이드의 효과 인 [6 D-리스]입니다 거의, 17 (16)을 비교합니다. 한편, 다른 암세포의 GnRH 유사체 사용 된 별도의 실험 결과는 다양하다. 이러한 고려 사항을 바탕으로 ntent는 &quot;&gt; 우리는 이들의 GnRH 펩티드의 대상으로 종양 및 약물 전달의 가능성에 집중하여 합성하고, [D-리스 6 (FITC)] 특징 -의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC를 )] -는 GnRH-II 및 [리스 8 (FITC)] -의 GnRH-III 펩티드 접합체 (18)이 유사 선택적 그들의리스 또는 D-리스 (펩티드 FITC 비 측쇄 1 FITC로 표지되어 각각에서 하나. 접합체). 아이디어는 선택적 형광 표식이 펩티드에 대한 새로운 정보를 제공하고, 그 양호한 추적 및 신뢰성 정량화를 허용 할 수 있다고 하였다. 이들 콘쥬 게이트는 쉽게 그들의 종양 타겟팅 효율을 비교할 수 있도록 안전한 취급 및 신뢰성 검출 능력을 가지며, 악성 종양 세포의 많은 종류의 선별. 우리는 최대 이러한 펩티드 접합체와 날짜 실험의 GnRH - 약물 접합체를 타겟팅하는 신규 한 암의 발전에 기여하고, 새로운 치료 타르를 식별하는 데 도움이 될 수있는 희망뿐만 아니라 가져옵니다. 본 원고의 GnRH-FITC 접합체 일부 잘 재현하고 빠른 실험을 보여줍니다. 는 GnRH-R의 세포 표면 발현은 거기서 동시에 시험 세포주에서의 GnRH-IR의 세포 표면 수준을 조사, GnRH에 대한 흡수 한정적 조건이다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)으로의 GnRH-IR과의 GnRH-FITC 접합체를 시각화 한 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량.

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0820</td><td>Human lung squamous cell carcinoma</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>Human pancreatic adenocarcinoma</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>Human pharyngeal carcinoma</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Culture medium for BxPC-3 cells</td></tr><tr><td>Eagle&#039;s Minimum Essential Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td><td>Complements the culture medium</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>Complements the culture medium (antibiotics)</td></tr><tr><td>Standard Line Cell Culture Flasks</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>Provide consistent, sterile growth environment for cells</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Mixture&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Remove attached cells</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Used to counting cells</td></tr><tr><td>[D-Lys&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-I</td><td>made by us</td><td>-</td><td>Purity &amp;ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[D-Lys&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-II</td><td>made by us</td><td>-</td><td>Purity &amp;ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[Lys&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-III</td><td>made by us</td><td>-</td><td>Purity &amp;ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>glass bottom 8-well microscopic slide</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Use in CLSM experiment</td></tr><tr><td>Corning Costar cell culture plate, 12 well</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>Use in FACS experiment</td></tr><tr><td>Fixing solution (10% neutral buffered formalin)</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>Fix adherent cells</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>Prevent the nonspecific binding of the antibodies</td></tr><tr><td>GnRHR Antibody</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors</td></tr><tr><td>Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody</td></tr><tr><td>Fluorescent probe solution (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>Counterstain nuclei</td></tr><tr><td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>Use in CLSM experiment, preserving fluorescence</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Elektro-Optika Ltd.&amp;nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>Check the phenotype and confluency of cell cultures</td></tr><tr><td>Inverted confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>Use in CLSM experiment</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>Use in FACS experiment</td></tr></tbody></table>

in vitro imaging and quantification of the drug targeting efficiency of fluorescently labeled gnrh analogues

의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 &#39;세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II와 [리스 8 (FITC)] - GnRH에이 원고는 [D-리스 6 (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 - 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.

공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 얻어진 영상은 시간 및 농도 의존적으로 주어진 세포 배양에서의 GnRH-FITC 접합체의 흡수에 대한 훌륭한 정보를 제공한다. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병행하여, 세포 표면에의 GnRH-IR의 존재는 CLSM 실험에 의해 검증 가능하다. 또, 원적외선 DNA 염색 형광 프로브를 이용하여, 그것과는 GnRH의 GnRH-IR 외에도 세포의 핵을 Counterstain과 수있다....

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In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

in-vitro-imaging-quantification-drug-targeting-efficiency

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

7.6K 조회수.  Semmelweis University.  선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다. 

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Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

연구

화학

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

생체공학

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

생화학

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

의학

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

생물학

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

신경과학

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...