Name: defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
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이 작품은 영국의 재생 의학 플랫폼에서 상 (MRC MR / L022974 / 1, MR / K026666 / 1) 중국 장학금으로 지원되었다.

참고 :이 프로토콜에 사용 된 모든 시약 공급 업체 정보는 표 1에 나열되어있다. 세포가 그들과 직접 접촉을 할 때 모든 미디어 / 판 멸균 적어도 실온에서해야한다. 1.과 Passaging 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 라미닌 (521) 상에 참고 : 아래에서 설명하는 세포 계대 절차는 하나의 셀을 기반으로 hPSCs에서 간세포와 같은 세포의 균일 한 인구의 유도에 이상적이다. 콜로니 도금에도 적용 이전 24 설명되었다. <ol><li> 필요에 따라 라미닌 - 코팅 된 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 4 ° C에서 재조합 라미닌 521 (LN-521)의 100 μg의 / mL의 주식을 녹여. </li><li> 얼음처럼 차가운 1X DPBS에서 해동 LN-521을 희석 (칼슘과 / 마그네슘 2+) 5 μg의 / mL의 용액을 확인합니다. </li><li> 5 μg의 1 ml의 추가 / mL의 LN-521 6 웰 플레이트의 용액을 코팅 한 잘바위는 잘에 균등하게 확산합니다. </li><li> 긴급 사용 또는 밤새 4 ° C 냉장고에 4 시간 - 2 37 ° C / 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 필요에 따라 4 ° C 냉장고에있는 라미닌 - 코팅 된 플레이트를 저장합니다. 평평한 표면에 접시를 유지하고 증발과 오염을 방지하도록 밀봉. 참고 : 코팅 우물이 건조하게하지 마십시오; 필요한 경우 (칼슘 / 마그네슘 2+)와 추가 1X DPBS로 그들을 위로. 이주 내에서 판을 사용합니다. </li></ol></li><li> 1 시간 - 예비 코팅 된 플레이트의 필요한 수가 0.5 37 ℃에서 플레이트를 사용하기 전에 실온에 도달하거나 배양 허용. </li><li> 조심스럽게 코팅 된 표면에 손상을주지 않고 코팅 LN-521 솔루션을 대기음. 참고 : 그것에 세포를 파종하기 전에 코팅 표면이 손상되지 중요합니다. </li><li> 즉시 10 μM의 Rho 관련 키나제 (ROCK) 억제제 Y2 보충 미리 예열-mTeSR1 매체의 1 mL를 넣어7632 6 웰 플레이트 잘 하나. 세포를 수신 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 떠난다. 참고 : 라미닌 코팅 우물이 건조 할 수 있도록하지 마십시오. </li><li> 약 75 % ~ 85 %의 포화 상태로 잘 유지 hPSCs에서 매체를 기음. 상온 1X DPBS 1 ㎖ (없음 칼슘 / 마그네슘 2+) 한 번 6 웰 플레이트의 한 우물에서 세포를 씻으십시오. </li><li> 셀에 1 배 Accutase 0.5 mL를 넣고 6, 37 ° C에서 부화 - 세포를 해리 8 분. 참고 : 소화가 충분히인지 여부를 확인 부드럽게 판을 누르고 세포가 쉽게 분리 할 수 ​​있는지 여부를 확인합니다. 그렇다면, 그것은 효소 반응을 정지하는 시간이고; 2 분 -하지 않을 경우, 별도의 1의 소화를 확장합니다. </li><li> 세포를 10 μM Y27632 보충 mTeSR1 신선한 배지 2ml를 첨가하여 분해를 종료한다. 피펫 및 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 P1000 팁 여러 번 사용하여 다운. </li><li> 혈구를 사용하여 생존 세포 수를 계산.얼룩에 트리 판 블루를 사용하여 제외 죽은 세포 (14) </li><li> 필요한 세포의 수를 계산한다. 일상 hPSC의 계대를 들어, 6 웰 플레이트의 웰 당 4 × 10 5 5 10 × 5 세포를 시드 (즉, 4.21 × 10 4cm 2 당 5.26 × 10 4). 간세포 분화 hPSCs를 계대를 들어, 6 웰 플레이트의 웰 당 6.5 × 10 5-7.5 × 105 (즉, cm 2 당 7.89 × 10 4-6.84 × 10 4) 세포를 시드. 주 : 각 세포주에 대한 시딩 밀도는 간 차별화 여기 주어진 경험적 밀도에 따라 약간의 최적화를해야 할 수도 있습니다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 115 XG에 멸균 15 ㎖의 50 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 필요한 세포 현탁액을 전송. </li><li> 천천히 뜨는을 대기음 후 10 μM의 Rho 관련 키나제 (ROCK) inhibito 보충 신선한, 따뜻한 mTeSR1 매체에있는 세포 펠렛을 resuspendR Y27632 원하는 세포 밀도 있도록 적절한 매체를 사용. 주 : ROCK 억제제의 사용은 고도의 세포 부착 및 생존율을 향상시키기 위하여 권장된다. </li><li> 제조 된 플레이트에 세포를 시드 및 균등 셀을 분배하도록 좌우 전후 측면을 요동. 참고 : 세포 플레이트 일상적인 세포 배양 또는 간세포 분화 실험에 대한 여부를 우물에 균일하게 분포되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 세포 배양기에서 접시를 놓고 그들을 연결하고 복구 할 수 있도록 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 세포를 유지한다. </li><li> 세포 다음날 검사 및 세포 - 세포 접촉이 설정되어있는 경우 ROCK 저해제를 철회. 루틴 mTeSR1 배양 배지에서 세포를 유지 또는 필요에 따라 분화 배지로 전환. 참고 : 세포가 언급 한 밀도로 접종 한 경우, 포화 상태는 일상적인 유지 보수 또는 간세포 differentiatio에 적합해야한다엔. </li></ol> 2. 재조합 라미닌에 간세포와 같은 세포에 hPSCs 차별화 <ol><li> 차별화 매체를 준비합니다. <ol><li> 인간 티빈 원액을 인간에게 티빈 멸균 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA) / DPBS에 100 μg의 / ㎖의 스톡 용액을 만드는 분말을 녹인다. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 마우스의 Wnt 3A 원액을 확인 : 멸균 0.2 % BSA / DPBS에서 10 μg의 / mL의 원액을 만들기 위해 마우스의 Wnt의 3A 분말을 용해. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 200. </li><li> 인간 간세포 성장 인자 (HGF) 스톡 용액을 제조 : 멸균 된 0.2 % BSA / DPBS에서 10 μg의 / ㎖의 원액을 만들어 인간 HGF 분말을 녹인다. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 온코 스타틴 M (OSM) 원액을 확인 : 멸균 0.2 % BSA / DPBS에서 20 μg의 / mL의 원액을 만들기 위해 온코 스타틴 M (OSM) 분말을 용해. 작은 분취 량과의 확인-20 ° C에서 그들을 찢었다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 내배엽 프라이밍 스톡 배지 500 mL로 : 2 % B27 보충제 (50X, 마이너스 비타민 A)와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 각각 / ㎖에서, 최종 농도); 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (1640 RPMI) 기초 배지를 사용하여 500 ㎖까지 가기. 참고 : 4 ° C에서 주식을 저장하고 2 주 이내에 사용한다. 주식에서 나누어지는 매체와 각 매체 변경시 (100 NG / mL의 50 NG / mL로, 각각에 최종 농도) 신선한 티빈 A와의 Wnt의 3A를 추가합니다. </li><li> 80 % 녹아웃 DMEM (KO-DMEM), 20 % 넉 아웃 혈청 교환 (KSR) 0.5 % 루타, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 0.1 mM의 베타 머 캅토 에탄올 : KSR / DMSO 분화 배지 500 mL로 1 % DMSO, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 / ㎖, 각각의 최종 농도). 진공 상태에서 필터. 4 ° C에서 보관하고 2 주 이내에 사용한다. </li><li> 1 % 미군 병사 : HepatoZYME 성숙 매체의 500 mL로utaMAX 10 μM의 하이드로 코르티손 21- 헤 미숙시 네이트 나트륨 염 (HCC)와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 각각 / ㎖에서, 최종 농도); HepatoZYME 기초 배지를 사용하여 500 ㎖까지 가기. 참고 : 4 ° C에서 주식을 저장하고 2 주 이내에 사용한다. 나누어지는의 주식에서 매체 및 각 매체의 변화 (10 NG / mL의 20 NG / mL로, 각각에 최종 농도) 신선한 HGF 및 OSM을 추가합니다. </li></ol></li><li> LN-521 / LN-111은 기판으로서 사용되는 경우 제 1 절에 설명 LN-521에 간세포 분화 시드 hPSCs, 코트 LN-521, LN-111와 플레이트 (1 : 3 비율)에서 5 μg의 / ㎖의 최종 농도 라미닌; 나머지 처리는 순수 LN-521 코팅 된 플레이트와 동일해야한다. 참고 : LN-521 / LN-111 hPSCs의 일상 문화에 적합하지 않다; 만 분화 실험을 위해 사용된다. </li><li> 파종 후 세포 포화 상태를 24 시간을 확인합니다. 세포 생장이 약 40 %에 도달하면 세포 분화를 시작. 아르 자형폐 mTeSR1 매체를 가져 가십시오 100 NG / mL의 티빈 A와 50 NG / ㎖의 Wnt의 3A와 보충 신선한 내배엽 흡입 매체를 추가합니다. 이 분화 일 1 호출합니다. 참고 : 높은 세포를 파종 후 하루 분화를 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포에 대한 삼일 (hESCs는)에 대한 내배엽 흡입 매체마다 24 시간을 변경합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에 관해서는, 최종 내배엽과 같은 세포에 주요 2 일 이상 세포를이 단계를 확장하지만, 100 NG 만 보충 내배엽 프라이밍 매체를 사용하여 / mL의 티빈이 두 가지 일 12 . 참고 : 성공적으로 내배엽 사양을 보장하기 위해, 하나는 FOXA2 및 SOX17으로 내배엽 마커의 발현을 검사 할 수 있습니다. 면역 형광 염색법에 따르면, 유래 세포의 80 % 이상이 우리의 실험실에서 두 마커에 대한 긍정적이다. </li><li> (hESCs는 용) 하루 4 KSR / DMSO 차별화 매체 / (hiPSCs에 대한) 하루 6로 전환합니다. 매체 d를 변경처음 3 일 동안 다음이 분화 단계의 다섯 번째 날에 aily. 참고 : 공급이 분화 단계의 네 번째 날에 필요하지 않습니다. 많은 죽은 세포가있는 경우 매체 변경 전에 한 번 세포를 씻어 비추 ​​KO-DMEM을 사용합니다. 이 단계에 대한 분화 성공 여부를 확인하거나하지 않는 하나는 AFP, CK19 및 HNF4A 같은 간 전구 세포 마커의 발현을 검사 할 수있다. 세포의 약 90 %는 우리의 경험을 바탕으로 이러한 마커에 대한 긍정적 인 것입니다. </li><li> KSR / DMSO 분화 단계 5 일 후, HepatoZYME 성숙 단계로 전환합니다. KSR / DMSO 매체를 제거한 후 일반 HepatoZYME 기초 배지로 한 번 세포를 씻으십시오. 매체 (10) NG / mL의 HGF 20 NG / ML의 OSM 보충 HepatoZYME 성숙을 추가합니다. </li><li> 세포가 표준 특성이나 더 사용할 준비가되는 시점에서 10 일 - 7 매체마다 48 시간을 변경합니다. 주 : 간세포 마커 발현 검사, 대사우레아 알부민 분비 검사, 글리코겐 저장 테스트 및 인도 사이 아닌 그린 (ICG) 흡수 검사 (예 시토크롬 P450 활성 등) 기능 테스트는 전형적인 특성화 방법이다. 참고 : 분화 프로토콜의 타임 라인은 그림 5에 표시됩니다. 우리가 실험실에서, 우리는 일상적으로 파생 된 HLCs &#39;간세포 특이 적 마커의 발현 수준, 알부민 분비와 사이토 크롬 P450 (CYP) 3A 및 1A2 활동을 확인합니다. </li></ol>

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Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

박사 데이비드 C. 헤이 Stemnovate Limited의 공동 설립자이자 감독이다.

현재 좋은 제조 관행 가이드 라인이 필요 준수 인간 다 능성 줄기 세포 연구 및 병진 의학, 이종없는 시스템을 진행합니다. 임의의 분화 과정을 키는 세포 외 기질 (ECM)이다. 전자 재료뿐만 세포 부착을 지원뿐만 아니라, 세포의 결정 및 표현형 25, 26에 영향을 미치는 주요 신호 요소에 대한 액세스를 제공합니다. 라미닌 생체 다기능 세포 외 기질 단백질이다. 간에서, 라미닌 분비 부분 절제 후 27 일 간 재생에 중요한이며 간 전구 세포 유지 28에 요구한다. 간 유지 및 재생에 라미닌의 중요성은 우리 간세포 분화 시스템에서 시판되는 재조합 인간 라미닌을 테스트하기위한 기초이다. 페리 그마트 리겔에 비해 patocyte 차별화는 LN-521 및 LN-521 / LN-111 기판 상에 달성되었다. 파생 HLCs 명확 편광 및 접시 조직 및 젤라틴 단백질 혼합물 상대 비교할 때 그 세포 기능이 크게 향상되었다 하였다. 이러한 개선 밑바탕 fibroblast-, 결장 오염의 하향 조절했고 세포 연관된 라미닌의 유전자뿐만 아니라, 세포의 증식 및 이동과 연관된 유전자 발현 감소 10 줄기. 결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 성인 인간 간세포 본질적 가까운 간세포 - 유사 세포를 생성한다. 이 프로세스는 자동화, 재현 의무이며, 비용 효율적으로 응용 프로그램에 대한 확장 할 수 있습니다. 중요한 뱃치 변화가 현저이 필드 내 연구를위한 개선 된 시스템의 분화의 결과 마트 리겔을 사용 기술에 비해 감소되었다. </P&gt;

차 인체 조직 및 세포 유형 유도체 정기적 세포 기반 스크리닝 및 클리닉 모두 사용된다. 그러나, 이러한 세포에 대한 액세스 권한이 심각하게 부족으로 인해 장기 기증 및 사후 분리 한 세포 표현형의 손실로 제한됩니다. hPSCs 차 조직 유망한 대안을 나타내는 유전 정의 재생 인간 체세포의 생성을 촉진한다. hPSCs에서 유래 간세포와 같은 셀 (HLCs)는 이미이 분야에서 가능성을 보여 주었다. HLCs 약물 바이러스 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 세포 형태, 간세포 유전자 발현, 대사 기능, 감도 등 다양한 측면에서 차 인간 간세포를 닮아. 또한, 무한 증식모두 Researcher 섹션 및 GMP 수준의 hPSCs의자가 재생 능력은 그들의 응용 프로그램 9, 10 용이하게한다. 연구 십년 효과적인 간세포 분화 절차 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20의 숫자를 제작했다. 그러나, 이러한 시스템은 대부분 간세포 사양을 정의 구동 요소 및 / 또는 바이러스 전달을 사용한다. 규모 기술의 신뢰성을 향상하기 위해서는 강력한 간세포 분화를 개발하는 것이 중요이종없는 진정한 정의 시스템 및 GMP 호환. 라미닌 (림프절)는 세포 부착, 증식, 이동 및 분화에 영향을 미칠 수있는 중요한 세포 외 기질 단백질이다. 라미닌은 α 한 번 β 및 γ 한 체인으로 이루어지는 이종삼 당 단백질이다. 최근에, 재조합 인간 라미닌 생산 및 세포 생물학에서 사용되어왔다. LN-521, E-cadherin의 혼합물이 유도 클론 인간 배아 줄기 세포 (22)의 팽창을 허용하면서 LN-511 hPSCs (21)의 유지를 지원하기 위해 보여왔다. LN-111, 반면에, hPSCs (23)로부터 유래 hepatoblast 유사 세포의 유지 보수를 지원한다. 그러나, 우리의 보고서 전에 521 라미닌 및 111 hPSCs 10에서 성숙 특성을 가진 HLCs를 생성하는 데 사용되지 않았다. 여기에, LN-521에 hPSCs을 배양 우리 세부 절차그리고 그들을 차별화 중 하나 LN-521 또는 LN-521 및 LN-111 (LN-521 / LN-111)의 조화. 우리는 많은 형식 14 HLCs의 높은 재현성과 균일 한 단일 층을 생성하는 단일 셀 시드를 사용하여 분화 프로토콜을 최적화. 우리는 우리의 정의 분화 시스템 분야에서 순방향 중요한 단계를 나타내는 어플리케이션 활성 HLCs를 제조하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 나타낸다고 믿는다.

<table><tbody><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 111</td><td>BioLamina</td><td>LN111-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME</td><td>Life Technologies</td><td>17705</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr></tbody></table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 생물 의학 연구에 큰 가치를 가지고있다. hPSCs는 스케일링과 인간의 몸에있는 모든 세포 유형으로 분화 될 수있다. 인간 간세포 - 유사 세포 (HLCs)에 hPSCs의 분화는 광범위하게 연구되었고, 효과적인 분화 프로토콜이 확립되었다. 세포 외 기질 및 성장 인자, 사이토 카인, 및 작은 분자를 포함한 생물학적 자극의 조합이 가능 차 인간 간세포를 닮아 HLCs를 생성하도록 만들었다. 그러나, 절차의 대부분은 여전히 ​​뱃치 변화로 초래하는, 정의 구성 요소를 채용한다. 이 기술의 응용에 큰 장벽으로 작용한다. 이 문제를 해결하기 위해 무 혈청 분화 과정과 함께 외 기질 재조합 인간 라미닌을 이용한 간세포 분화에 대해 정의 된 시스템을 개발 하였다. 고효율 간세포 사양 드으로 이루어졌다HLC 기능과 표현형 모두 개선 monstrated. 중요한 것은,이 시스템은 연구 및 GMP 수준의 hPSC 라인을 셀 기반 모델링 및 치료에 유망한 발전을 사용하여 확장이 용이하다.

hPSCs에서 간세포의 분화 한 인간 배아 줄기 세포주 H9, 한 사람의 유도 다 능성 줄기 세포주, 33D6는 간세포 분화에 사용 하였다. 도 4는 그 33D6 세포로부터 동안도 1 내지도 3의 결과는, H9 세포로부터이다. 라미닌에 접종 한 세포는 24 시간 후 세포 - 세포 접촉을 설립했다. 세포가 40 % 컨 플루 주위에 도달 한 후, 분화 과정은 (도 1a 및도 4a)를 개시 하였다. 라미닌에서 (LN-521 및 LN-521 모두 / LN-111),이 세포는 순차적 형태 학적 변화를 통해 갔다 및 편광 HLCs (그림 1과 그림 4A)로 상승했다. 간세포와 유사한 세포 특성 다Y 18 HLCs 수집 대표적인 간세포 마커 HNF4A와 ALB (도 2a)의 발현에 대해 평가 하였다. 하루 18 HLCs의 면역 염색은 세포의 약 90 % HNF4α (그림 2B)을 표현 것으로 나타났다. E-cadherin의와 F - 굴지 표현 (그림 2B)로 표시 이러한 세포는 다각형 모양을 라미닌에 편광 및 전시. 시토크롬 P450 (CYP) 활성을 또한 평가 하였다. CYP450s은 간세포의 중요한 신진 대사 기능을 수행. 이러한 마트 리겔, LN-521, 또는 LN-521 / LN-111과 같은 젤라틴 단백질 혼합물에서 파생 된 날 (18) HLCs는, CYP3A 활동에 대해 시험 하였다. HLCs는 마트 리겔보다 라미닌 기판 (그림 3)에 상당히 높은 CYP3A 활동을 보여 주었다. 상업 인간의 기본 간세포에 비해 중요한 것은, (HU1339)이 기판 상에 재 도금, HLCs 거의 10 배 높은 수준을CYP3A 활동 10. hiPSCs의 분화는 hESCs는 유사 하였다. 세포는 외관 (도 4a)에서 순차 변화를 나타냈다. 파생 키는 HLCs 간세포 전사 인자, HNF4α (도 4b)를 표현하고, CYP3A 활동 및 분비 알부민 (도 4c 및 D)를 보유. 특히, 33D6로부터 유도 HLCs는 HLCs (도 3) 유래 H9 세포에 비해 감소 CYP3A 표시되지만 여전히 인간 간세포 주 (10)에 필적 하였다. 그러나 이러한 HLCs의 알부민 분비 차 간세포 (10)보다 훨씬 낮았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> 그림 1 : 간 차별화 동안 연속 형태 학적 변화. &lt;하나의 세포가 40 % 컨 플루 주위에 파종 후 24 시간에 도달로 / strong&gt;을 (A) 미분화 hESCs는 시드. (B) 프라이밍 후에, 세포들은 일 9 (D)에 분명 다각형 형상을 보였다 성숙 단계 후, 편광 HLCs을위한 준비이었다 hepatoblast 같은 단계에 도달하면 일 4 (C)에 대한 전형적인 내배엽 형태를 나타내 하루 18 스케일 바 = 200 μm의에서 여기에 표시된 추가 특성. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> 그림 2 : HLCs의 특성. (A) 간세포 특이 마커의 유전자 발현, HNF4A (왼쪽)와 ALB (오른쪽). 발현 수준은 18 일을 유도 HLCs를 사용하여 분석 하였다LN-521 및 LN-521 / LN-111 모두 hESCs는에서, 그리고 가사 유전자 GAPDH에 정상화이었고, hESCs는를 기준으로 표시. 결과는 세 개의 복제 생물을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타낸다. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01; 짝 t-test를. 키 간 마커, HNF4α, 편광 마커, E-cadherin의와 F - 굴지의 (B) 단백질 식입니다. LN-521 및 LN-521 / LN-111은 위의 마커 염색 훽스트 33342. 음성 대조군으로 대조 한에 주 18 HLCs은 해당 면역 글로불린 G (IgG를) 수행 하였다. HNF4α 양성 세포의 비율과 SD가 표시됩니다. 이것은보기의 네 랜덤 필드에서 계산 하였다. 이미지는 20 배 배율로 촬영되었다. 스케일 바 = 100 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3 : HLCs의 대사 기능 특성. 마트 리겔 (MG), LN-521, 또는 LN-521 / LN-111에 배양 된 세포의 CYP3A의 사이토 크롬 P450 활성을 시험 하였다. 데이터는 세 개의 복제 생물을 나타내고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. ** P &lt;0.01; 편도 ANOVA Tukey에의 사후 검사와 함께. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> 그림 4 : HLCs의 표준 특성. LN-521에 배양 hiPSCs는 HLCs로 분화되었다. 표준 특성 시험은 하루 17 HLCs에서 수행 하였다. (A) 간 동안 분화 세포의 연속 형태; 시간 포인트 도시 R<html> epresent 일 1, 4, 9 세포 및 HNF4α 발현의 17 (B) 면역 염색. 양성 세포의 비율과 SD는보기의 네 랜덤 필드를 기반으로 표시됩니다. 이미지는 20 배 배율로 촬영되었다. 스케일 바 = 100 μm의. 하루 17 HLCs에 (C) CYP3A 활동. 데이터는 여섯 생물학적 복제를 나타내고, 에러 바는 SD를 나타냅니다. 문화에 24 시간 이상 파생 HLCs의 (D) 알부민 분비. 데이터는 네 가지 생물학적 복제를 나타내고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> 그림 5 : 차별화 프로토콜의 도식 타임 라인.t = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K 조회수.  University of Edinburgh.  여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다. 

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

연구

발생학

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

생물학

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC 유래 3D 인간 간 오가노이드 생성을 위한 통합 프로토콜

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

생체공학

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

면역학 및 감염병학

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>이미지 기반 ML 전략을 통한 만능줄기세포 분화 모니터링

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available PSC-to-functional cell differentiation systems are impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Precise control of cell differentiation in real time is therefore important. In this protocol, we describe a non-invasive and intelligent strategy that overcomes the variability in cell differentiation by using bright-field image-based machine learning. Taking PSC-to-cardiomyocyte differentiation as an example, this methodology provides detailed information for control of the initial PSC state, early assessment and intervention in differentiation conditions, and elimination of the misdifferentiated cell contamination, together realizing consistently high-quality differentiation from PSCs to functional cells. In principle, this strategy can be extended to other cell differentiation or reprogramming systems with multiple steps to support cell manufacturing, as well as to further our understanding of the mechanisms during cell fate conversion.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Enhancing PSC-to-Functional Cell Differentiation Using ML Models Based on Live-Cell Bright-field Imaging (라이브 셀 명시야 이미징 기반 ML 모델을 사용하여 PSC-기능성 세포 분화 향상)

Available pluripotent stem cell (PSC)-to-functional cell differentiation systems are currently impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Here, using cardiac differentiation as the main example, we present a protocol to intelligently monitor and modulate the process of PSC differentiation based on image-based machine learning.

만능줄기세포 분화를 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미지 기반 기계 학습 전략

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...