Name: isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation at JoVE.com

우리는 펜실베니아 주립 대학교 밀레니엄 과학 단지에서 Flow Cytometry 핵심 시설을 감사 하 고 싶습니다.

<ol>
	<li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages:+Then+and+Now.">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li><li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity,+Atherosclerosis,+and+Hepatosteatosis.">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li><li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. 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W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+Flow+Cytometry:+A+Practical+Approach.">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13 (2014).</li><li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+switching:+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation.">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li><li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment.">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li></ol>

저자는 공개 관심의 충돌이 있다.

아 테 롬, 간단한 steatosis steatohepatitis 공동 morbidities을 모방 하 고 제 2 형 당뇨병 다이어트 유발 대사 장애 모델 광범위 하 게 질병의 진행의 기본 분자 메커니즘을 더 잘 이해 하는 데 사용 됩니다. 콜라 종속 소화 자주 분열 조직의 세포 외 기질 (ECM)16,27에서 해방 하는 데 사용 됩니다. 콜라 같은 효소 콜라겐 세포를 이웃에 대 한 구조 지원을 제공 하는 중단. 조직 구조 구성 지시 조직 매트릭스 강성 (변형 저항) 그리고 원유 콜라 제품 성공적인 ECM 중단28보장에 가장 효율적입니다. 와트, "부드러운 매트릭스"의 구성 되는 자주 콜라 유형 ii 동시에 세포 표면의 인슐린 수용 체29의 무결성을 유지 하면서 해방 adipocytes와 주민 면역 세포를 소화 된다. 대동맥의 fibril 구성 요소 마이크로 추가 효소와 함께에서 (이 높은 콜라 활동) 콜라 종류 사이 효과적인 대동맥 소화 사용 "뻣 뻣 한 매트릭스"에 기여 한다. 대동맥, 달리 간 소화 행렬을 방해 하 고 가능한 parenchymal 및 비 parenchymal 세포30해방에 약한 효소 활동, 콜라 종류 IV는 콜라를 사용 합니다. 만성 염증된 조직에 적절 한 효소 소화를 방지할 수 있는 배경 종종 개장 받아야 C57BL6 마우스 다이어트 먹이 야생 타입 또는 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코)에서 파생. 이 섹션은 최소화 부적절 한 조직 분리 및 낮은 셀 복구의 가능성을 제거 하는 전략을 논의할 예정 이다.
비만, 동맥 경화, 또는 비 알코올 지방산 간 질환, 모방 다이어트 먹이 마우스 모델에서 파생 된 조직의 일반적인 기능은 비정상적인 조직 리 모델링 이다. 백색 지방 조직, 대동맥, 그리고 간, ECM 구성 변경, collagens 등 원 구성의 과도 한 증 착에서 자주 발생. 18 주 동안 높은 지방 다이어트에 유지 하는 야생 타입 C57BL6 마우스 확장된 백색 지방 조직 등 조직 관련 이상 경험 하 고 지방 (간단한 방증) 확대. 종종 이러한 대사 기능은 성가신 장애물을 조직 분리 과정에서 극복 되지 않습니다. 다른 한편으로, 거울 더 악화 고기 다른 다이어트 유발 모델에서 조직의 광범위 한 리 모델링 발생할 수 있습니다 문제가 조직 소화 하는 동안. ApoE 코 쥐를 먹이 하는 HFHCD에 사용 되는 모델 아 테 롬 및 steatohepatitis. 고급 steatohepatitis와 관련 된 일반적인 기능 간 (또는 섬유 증) ECM의 과도 한 증 착 이다. 거리 간 효소 조직 분리 하는 동안 꽤 문제가 될 표시 되었습니다 하 고 종종 낮은 셀 수율31를 생성 합니다. 셀 수율 개선, 소화 프로토콜 편차 없이 따라야 중요 하다. 정상적인 간은 다진 수 있으며 분리를 달성 하기 위해 소화 버퍼에 빠져들, 소화 버퍼와 관류 극대화 접촉 간 세포 외 매트릭스와 콜라 솔루션; 그리고 따라서이 방법은 것이 좋습니다. 또한, 소화 버퍼의 20-30 mL는 종종 정상적인 간;의 성공적인 분리에 대 한 적절 한 볼륨 그러나, 개발 확대 및 거리 간 마우스 모델에 관해서는, 소화 버퍼의 50 mL와 관류 세포 죽음을 최소화 하면서 적절 한 소화를 위해 선호 된다. 간을 크게 1.5 g을 초과 하는 무게와, 소화 버퍼의 볼륨을 증가 것이 좋습니다 성공적인 소화 되도록.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>조직</td>
			<td>문제</td>
			<td>가능한 이유</td>
			<td>솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>흰색 Adipose 조직 (WAT)</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>확인 소화 버퍼 37° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td>대동맥</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>대동맥 소화 버퍼에서 했다 너무 커서</td>
			<td>대동맥 약 1 m m 조각으로 잘라 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>대동맥 조각 인큐베이션 기간 동안 분리 버퍼에 떨고 하지 했다</td>
			<td>대동맥 조각 소화 솔루션에 떨고는 반드시</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td>간</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 증가</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>IVC (붓기 조직의 주변 IVC 발생)의 부적 절 한 cannulation</td>
			<td>바늘에는 IVC 올바르게 삽입 하십시오</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>파열된 IVC</td>
			<td>관류 이전 IVC에서 제대로 보안 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>관류 속도 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>파열된 조직</td>
			<td>관류 속도 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>잘못 된 릴리스 Glisson의 캡슐에서 셀의</td>
			<td>반드시 캡슐을 사용 하 여 세포 분열을 쓰 다듬어 메서드는 이전에 논의</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 문제 해결 실패 조직 분리. Flow cytometry 기반 셀 정렬 또는 FACS 순도 필요 세포 인구를 고립 시키기를 위한 강력한 기술입니다. 셀 정렬 셀을 정화 때 달성 높은 셀 생산량 뿐만 아니라 고 순도 정렬 적절 한 정렬 전략을 사용 하 여 필요 합니다. 이 섹션에서는 멀티 fluorophore 개선을 위한 방법 cytometry 기반 셀 정렬 조직 거주 macrophage 규정식 먹인 쥐에서 파생 된 설명의 흐름. 별개 조직 상주 대 식 세포 분리, 표면 마커 선택은 중요 한 단계입니다. 종종 와트, 대동맥, 그리고 간은에서 파생 된 대 식 세포는 CD45를 사용 하 여 고유+, CD11b+, F4/80+ 게이팅 전략. 추가 흐름 cytometric 패널 조직 주민 대 식 세포를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 대 식 세포 특정 glycoproteins (CD64, CD68, 그리고 CD14) 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHCII)의 표면 표현에 대 한 조사는 항 체를 포함 하는이 패널과 apoptotic 세포 티로신 키 니 아 제 수용 체 (MerTK)32, 33. 특정 대 식 세포 표현 형 M2의 선택적 표면 표현에 대 한 의해 delineated 다음 수 (CD163, CD209, 및 CD206) 또는 M1 마커 (CD38, CD40, CD80, 그리고 CD86)34,35. 지질-라덴 대 식 세포에 의해 생성 된 자동 형광 인구 게이팅 때 몇 가지 문제를 제시할 수 있습니다. 형광 노랑-녹색 레이저 (PE, PE/Cy5 PE/Cy7 등)에 의해 흥분 하는 태그로 항 체를 사용 하 여 또는 (와 같은 송출, APC Cy7) 빨간 레이저는 자동 형광 보다 훨씬 밝은 방출된 형광 고 따라서 향상 시킬 수 있습니다. 결과36. 같은 높은 착 색 인덱스 및 잠재적인 방출 스펙트럼 중복 변화 fluorophore를 선택 하는 경우 해당 컨트롤의 포함은 중요 합니다. 긍정/부정 인구의 묘사와 각각 1 차 항 체에 의해 발생 하는 일반적인 배경 신호 측정에 대 한 단일 얼룩 (SS) 컨트롤 및 isotype 컨트롤의 포함 허용 제어 경계를 식별 하는 경우 37. 세포가 부족 한 상황에 대 한 SS와 isotype 컨트롤에 대 한 보상 입자를 사용 하 여 것이 좋습니다. 보상 입자 일반적으로 생물 학적 컨트롤 보다 밝은 신호를 방출 하 고 또한 배경 형광에 있는 더 적은 편차. 또한, 마이너스 1 (FMO) 컨트롤 형광 제어 경계 묘사에 이상적입니다. FMO 컨트롤을 포함 하 여 얼룩 하위 집합에 대 한 예상 최대 형광은 형광 색소 태그 항 체는 특정 형광 채널에 대 한 특정 제외 된38때 주어진된 채널에 계시 된다. 단일 스테인드 보상 입자 컨트롤 뿐 아니라 우리의 경험에는 흠 없는 생물 학적 비교 컨트롤 더 정확한 긍정적인/부정적인 경계를 설정 하기 위한 포함 되어야 합니다.
세포질 파편 및 제어 전략에서 셀 집계 제외 자동 형광을 최소화 하는 데 사용 하는 추가 접근 이기도 합니다. 실행 가능한 세포 인구 세포 파편 구별, 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC)를 사용 하 여 가장 일반적인 제어 전략 이다. 게시물 정렬 분석에 사용 됩니다와 DNA/RNA 추출에 대 한 높은 가능성을 필요로 하는 셀에 대 한 격리, 그 생존 얼룩 사용 하지 고정 및/또는 permeabilization 절차 것이 좋습니다. 포름알데히드 셀의 고정 때문에 핵 산 단백질 가교 핵 산 무결성을 손상 하 고 따라서 격리 효율성, 검출 및 정확한 정량화를 제한할 수 있습니다. 셀 집계 하기 전에 언급 한 대로 내보낸된 자동 형광 신호를 기여할 수 있지만 또한 "우연의 일치 중단"에서. 정렬에서 고 순도 유지 하기 위해 이러한 작업이 발생 하지만 경우 너무 자주, 그것은 정렬된 셀 수확량 감소. 정렬 버퍼 (버퍼 FACS) 셀 얼룩 동안 DNAse 및 MgCl2 보충 셀 집계를 최소화할 수 있습니다. 그것은 그것은 효소의 활동을 억제로 함께 DNAse EDTA를 사용 하지 않는 것이 좋습니다. 정렬 전에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 단일 세포 현 탁 액을 필터링 집계에서 셀 해방 또한 수 있습니다. 집계를 최소화 하기 위해 셀 정지 한다는 것 0.4 mL의 최소 볼륨에 mL 당 5 백만 셀의 농도에 주의 하는 것이 필수적입니다. 라덴 지질 조직에서 분리 된 셀 집계 하는 경향이 경향이 있고이 일치 될 수 있습니다 중단 되 고 낮은 정렬 항복. 집계 지속 되 면 샘플 희석 더는 것이 좋습니다. 정렬 된 대 식 세포 세포 복구를 최대화 하기 위해 태아 소 풍부한 매체를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 컬렉션 튜브에서 수집할 수 있습니다. 초기 높은 FBS 농도 농도 결국 각 정렬된 방울 희석 된다 이후 셀 복구를 보장 합니다. 수집 DNA 또는 RNA 분석에 사용할 수 있는 셀, 셀 (예: TriZol) RNAse 오염을 방지 하기 위해 적절 한 추출 시에 직접 정렬할 수 있습니다. 높은 볼륨을 정렬할 때 정렬 셀 처음 문화 미디어 FBS의 더 낮은 농도 가진 보충으로 것이 좋습니다. 바로 다음 정렬, 셀 다음 수송과 고 DNA/RNA 추출 lysed. 격리 된 유전 물질 변경된 유전자 발현에 대 한는 프로 파일링 될 수 있습니다. 프로-염증 성 유전자 등 TNFα, IL1-β, 일리노이-6, 일리노이-12, 1 L-23, IFNγ, Nos2, MCP1 (CCL2) upregulated 고전적인 활성화 (M1) 형39전시 세포에 많습니다. 다른 한편으로, 또는 활성화 (M2) 표현 형 세포에 종종 인코딩 Chi3l3 유전자의 유도 의해 표시 된다 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, 10-CD209 1 L, 및 TGFβ34,40. 최근, CD38, Fpr2, 및 Gpr18 M1 관련 유전자 및 c-Myc Egr2 M2 특정 유전자34로 검증 되었습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 기반 셀 정렬 순도에서 세포를 분리 하는 데 유용한 도구입니다,이 이렇게 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. FACS 중재 정렬의 강력한 장점 셀 정렬 셀 정렬 유지 보수 시 약의 높은 비용 이외에 기동 수 작업 인원에 따라 달라 집니다. 다른 접근 방식의 대체 비용이 많이 드는 흐름 기반 cytometry 셀 정렬에 사용할 수 있습니다. 그들은 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 또는 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 포함 합니다. 정렬 방법 언급 한 첫 번째 대체 셀 포함 자석 또는 microbead 열 절연 키트 혈액 또는 단단한 조직41에서 관심의 세포를 분리. 접근을 정렬 하는 두 번째 셀 밀도 및 원심의 힘에 따라 다른 유형의 세포 현 탁 액을 분리 한다. 불행 하 게도, 밀도 중재 원심 대동맥 또는 와트 파생 된 단일 셀 정지에서 세포를 분리 하는 데 실용적이 지 않습니다. 때때로, 차동 원심에서 얻은 제품, 오염 그리고 낮은 항복. 따라서, 처음 효소 소화 다음 몇 셀의 결과 (예: 대동맥 또는 와트) 작은 조직 차등 원심 분리에 대 한 이상적인 후보가 되지 않습니다. 다른 한편으로, 해리 간은에서 파생 된 셀 정지 게시물 정렬 실험 및 문화 stimulations, 정량, 또는 서쪽 더 럽 히 분석 등 분석에 사용할 수 있는 정렬 된 대 식 세포의 적절 한 번호를 생성할 수 있습니다. 이러한 대체 방법은 FACS, 청소기 종류에 대 한 수 전에 인구를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 메모의 조직 주민 대 식 세포는 와트, 간 및 대동맥 전체 셀 인구의 작은 비율을 확인합니다. FACS 정렬 하기 전에 셀의 농축 접근 덜 자주 셀의 인구를 분리 하는 때 사용 되었습니다. 작은 인구를 고립 시키기에 공통 되는 하나의 문제는 그 큰 셀 번호 후속 분석을 위해 충분 한 세포를 처리 해야 합니다. 농축 또는 미리 정렬 같은 문제를 해결 하려면 사용할 수 있습니다. 이 방법은 긍정적이 고 부정적인 선택을 통해 세포의 더 간결한 인구를 얻기에서 에이즈 하지만 또한 시간의 절약 FACS 정렬 간 같은 조밀한 조직 소스에 대 한 지속적인 프로세스 일 수 있다.
염증 생물학의 최근 발전 만성 염증 조절에 이러한 면역 세포의 복잡 한 역할의 이해를 심화 하기 위해 대 식 세포 이종의 phenotypic와 기능 특성의 중요성을 강조 표시 합니다. 간단히,이 포괄적인 프로토콜 조직 설립된 다이어트 유발 된 비만 및 염증 모델에서 공부 하는 3 개의 각 인 조직에서 거주 세포 특성화에 대 한 다차원 접근을 제공 합니다. 더 중요 한 것은이 프로토콜은 계정에 어려움 하 고 깨끗 한 분리 하는 데 필요한 조치 단일 셀 정지 dysregulated에서 와트, 대동맥 플 라크와 지방 간 조직 염증이. 프로토콜 연구원을 cytometry 및 FACS 조직 주민 대 식 세포, 비만에서 염증의 주요 규제 하는 혁신 차원에서 정렬 도구를 적용할 수 있습니다. 대 식 세포 인구 역학의 심층적인 특성화 monocyte 염증된 조직에서 인신 매매에 대 한 통찰력을 제공 하 고 정렬 된 대 식 세포에 실험적인 접근의 무리를 통해 지속적인된 기계적 평가 대 한 허용 수 있습니다. 대 식 세포 인구의 더 특성화 macrophage이 건강과 질병을 조절 하는 생물학적 토대에 대 한 중추적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

마우스 모델 인간의 질병의 역학 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 병에 걸린 상태에서 쥐에서 조직 거주 세포의 적절 한 절연1질병 병 인에 분자와 세포질 기여를 이해 하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 중요 한 중요 한 장애는 비만 이다. 비만의 발생률 인슐린 저항을 가진 동시에 전세계 상승 입력 2 당뇨병, 심혈 관 질환, 지방 간 질환2,3계속 됩니다. 과도 한 영양소 소비는 더4대동맥과 간 등 다른 주변 조직 세포 주위를 변경할 수 있습니다 지방 조직에서 나오는 변경된 신호 트리거링 줄된 신체 활동에 의해 비뚤어진 다. 같은 변화 항상성 장애 만성 낮은 학년 조직의 염증5발생합니다.
흰색 adipose 조직 (WAT)을 그들의 신규 모집 뿐만 아니라 대동맥 및 간 거주 대 식 세포의 클래식 활성화 뿐만 아니라 신진 대사 신호 dysregulation를 시작 하지만 염증6,7유지 표시 되었습니다. 대 식 세포의 phenotypic와 기능적인이 질은 비만의 병에 강하게 연관 공동 morbidities7관련. 대 식 세포 분극에 동적 소성 전시 진행 협조 하는 활성화 된 고기의 범위와 염증8의 해상도를이 셀에 대 한 수 있습니다. 고전적인 활성화 (M1) 세포는 염증의 전파에 연루는, 하는 동안 또는 활성화 (M2) 세포 해상도 조직 수리9,10와 연결 되었습니다.
으로 신체 대사 스트레스를 겪 습, 백색 지방 조직 비정상적으로 축적. 확장 된 지방 조직 매력과 뿌리깊은 인슐린 저항, 혈당 및 궁극적으로 2 형 당뇨병, 인슐린 저항 또는 혈당11, 홍보 일반 체형 기능을 변경 하는 염증 성 세포 유지 12. 동시에 발표 하는 염증 성 신호에 응답 개장 한다 백색 지방 조직 침투 고전적인 활성화 (M1) 지방 조직 대 식 세포 (Atm)13,14. 이 멀티 셀룰러 기관 간4대동맥 등 다른 신체 기관의 정상적인 기능 derails 신호 폭포를 발휘 한다.
간 근처 dysregulated 와트15에서 발생 하는 자극에 적응 하는 신진 대사 강국 이다. 간 세포 또는 Kupffer 세포 신진 대사 변화에 대응 parenchymal 모두 변환 하는 선 동적인 cytokines 및 비 parenchymal 세포 표현 형을 분 비 하 고 조직 리 모델링 추진. 간 장의 지질 축적, 염증, 과도 한 세포 외 기질 예금, 괴 사 및 간 손상의 넓은 스펙트럼에 기여 하는 염증 성 모욕 비 알코올 지방산 간 질환 와 관련 된 최종 기능 손실 다음과 16,,1718.
손상 된 와트와 간 기능에 병렬로 큰 동맥 시체는 만성 대사 스트레스19를 겪 습으로 동맥 벽 내 지질 축적. 내 피 세포를 활성화 하 여 발산의 분 비 및 monocytes20의 후속 모집 동맥 지질 축적을 트리거합니다. 일단 채용, monocytes 증식, 분화, 단백질을 섭취 하 고 거품 세포가. Atherogenesis를 시작 하 고 프로-염증 성 활동의 지속적인 채용 및 조직 거주 지질 라덴 대 식 세포. 이 atherogenic microenvironment에 릴레이 extracellular와 세포 스트레스 신호에 굴복, 이러한 세포는 다음는 apoptotic 신호 폭포에에서 종사. 이 거품 세포는 죽지로 그들은 그들의 지질 가득 괴 사 성 병 변, 다음 플 라크 파열, 심근 경색과 뇌졸중에 이르게 핵심 내용을 기여.
대 식 세포 고기의이 부분에 와트, 간 등 대동맥8,21dysregulated 조직에 염증 성 변화에 의해 유도 된 비만 총괄. 채용 그리고 조직 상주 대 식 세포 대 식 세포 표현 형1를 조작 하는 잠재적인 분자 표적에 대 한 통찰력을 제공할 수 있다. 효과적으로 비만 유발 염증된 조직에서 세포 특성, 단일 세포 현 탁 액은 효소 소화를 통해 얻어질 수 있다. 이러한 분리 프로토콜 충분히 결합 조직 면역 세포 죽음을 최소화 하 고 최적의 셀 수익률을 제공 하는 동안 저하에 효과적 이어야 합니다. 효소 혼합 조직 및 그것의 구조상 메이크업의 종류에 따라 달라 집니다. 대동맥 등 탄력적인 조직 간와 와트, 조직 분리를 달성 하기 위해 강력한 효소 활동을 요구 한다. 단일 세포 현 탁 액에서 조직 주민 대 식 세포 수 명확 하 게 특징 또는 transcriptional 프로 파일링 같은 추가 다운스트림 분석에 대 한 격리.
여기는 조직 관련 프로토콜 설명 하는 콜라-종속 조직 소화와 색채 cytometry 효과적으로 분리 하 고 유도 하는 전통적인 다이어트 비만에서 얻은 조직 상주 세포 특성화를 사용 하 동맥 경화 증, 간단한 steatosis 및 steatohepatitis 마우스 모델입니다. 백혈구-(CD45 또는 CD11b)와 대 식 세포-에 대 한 항 체와 세포 표면 마커 얼룩 동시 (f 4/80) 특정 항 원 자주 사용 한다 대 식 세포 인구22식별 하. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 고 순도에서 이러한 확인 된 인구를 정렬 하는 데 사용 하는 강력한 전략 이다. 정렬 된 인구 다음 형 특정 유전자 프로 파일 (예: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응) 다운스트림 분자 분석23을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 표준 cytometry와 교류 cytometry 기반 세포 분류는 크게 다른 유형의 세포 현 탁 액 내에서 세포를 구별에 강력한 도구, 비록 전 프로토콜 성공적인 출력 되도록 낙관 되어야 한다. 이 연구에서는 프로토콜을 효과적으로 분리 하 고 가능한 조직의 특정 세포 특성화 설명; 더 중요 한 것은,이 연구는 사전 및 문제 해결 전략을 방지 또는 해결 뿐만 아니라 자주 발생 하는 기술적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 in Needles</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. Needles</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with rubber stops</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 Fc Block&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rat IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainers</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&amp;nbsp;</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Spring dissection scissors &amp;ndash; 3 mm Cutting edge&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curved 0.07 mm x 0.04&amp;nbsp;mm Tip Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps (Curved)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cell Culture/Petri Dishes</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;(Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasse Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL beaker&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Hemostatic clamp</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Toothed forceps</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m Disposable filters</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride Potassium (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Razors (0.22 mm (0.009&quot;))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Live/Dead stain</td><td></td><td></td><td>Red viability stain (in &lt;strong&gt;Figure 1A&lt;/strong&gt;)</td></tr></tbody></table>

isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation

비만 크게 조직 상주 세포 monocyte 파생 된 대 식 세포에 의해 중재 만성 염증 상태를 촉진 합니다. 다이어트 유발 된 비만 (DIO)는 대 식 세포가;의 역할을 공부 하 고 귀중 한 모델 그러나, 적절 한 대 식 세포 격리는 염증된 조직에서 취득 하기 어렵다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 단계와 높은 지방 (HFD) 또는 높은 콜레스테롤 높은 지방 (18 주 다음 쥐에서 조직 상주 대 식 세포의 적당 한 인구를 얻기 위한 우리의 연구에서 파생 된 필요한 문제 해결 지침 개요 HFHCD) 규정식 내정간섭입니다. 이 프로토콜은 비만 동맥 경화는 간, 대동맥, 흰색 adipose 조직 (WAT) 등에서 공부 하는 3 각 인 조직에 초점을 맞추고. 우리가 어떻게 dualistic 사용 강조 흐름의 cytometry 격리의 새로운 차원과 조직 상주 대 식 세포의 특성을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 기본 섹션에서는 기본 조직 관련 효소 소화 및 대 식 세포 격리, 이후 세포 표면 항 체 얼룩이 흐름 cytometric 분석에 대 한 복잡 한 합니다. 이 프로토콜 기존의 복잡 한 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 기본 해결 하 고 적절 하 게 정렬 된 세포 인구에서 광범위 한 특성을 얻을 수 있도록 이러한 복잡성을 설명 제공. 대체 농축 방법 FACS 작업할 때 유연성 및 시간 관리에 대 한 수 있도록 밀도 간 같은 셀 정렬에 대 한 포함 되어 있습니다. 간단히,이 프로토콜 macrophage 다양 한 주어진된 연구에서 염증된 조직에서에서이 평가 하는 연구를 보조 하 고 유리한 세포 분리 및 특성에 대 한 성공적인 통찰력 있는 문제 해결 팁을 제공 합니다. DIO 중재 염증에서 면역 세포.

18 주, 1 x 104 -2 × 104 CD45 (HCHFD 또는 HCD) 높은 지방 높은 콜레스테롤 다이어트 유지 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코) C57BL/6 (BL6) 마우스를 사용할 때++ F4/80 두 표본이 때 대동맥 세포 격리 될 수 있습니다 풀링된. ApoE 코 HFHCD 먹인 쥐에서 해 부 간은 5 x 105 정렬 Kupffer 세포 (사용 가능한 정렬 시간에 따라 달라 집니다) 보다 더 큰 생산. 먹 일 때 높은 지방 다이어트 (HFD)를 사용 하 여 야생 타입 (WT) C57BL/6 마우스, stromal 혈관 분수 (SVF)에서 5 x 105 1 x 106 거주 지방 조직 대 식 세포 (Atm)를 정렬할 수 있습니다. 대 식 세포는 특정된 조직에서 정렬할 수 있습니다 언급 한 총 수 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여 유전자 표정 분석을 수행 하기 위한 적절 한 했다. 대동맥, 같은 대 식 세포 인구의 적은 숫자 복구는 조직에 대 한 이러한 분석에 필요한 RNA를 분리 하는 때 공동 침 (예: glycogen)와 하룻밤 강 수를 사용 하는 것이 좋습니다.
여기, 다이어트 유발 대사 장애의 효과 기본 사용 하 여 대 식 세포 표현 형에 흐름 cytometry, 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS), 다운스트림 게시물 정렬 분석 표시 됩니다. 이 발견 이전에 게시 관측 쥐 대동맥 (그림 1B) 등 영향을 받는 조직에 고전적인 활성화 (M1) 세포의 HFD 또는 HFHCD 전시 증가 침투를 먹이 확증. Cytometry, FACS, 및 유전자 식 프로 파일링의 활용 (정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 론 수용 체 티로신 키 니 아 제 표현 CD45 위한 predominating 표현 형을 통해+ + F4/80 대 식 세포에서 파생 된 규정식 먹인 쥐에서 분리 된 조직 관찰 되었다. 론 수용 체 표현 대동맥 대 식 세포는 항 염증 성 표현 형을 설명 하는 HFHCD 먹인 쥐 (그림 1 c 와 D) 감소 했다. 정렬 된 론 표현 하는 수용 체 세포 (그림 1E) 확고 M2 대 식 세포 마커 인 1 (Arg1) 유전자 발현 소화 aortas 시연된 증가 arginase에서 파생. 프로-염증 성 세포로 CD45 특징은+ + CD11c F4/80+ aortas HFHCD 먹인 쥐 (그림 1B와 D)에서 절연에 증가 했다. 론 수용 체를 표현 부분 모집단 (그림 2A)의 통용 형 해명 더 간 상주 세포 특성화. CD11c + 프로-염증 성 대 식 세포 인구 감소 식 Arg1 및 론 (그림 2B)와 같은 항 염증 제 (M2) 형와 강하게 연관 되는 유전자의 시연. 유사한 동향은 소화 흰색 adipose 조직 (그림 3)에서 고립 된 대 식 세포 인구에서 관찰 되었다. 프로-염증 성 서명으로 대 식 세포 인구 론 수용 체 (그림 3)의 감소 표면 표현을 했다. 결정적인 데이터를 더 론 수용 체 세포32대체 (M2) 활성화의 레 귤 레이 터로 확인 결과 결합 하 여 접근, 기본 cytometry 및 FACS. 이러한 바이어스는 항 염증 제 (M2) 형으로 개발 및 비만, 동맥 경화 및 steatohepatitis31의 진행에서 보호 역할을 보여줘 왔다.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig1.jpg"> 그림 1: 천연된 대동맥에서 고립 된 세포의 ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 제거. (A) 셀 CD45에 문이 먼저 했다+ 백혈구, 세포질 파편을 제외 하 고. (B) CD45 세포를 것으로 추정 두 배 긍정적인 인구를 나타내는 데 f 4/80와 함께에서 얼룩. CD11c의 비율을 보여 주기 위해 사용 되었다 추가 게이팅+CD45+F4/80+ (M1)와 (C) 론+CD45++ (잠재적인 M2) f 4/80에 쥐에서 파생 된 aortas에서 대 식 세포 먹이 일반 차 또는 18 주에 대 한 높은 콜레스테롤 다이어트. (D) CD11c의 비율을 증가+CD45+F4/80+ (M1)+F4/80+ (잠재적인 M2) 론+CD45의 감소 비율 뿐 아니라 대 식 세포, 대 식 세포는 aortas에서 관찰 되었다 쥐 쥐 먹이 정상적인 차 다이어트에 비해 HCD 먹이에서 파생 된. (E) 유전자 표정 분석 정렬된 론+CD45의+F4/80+ 세포 증가 표현의 arginase 시연 나 (잘 알려진 murine M2 표식). 값 < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 학생의 t-검정 분석 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 의미 ± SEM. P로 표시를 사용 하 여 가져온 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig2.jpg"> 그림 2: ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 해 부 유전자 사본 Kupffer 세포 인구에서 소화 간 정렬의 프로 파일링. (A) 특성화 및 Kupffer 세포 인구를 정렬에 대 한 일반적인 제어 체계. (B) 정렬 론 (Ron+) 표현 및 비-표현 (Ron-) CD45 유전자 표정 분석++ F4/80 양적 RT PCR에 의해 세포. 스튜던트 t-검정 분석 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 값 ± SEM. P < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 의미를 표현 했다 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig3.jpg"> 그림 3: 특성의 Atm에서 WT BL6 마우스 해 부 백색 지방이 많은 직물에서 고립 된 18 주 동안 한 HFD 먹이. 특성화 및 지방 조직 정렬 (A) 일반적인 제어 방식 파생 된 대 식 세포 인구 CD45 내의 셀 (B) 비율의 론 +++CD11c F4/80- 및 CD45++CD11c F4/80+ 와트에서 정렬 하는 대 식 세포 인구. 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.1K 조회수.  The Pennsylvania State University. 이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

연구

면역학 및 감염병학

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

생화학

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a variety of particles. Normally, BMDMs are restricted from the central nervous system (CNS), but following an injury, they can readily infiltrate. Once within the injured CNS tissue, BMDMs are the primary cell type responsible for the clearance of injury-derived cellular debris, including large quantities of lipid rich myelin debris. The neuropathological ramifications of BMDM infiltration and myelin debris phagocytosis within the CNS are complex and not well understood. The protocols described here, allow for the direct in vitro study of BMDMs in the context of CNS injury. We cover murine BMDM isolation and culture, myelin debris preparation, and assays to assess BMDM myelin debris phagocytosis. These techniques produce robust quantifiable results without the need for significant specialized equipment or materials, yet can be easily customized to meet the needs of researchers.

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

We present methods to assess the phagocytic capacity of primary murine bone marrow-derived macrophages using fluorescently labeled myelin debris and intracellular lipid droplet staining.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

신경과학

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

의학

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...