Name: identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
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1. Splat 장치 설정 <ol><li> 온도 조절이 가능한 순환 수 욕조에 에틸렌 글리콜 (물 50 % v / v)을 채우십시오. 참고 : 녹색 자동차 용 에틸렌 글리콜을 사용할 수 있습니다. </li><li> 외부 챔버를 조립하려면 단열 플라스틱 튜브를 사용하여 수조를 이중벽 유리 그릇에 부착하십시오. 유리 그릇을 폴리스티렌 폼으로 절연시키고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 덮으십시오. 광원이 유리 챔버를 통해 볼 수 있도록 폴리스티렌 챔버의 바닥에 3-4 인치 구멍을 자르십시오. </li><li> 카메라 포트와 10X 안구 렌즈와 4X 편광 객관적인 렌즈가 장착되어 해부 현미경에 외부 챔버를 탑재하십시오. 외부 챔버 바닥에 편광 필름을 추가로 놓습니다. </li><li> 레토르트 스탠드 위에 1-1.5m 튜브 (직경 ~ 5cm)를 클램핑하고 레토르트 스탠드의 바닥에있는 튜브 아래에 위치한 냉각 블록과 함께 대형 폴리스티렌 컨테이너 안에 넣으십시오. </li></ol> 기본 단백질 2. 준비 IRI 분석을위한 추출 <ol><li> 낮은 조명 조건 (6 시간 광 / 18 시간 어둠)에 따라, 4 ° C에서 최대 1 주 동안 동결 내성 잔디 나 기타 동결 - 내성 식물 종, 저온 적응 식물 IBPS의 발현을 유도한다. 이것은 이미 낮은 온도 조건 및 적응 기간에 노출 된 현장에서 수집 된 샘플에 적용되지 않습니다. </li><li> 스템의 바닥에 절단 잎 조직의 대략 0.1 g을 수득 한 후, 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 즉시 사용할 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 샘플을 동결 플래시. </li><li> 세포 용균을 액체 질소하에 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 조직 샘플을 분쇄한다. 액체 질소는 균질화 과정에서 증발하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 얼음에 지상 샘플을 배치하고 액체 질소가 완전히 증발 할 수 있습니다. 네이티브 단백질 extracti의 1 ML을 추가합니다사용 직전에 첨가 두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 정제와 10 mM의 트리스 -HCl, 25 mM의 염화나트륨 (PH 7.5) 완충액에 함유. 피펫 섞어; 소용돌이하지 않습니다. 참고 : 해물 이차 대사 산물 (토론 참조)이 포함 된 경우 추가 첨가제를 사용할 필요가있다. </li><li> 천천히 4 ℃에서 밤새 샘플 (18-24 시간)을 흔들어. 4 ℃에서의 나머지 단계를 실시한다. </li><li> 5 분 ~ 16,000 XG에 샘플을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 세포 파편이 지속되면 추가로 5 분 동안 원심 분리하고 수용성 분획을 유지한다. 분명 샘플을 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 경고등 분석 사전 실험 설정 <ol><li> 편광 필름 설정된 외부 챔버에 헥산 100 ㎖를 붓고 수분이 슬라이드 구축 방지 5-6 탈수 비드를 추가한다. 수조를 덮는 플레이트 진공 그리스를 소량 첨가하고 타이트한 밀봉을 보장하고, 헥산을 증발을 방지하기 위해 트위스트. </lI&gt; <li> 실험을 시작하기 전에 27 ° C 사이 및 31 ° C 프로그래밍 수조를 사용하여 약 2-3 시간 헥산 욕 쿨. 실험을 시작하기 전에 온도계 헥산의 온도를 확인해야합니다. </li><li> 바로 아래의 플라스틱 튜브 폴리스티렌 상자 냉각 블록을 넣고, 드라이 아이스와 완전히 실험 시작 40 분 전에 커버. </li><li> 분석을 시작하기 전에, 튜브 레벨인지 확인하십시오. 샘플이 떨어질 냉각 블록, 첫 번째 테스트에서 어디 물로 순서를 결정하고 (후술) 샘플 마커 삭제 위치를 표시한다. </li><li> 냉각 블록의 상단에서 드라이 아이스를 제거하고, 물로 결정된 강하 마크에 유리 현미경 슬라이드 커버를 배치했다. </li><li> 즉시 분석을 시작하기 전에, 광원 켜고 유리 챔버의 바닥에 형성 한 모든 얼음을 긁어. 얼음 결정하지 않는 한에 광원을 유지하지 마십시오헥산 가열 방지 가시화되고있다. </li></ol> 4. 플랫 분석을 실시 <ol><li> 종이 타월이 과잉 오일을 제거하여, 침지 오일 자동 피펫 (1-20 μL)에 부착 된 일회용 팁을 찍어. 이 단계는 샘플 가을보다는 피펫의 외부에 부착 할 수 있습니다. 참고 : 피펫에서 여분의 기름 제거 기름 방울이 시각화 어렵게 얼음 결정에 형성하지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 직접 시료를 방출 전에 플라스틱 배관을 통해 표본 장소 피펫 피펫 10 μL. 샘플은 얼음 결정의 단일 층을 생성, 유리 커버 슬라이드를 칠 때 뚜렷한 &#39;플랫&#39;소리가되어야한다. </li><li> 신속하고 신중하게 편광 필름의 상단에 헥산 욕조에 핀셋과 장소를 사용하여 추위 블록에서 현미경 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 현미경으로 보면,보기 및 광고 분야에 현미경 슬라이드를 넣어다만, 대물 렌즈가되도록 교차 편광 높은 콘트라스트 얼음 결정의 시각화를 허용한다. 40 배에 배율을 조정합니다. </li><li> 현미경에 카메라를 부착하고 얼음 결정의 명확한 시각화를 허용하고 이미지를 캡처하는 &quot;매크로&quot;로 설정을 조정합니다. 참고 : 1 시간까지 대기하는 얼음 결정이 명확한 그림을 제공 할 수 있습니다 성장 할 수 있도록합니다. </li><li> 반복 모든 샘플에 대한 4.1-4.5 단계를 반복합니다. 전형적으로, 헥산 챔버 내의 다른 샘플 6 개 슬라이드까지 게재. </li><li> 타이트 밀봉을 보장 광원을 끄고 헥산 욕 위에 플라스틱 판을 놓는다. (특정 분석에서 일관된 어닐링 기간 유지 12-24 시간)을 얼음 결정이 밤새 어닐링 할 수있다. 배양 후, 얼음 영화의 이미지를 캡처 전술 한 바와 같이. 참고 : 일부 샘플은 다른 사람보다 더 빠르게 재결정 할 수있다. 더 재결정 12 시간 후에 명확하지 않는 경우 24 시간까지없는 recrystalli되도록하는 결정이 어닐링 허용zation가 발생합니다. </li></ol> 5. 경고등 분석 데이터 분석 <ol><li> 컴퓨터에 사진을 업로드하고 직접 전 열처리 후 얼음 결정의 크기를 비교합니다. IRI없이 활동이없는 샘플들이 눈에 띄게 더 큰 얼음 결정을 형성하는 반면 재결정 얼음 재결정 활성을 갖는 샘플은 증가하지 않을 것이다. 빛 간섭은 큰 얼음 결정은 약간 다른 색상으로 표시되므로 쉽게 볼 수있다 할 것입니다. </li></ol> 6. 얼음 친화력 정화 장비 설치 <ol><li> 에틸렌 글리콜 온도 프로그래밍 순환 수조를 채운다. 녹색 자동차 에틸렌 글리콜을 사용할 수있다. </li><li> 절연 플라스틱 튜브 (15)를 사용하여 중공, 황동 프로브에 목욕을 연결합니다. </li><li> 150 ㎖의 비이커에 snuggly 들어갈 수있는 폴리스티렌 용기를 구축. 황동 차가운 손가락의 중심에 구멍 용기의 뚜껑을 만듭니다. </li></ol> 7.아이스 친화 정제를위한 시료의 준비 <ol><li> 콜드 적응의 식물 조직은 2.1 절에 설명. </li><li> 20 개 ㎖ 튜브에 접지 매스 (단계 2.3)의 ~ 100-150 g의 수집 즉시 동결 플래시. 샘플은 사용하기 전에 -80 ° C로 유지 될 수있다. </li><li> 2.3-2.5 부분에서 설명한 바와 같이 시료를 준비한다. 잎 조직의 부유를 들면 : 1 비율 (천연 단백질 추출 완충액 용액 mg의 조직 :) 1을 사용한다. 내인성 단백질 분해 효소에 의해 IBPS의 저하를 방지하기 위해 추가 프로테아제 억제제 정제를 사용합니다. 주 : 2 또는 1 : 3 (mg의 조직 : 천연 단백질 추출 완충액 ㎖) 조직 샘플이 지나치게 집중하면 1 비율을 조정한다. </li><li> 세포 파편을 제거하고, 무명천 2 층, 3 회 통하여 분해물 체. 4 ℃에서 40 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리하여 파편 펠렛. </li><li> 천연 단백질 추출 완충액을 사용하여 120 mL의 행 샘플의 부피를 증가시킨다. 얼음 친화 정제 즉시에 해물을 사용하여얼음 바인딩 활동의 손실을 피할 수 있습니다. </li></ol> 8. 실시 얼음 화성 정제 <ol><li> 정제하기 전에, -0.04 ° C / H의 속도 C -3 ° -0.5 ° C로 냉각 프로그래머블 수조 세트. 참고 : 냉각 속도는 샘플의 초기 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> -0.5 ° C로 얼음 손가락을 냉각시키고,이어서 초기 증류 물을 함유하는 50 ㎖ 튜브로를 잠수하다. 손가락에 형성하는 얼음의 얇은 층을 얼음 핵화를 촉진 할 수 있도록 약간의 얼음 칩을 추가한다. 이 프로세스는 일반적으로 20 내지 30 분 걸린다. 참고 : 얼음 코팅 손가락에 어떤 덩어리 전에 샘플 배치에 장갑을 낀 손으로 부드럽게해야한다. 빙 층은 -0.5 ° C에서 형성되지 않는 경우, -0.75 ° C의 온도를 낮추. </li><li> 자기 교반기 위에 폴리스티렌 용기에 작은 자기 교반 막대를 함유하는 150 ML 글래스 비이커에 넣어 샘플. 얼음 손가락이 있는지 확인중심 및 액체 시료에 적어도 반쯤 낮췄다. 용기를 밀봉합니다. </li><li> 24 시간마다 확인, 프로그램은 약 2 일 동안 실행할 수 있습니다. 샘플의 50 %가 동결되면, 프로그램을 중지합니다. 얼음 반구 IBPS 혼입 &quot;얼음 - 에칭&quot;을 초래할 것이다. 참고 : 정화 실험은 프로그램이 실행이 적절하게 조정하는 시간의 길이와 큰 샘플 볼륨을 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li><li> 39 ° C에 프로브를 얼음 반구 가온 제거하기 위해, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 증류수로 반구 린스 한 후 4 ℃에서 해동. 주 : 대부분 IBPS은 물 및 적절한 버퍼에 안정하지 않은 (즉, 50 mM 트리스 - 염산은 pH가 8의 50 mM 중탄산 암모늄 pH를 8) 해동 과정에서 주기적으로 첨가해야한다 (약 1 ㎖ / 2 시간) . 얼음 반구를 알루미늄 호일로 래핑하고, 종래 해동 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 얼음 반구가 여전히 포함되어있는 경우의 안료, 또는 샘플 정화 증가를 반복 8.1-8.5 2 ~ 3 번 단계를 반복합니다. 참고 : IBP의 농도가 낮은 정화의 여러 라운드를 다음 수 있지만, 순도 정제 된 샘플은 MS를 이용하여 분석 될 경우 얻을 수보다 더 가치가있다. 충분한 재료를 사용할 수있는 경우, 얼음 친화력 정화의 3 라운드 권장합니다. </li></ol> IBPS 9. 확인 <ol><li> IBPS가 얼음의 융해 반구 다음 다량 함유되어 있기 때문에, 샘플을 농축시킨다. 작은 단백질의 손실을 방지하기 위해 3000 다 분자량 컷오프 농도 원심 튜브를 사용 ~ 1-3 mL의 조직 ~ 100g을 함유하는 샘플을 농축시킨다. </li><li> MS에 대한 샘플을 보내기 전에 같은 BCA 또는 브래드 포드 분석으로 단백질 정량 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다. 예로서 SDS-PAGE 겔 전기 영동에 의해 시료의 순도를 추정한다. SE 이전 IRI 활동에 대한 정제 된 단백질을 테스트MS에 대해 웍하면 활성 단백질을 정제 및 농축 단계로 유지되어 있는지 확인한다. </li><li> 질량 분광 분석 (10) 직접 농축 된 시료를 사용합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

IBPS의 성공적인 분석 및 정제를 들어,이 단백질의 일부의 온도에 민감한 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 특정 식물 IBPS는 전개, 침전 및 활동의 결과로, 0 ° C 이상의 온도에서 불안정해질. IBPS 활성을 얻기 위해서는 식물은 냉장실 (~ 4 ° C)에서 처리되고, 샘플은 실험하는 동안 얼음에서 유지되는 것이 종종 중요하다. 전체 셀 원유 해물을 사용하여 내생 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 분해?...

ICP (Ice-binding proteins)는 식물 1 , 곤충 2 , 어류 3 , 미생물 4 등 여러 유기체에서 발견 된 다양한 보호 단백질 군입니다. 이 단백질의 핵심 특징은 얼음 결정에 특이하고 효율적으로 흡착되어 성장을 수정하는 독특한 능력입니다. IBP는 몇 가지 문서화 된 성질을 가지고 있는데, 가장 잘 특징 지어지는 두 가지는 열 히스테리시스 (TH)와 얼음 재결정 억제 (IRI)입니다. TH 활성은 동결 - 내성이없는 동물에서 생산 된 IBP에서보다 쉽게 ​​관찰된다. 이 활동으로 인해 동결을 방지하기 위해 유기체의 순환 또는 간질 유체의 응고점이 낮아집니다. 대조적으로, 영하의 온도에서 필연적으로 동결 될 동결 내성 유기체에서, IBPs는 TH 활성이 낮게 나타난다. 낮은 TH 활동에도 불구하고, 얼음 울기를 제한하는 높은 IRI 활동STAL 성장은 종종 이러한 단백질과 관찰된다. 동결 내성 미생물의 경우,이 IRI의 활동은 아마도 세포 외 구획 얼음의 조절되지 않는 성장 세포를 보호하는 데 도움이됩니다. 은 &quot;매트리스 버튼&quot;모델 IBPS 얼음 결정 (5)의 성장을 방지하는 메커니즘을 설명하는 데 사용될 수있다. 이 모델에서는 IBPS 특히 물 분자에만 결합 IBPS 사이의 공간에 성장 얼음 결정 격자로 통합 할 수 있도록 간격으로 얼음 결정 표면에 흡착. 이 부가 물 분자의 결합이 불리하게 곡률, 깁스 - 톰슨 효과 (6)에 의해 설명 될 수있는 이벤트를 생성한다. 앵커 포접 물 가설 얼음 결정 표면에 IBPS의 특이 적 결합을위한 메커니즘을 제공 됨으로써 REO에 특이 단백질 결합 부위 얼음에 위치 대전 잔기의 존재는 결과물 분자가 얼음 결정 격자의 하나 이상의 평면과 일치하도록한다. TH 활성은 IBP의 존재하에 단일 빙 결정의 용융 및 응고 온도의 차이를 측정함으로써 정량화 될 수있다. TH 활성은 IBP의 활성을 평가하는 널리 받아 들여지는 방법이지만, 식물 IBP에 의해 생성되는 낮은 TH 갭 (일반적으로 단지 일부 정도)은 일반적으로 높은 단백질 농도, 특수 장비 및 조작자 경험을 필요로한다. 비 IBP는 얼음 결정 성장을 제한 할 수 있지만 모든 IBP가 공유하는 특성이므로 IRI 활동에 대한 테스트는 IBP의 존재에 대한 효과적인 초기 화면, 특히 TH 활동이 낮은 사람들을위한 효과적인 초기 화면입니다. 이 활동을 테스트하는 데 사용되는 방법론은 &#39;splat assay&#39;로 알려져 있으며, 단백질 샘플을 얼음으로 얼려서 작은 얼음 결정의 단일 층을 생성하고 일정 기간 동안 관찰하여얼음 결정 성장이 제한됩니다. IBPS 존재하는 소스 조직 샘플을 스크리닝하는데 사용하는 다른 방법과는 달리,이 기술은 10-100 ng의 범위의 낮은 단백질 농도에 적용 가능하다 쉽게 제작 된 장비를 이용하여, 신속하고 간편하게 해석 데이터를 생성한다. 그러나, 상기 분석은 TH 결정 얼음 결정 형성 와야 IBPS위한 초기 화면을 제공하는 것을 강조하는 것이 중요하다. 천연 단백질의 분리는 종종 관심의 단백질의 구조적, 생화학 적 특성에 관한 정보를 필요로 도전하고있다. 아이스 IBPS의 친화 정제 목적을 위해 기판으로서 아이스를 사용하여 이러한 단백질의 격리를 허용한다. 분자의 대부분이 얼음 결정 성장, 고도로 정제 된 샘플의 IBP 샘플 결과의 존재 하에서 얼음 반구 저성장 큰 quantit없는 동안에 앞서 빙수 경계 가압되므로단백질 및 용질을 오염 IES. 이 방법은 곤충, 8, 9, 10, 11 박테리아, 식물 및 어류 12 13 14 IBPS를 식별하는데 사용되었다. 또한,이 방법을 통해 달성 IBP - 풍부 분획은 또한 하류 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 이 논문은 IBPS 유도 추출 통해 식물 IBPS의 식별을 설명, IRI 활동 분석은 단백질의 존재 및 얼음 친 화성 정제를 사용하여 단백질의 분리를 확인한다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifugetubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable lab jack</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brass probe</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera/camera port</td><td>Canon</td><td></td><td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>Concentration tubes (0.5 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>Concentration tubes (15 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes (50 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Cooling block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>Use a metal heating block</td></tr><tr><td>Dehumidifier</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier</td></tr><tr><td>Dessciation beads</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 mesh size; 100% indicating</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double walled glass bowl</td><td>Generic</td><td></td><td>Purchase from local lab glassware supplier</td></tr><tr><td>Dry ice</td><td>Generic</td><td></td><td>Use local supplier; hazardous&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-protease inhibitor tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Generic</td><td></td><td>Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Home Depot)</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>Anhydrous, 95%; hazardous</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20 centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large plastic Petri dish</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Generic</td><td></td><td>Use local supplier; hazardous&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td>Generic</td><td></td><td>Purchase PVC pipe from local hardware store</td></tr><tr><td>Polarized film</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam</td><td>Generic</td><td></td><td>Can be constructed from polystyrene shipping boxes</td></tr><tr><td>Poreclain mortar and pestle</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 &amp;micro;m particle size</td></tr><tr><td>Retort Stand</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>Small stir bar</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-programmable water bath</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum grease</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl tubing</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification

얼음 - 결합 단백질 (IBPS)이 영하의 온도에 노출 특정 미생물에 의해 합성되어 스트레스 - 유도 단백질의 패밀리에 속한다. 세포 외 얼음 결정이 성장하면 식물에서 동결 손상은 세포막 가능한 세포 죽음의 파열의 결과로 발생합니다. 얼음 결정으로 IBPS의 흡착되어 세포 손상을 감소 얼음 재결정 억제 (IRI)으로 알려진 공정에 의해 상기 성장을 제한한다. IBPS은 평형 융점 이하 용액, 열 이력 (TH) 활성 알려진 속성의 빙점을 누를 수있는 능력을 입증한다. 이러한 보호 특성으로 인해, 산업, 의료 및 농업 분야에서 자신의 잠재적 인 사용에 새로운 IBPS의 식별에 대한 관심을 제기했다. 이 논문은 1 내지 IBPS 공장의 식별) 유도 추출 IBPS의 식물 조직에서, 2) IRI 활성에 대한 스크리닝 추출물, 3)을 정제 및 분리를 설명IBPS의 가스화. 낮은 온도에 노출하여 IBPS 유도 후, 추출물을 표준 광학 현미경을 이용하여 얼음 결정 성장을 관찰 할 수있는 &#39;플랫 분석&#39;을 이용 IRI 활성에 대해 시험된다. 이 분석은 낮은 단백질 농도가 필요하며 빠르게 수득 쉽게 얼음 결합 활성의 초기 화면을 제공하고, 해석 결과를 생성한다. IBPS이어서 &#39;얼음 화성 정제&#39;이라는 기술을 통해 얼음을 흡착 IBPS의 속성을 이용하여 단백질을 오염으로부터 격리 될 수있다. 식물 추출물에서 수집 한 세포 용 해물을 사용하여, 얼음 반구 천천히 황동 프로브에 성장시킬 수있다. 이는 다결정 얼음의 결정 구조에 IBPS를 통합합니다. 아니오 IBP의 선험적 생화학 적 또는 구조적 기술을 요구하는이 방법은 단백질의 활성 회복을 허용한다. 아이스 정제 단백질 분획 격려의 식별을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다질량 분석 및 천연 단백질의 생화학 적 분석에 의한 조수 시퀀스.

셋업의 편의를 위해, 그림 1과 도 2는 각각 IRI 분석 얼음 화성 정제에 사용되는 장비의 시각적 표현을 포함한다. IBPS와없이 겨자 식물로부터 수집 된 추출물을 사용 IRI 분석 결과는도 3에 도시된다. 이러한 결과는 동결 허용되지 겨자 잡초에서 수집 추출물이 때문에 IBPS 존재의 부족으로 얼음...

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Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다.

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

identification-plant-ice-binding-proteins-through-assessment-ice

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.6K 조회수.  Queen's University.  이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다. 

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LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

아이스 바인딩 단백질 수사 LabVIEW 운영하는 소설 Nanoliter의 Osmometer

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

연구

화학

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

생화학

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

식물의 얼음 핵 얼음 전파의 연구에 대한 고해상도 적외선 체열 (HRIT)의 사용

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

환경과학

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal transduction, metabolism, and development. These metabolites perform this regulatory activity by binding to proteins, thereby changing protein conformation, catalytic activity, and/or interactions. The method described here uses affinity chromatography coupled to mass spectrometry or Western blotting to identify proteins that interact with inositol phosphates or phosphoinositides. Inositol phosphates or phosphoinositides are chemically tagged with biotin, which is then captured via streptavidin conjugated to agarose or magnetic beads. Proteins are isolated by their affinity of binding to the metabolite, then eluted and identified by mass spectrometry or Western blotting. The method has a simple workflow that is sensitive, non-radioactive, liposome-free, and customizable, supporting the analysis of protein and metabolite interaction with precision. This approach can be used in label-free or in amino acid-labelled quantitative mass spectrometry methods to identify protein-metabolite interactions in complex biological samples or using purified proteins. This protocol is optimized for the analysis of proteins from Trypanosoma brucei, but it can be adapted to related protozoan parasites, yeast or mammalian cells.

This protocol focuses on the identification of proteins that bind to inositol phosphates or phosphoinositides. It uses affinity chromatography with biotinylated inositol phosphates or phosphoinositides that are immobilized via streptavidin to agarose or magnetic beads. Inositol phosphate or phosphoinositide binding proteins are identified by Western blotting or mass spectrometry.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the formation of single microscopic crystals and a suitable microscopy system coupled to the cold stage. The method described herein adds another important feature that includes exchanging solutions around ice and clathrate hydrate crystals. The described system comprises a combination of unique and home-developed instruments, including microfluidics, high-resolution cold stages, and fluorescence microscopy. The cold stage was designed for microfluidic devices and allows for the formation of micron-sized ice/hydrate crystals inside microfluidic channels and the exchange of solutions around them. The temperature resolution and stability of the cold stage is one millikelvin, which is crucial for controlling the growth of these small crystals. This diverse system is used to study the different processes of ice and hydrate crystallization and the mechanism by which the growth of these crystals is inhibited. The protocol describes how to prepare microfluidic devices, how to grow and control microscopic crystals in the microfluidic channels, and how the utilization of the flow of liquids around ice/hydrate crystals affords new insights into the crystallization of water.

The present protocol describes the crystallization of microscopic ice crystals and clathrate hydrates in microfluidic devices, enabling liquid exchange around the formed crystals. This provides unparalleled possibilities to examine the crystallization process and binding mechanisms of the inhibitors.

얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

생물학

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have proven successful in identifying protein-protein interactions (PPIs). APEX, BioID, and TurboID, a revised version of BioID have some restrictions in addition to being valuable technologies. The recently developed AirID, a novel version of BioID for proximity identification in protein-protein interactions, overcame these restrictions. Previously, AirID has been used in animal models, while the current study demonstrates the use of AirID in plants, and the results confirmed that AirID performs better in plant systems as compared to other PL enzymes such as BioID and TurboID for protein labeling that are proximal to the target proteins. Here is a step-by-step protocol for identifying protein interaction partners using AT4G18020 (APRR2) protein as a model. The methods describe the construction of vector, the transformation of construct through agroinfiltration, biotin transformation, extraction of proteins, and enrichment of biotin-labeled proteins through affinity purification technique. The results conclude that AirID is a novel and ideal enzyme for analyzing PPIs in plants. The method can be applied to study other proteins in plants.

Here, we present a step-by-step protocol for performing the proximity labeling (PL) experiment in cucumber (Cucumis sativus L.) using AT4G18020 (APRR2)-AirID protein as a model. The method describes the construction of a vector, the transformation of a construct through agroinfiltration, biotin infiltration, protein extraction, and purification of biotin-labeled proteins through affinity purification technique.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...