Name: production and administration of therapeutic mesenchymal stem/stromal cell (msc) spheroids primed in 3-d cultures under xeno-free conditions
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions at JoVE.com

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

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The authors declare they have no competing financial interests.

일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달성 3) 그들의 항에 관해서 타원체 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가 염증, 면역 조절 성 및 항암 전위, 4) 마우스에 그대로 타원체로 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 제공한다. 중간 엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직 등 다양한 성인 조직으로부터 플라스틱 접착을 통해 분리 할 수있다 다 능성 줄기 세포이다. 중간 엽 줄기 세포는 쉽게 표면 마커의 고유 한 집합을 표현 (~ 20 %) FBS 농도가 상대적으로 높은에서 조직 배양 플라스틱에 전파하고있다지방 세포, 골 세포, 연골 세포 계통 및 1, 16, 17, 18로 적어도 분화 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 생체 내에서 투여 된 후 단지 일시적으로 유지 보여도 인간 질환의 여러 동물 모델에서 유리한 효과를 발휘하는 것으로 입증되었다. 중간 엽 줄기 세포의 효과는 따라서 &quot;뺑소니&quot;라고되어 종종 중간 엽 줄기 세포 (2)에 의해 분비 등 PGE2, TSG-6 및 indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 등의 항 염증 및 면역 분비 인자에 의해 매개되는 3, 11, 19, 20, 21. 그러나, 이러한 요인들을 생성하기 위해, 중간 엽 줄기 세포는 손상된 조직으로부터 신호를 통해 또는 면역 C에서 역시 활성화가 필요받는 사람의 ELL 학생. 이어서, 동물 또는 환자 (22)에 세포를 전달하기 전에 MSC 미리 활성화 프라이밍 또는 프로토콜을 개발하는 새로운 관심이 있었다. 또한, 표준 MSC 준비에 항원 FBS 구성 요소의 존재는 우려를 제기하고있다. 따라서, 연구가 MSC 배양을위한 최적의 화학적 XF 조건을 결정하기 위해 수행되었다. 우리의 최근 연구에서는 먼저 중간 엽 줄기 세포는 타원체를 형성하여 3D 활성화 될 수 있음을 보여 주었다하고 세포 활성화가 특정 조건 XF 8, 12, 13, 14에 따라 달성 될 수 있음을 발견했다. 3D 세포 배양 기술은 셀 기반 연구 정품 생리적 조건을 제공 할 목적으로 수십 년 동안 사용되어왔다. 2D에서 문화는 조직의 3D 특성을 무시하고, 따라서 항상 요점을 되풀이하지 않는다세포 - 대 - 세포 및 세포 신호 전달에서 중요한 세포 간 상호 작용 매트릭스. 많은 3D 배양 기술 그러나, 이러한 방법 많은 가장 큰 단점은 생성 된 회전 타원체의 크기 및 / 또는 특정 고가의 장비의 요구 사항의 이질성이다, 회전 용기, 스피너 플라스크, 또는 다양한 비 접착면을 사용합니다. 연구는 또한 본질적으로 중간 엽 줄기 세포를 장려 매달려 드롭 배양액을 사용하여 수행되었는지에 자발적으로 집합 한 구형 4, 5, 6, 7, 8, 9, 23로. 특히 매달려 드롭 배양 쉽게 세포 농도 및 / 또는 드롭 볼륨을 조절하여 세포 집합체의 크기를 조작 할 수 있다는 이점도 가진 비교적 균일 한 마이크로 조직 / 응집체의 조립을 지원한다. 또한, 매달려 D의 지배ROP 문화 기술은 광범위한 교육을 필요로하지 않습니다. 25-40 μL 방울을 용이하게 높은 세포 농도 μL 당 통상적으로 500 ~ 1,000 개의 세포와 중간 엽 줄기 세포를 제조 할 수있다. 보다 작은 20 μL 빨리 증발하는 경향이 그보다 큰 45 μL 종종 반전 중에 뚜껑 걸쳐 얼룩 떨어진다. 어떤 크기, 속도와 방향성의 방울을 포함하는 뚜껑을 틀지 때, 표면 장력 및 드롭 / 회전 타원체의 적절한 모양을 유지하기 위해 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 인큐베이터에서 중단 문화와 적절한 공기 흐름 또한 각 드롭 내에서 하나의 영역으로 중간 엽 줄기 세포의 집계를 보장하기위한 중요하다. 이 기술의 단점은 매달려 방울을 포함하는 판 어려운 환자 치료를위한 스케일 업을, 인큐베이터에 누적 또는 구를 조립하는 동안 이동하지해야한다는 것입니다. 또한, 드롭 문화를 걸려 매체를 변경하는 것은 매우 어려운이며, 따라서 장기적인 문화 유명해야한다oided. 또한, 매달려 떨어진다 낮은 매체 간 세포 비율은 결국 중요한 세포 기능 및 / 또는 세포 사멸의 손실로 이어지는 영양분 고갈과 폐기물의 축적을 일으킬 수있다. 그러나, 적절한 매달려 드롭 방식으로, 우리는 세포가 강력한 항 염증 분자 PGE2 및 TSG6뿐만 아니라 항암제 분자가 IL-24의 공장되어 있음으로 회전 타원체의 중간 엽 줄기 세포는 매우 활성 또는 프라이밍 될 것으로 입증 꼬리. 우리는 MSC의 타원체 실제로 항염증제 및 면역 것을 도시 배양 대식 세포, 비장 세포, 전립선 암 세포를 8, 12, 13, 14을 사용하여 다수의 기능 분석에서의 2 차원 단층 대응 우수한 항암 특성을 가지고있다. 또한, 우리는 투여시 MSC의 회전 타원체는 강력한 항 염증 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보여 주었다복막염 8 마우스의 복강에. 특히, 약 400-500 ㎛의 직경의 큰 회전 타원체 (25,000-30,000 엽 줄기 세포 각각) 효율적 20G 바늘 / 카테터 조립체 및 표준 피펫을 사용 HBSS 작은 부피로 전달 될 수있는 것으로 나타났다. 유체의 흐름에 저항이 높은 결과이 기술 부적절한 카테터 위치로 쉽게 프로토콜에 기재된 바와 같이 제 HBSS / HSA 중 소량 주입함으로써 전송을 구형에 앞서 결정될 수있다. 적절하게 위치 된 카테터의 구 상체는 HBSS가 플라스틱 배관에 부착 구를 최소화 HSA로 보충되어 제공된 자유롭게 흐르고, 그리고 쉽게 가시화 될 수있다. 더욱이,이 기법은 주입을위한 표준 니들 / 주사기를 사용하여 발생할 수있는 셀에 전단 응력을 방지하고, 감염의 위험이 높은 운반 많은 기술적 도전 절개 수술에 대한 필요성을 회피한다. 하나의 주요 단점은 t이다카테터를 통해 구 전송에 대한 저항이 잘록한 부분이 높고으로 회전 타원체의 모자 다수는, 예컨대 복강 같은 넓은 체강 내로 주입 될 수있다. 우리는 또한 최근 타원체의 MSC 활성화 동일한 수준이 특정 시판 XF 매체를 사용함으로써 달성 될 수 있다는 것을 입증 XFM -1- 여기 불리는 것이면 재조합 기술을 통해 사람의 혈액에서 수득 또는 제조 HSA 보충되었을 14. 중간 엽 줄기 세포에 가장 XF 미디어가 처음 2D에서 세포의 최적의 확장을 공식화했다 아마도 때문에, MSC의 회전 타원체는 XF 미디어 (14)의 모든 종류의 PGE2와 TSG6의 높은 수준을 생성하지 않는 점에 유의하는 것이 중요합니다. HSA의 종류가 다양 역가 14주의하는 것이 중요하다. 또한, PGE2의 절대 레벨이 약간 다를 수 활성화 타원체의 CM 검출PGE2를 위해 사용 된 ELISA로 사라져 참으로 경쟁 분석이다. 따라서, 모든 PGE2 ELISA에 적절한 컨트롤을 포함하고, 서로 다른 시간에 분석 샘플 사이 또는 상이한 플레이트에 데이터를 직접 비교 피하기 위해 중요하다. 또한, 중간 엽 줄기 세포는 철저하게 이전에 매달려 준비에 XF 매체에 세척 따라서 잔류 CCM과, FBS 구성 요소의 제한 이월을 제거하기 위해 삭제해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이 쉽게 구 형성 및 치료 유전자 발현의 다른 미디어 배합물을 평가하기 위해 채택 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 3D에서 배양 할 때 분명히, 일반적으로 2D 중간 엽 줄기 세포에서 발생하지 않는 수많은 세포 신호 이벤트는 모션에서 설정됩니다. 세포 간 및 세포 - 기질 간 상호 작용 및 인테그린 cadherins 가이드 타원체 형성 및 다짐 24, 25, 26에 의해 매개 및 회전 타원체 치료 가능성이 매우 중요하다. 세포 집계와 공동으로마이너 아폽토시스 다수의 잠재적 치료 인자 4, 5의 제조 결과 MSC 활성화 과정에서 보조를 포함한 타원체 다양한 스트레스 신호로 MPACT. 우리는 이전에 MSC 활성화 및 PGE2 및 TSG6 (12)의 생산 분비 IL-1 신호 전달의 중요한 역할을 나타내었다. 많은 다양한 신호 전달 경로에 대해 MSC 활성화에 그 원조 알 수없는 남아 있지만, 매달려 드롭 문화 플랫폼은이 현상을 연구하고 MSC 기반 치료를 향상시킬 수있는 실용적인 방법을 제공한다. 전체적으로, 우리는 항 염증성, 면역 조절 및 항암 인자를 생성하기 위하여, 여기에서 프로토콜 화학적 정의 XF 조건 하에서 활성화 또는 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포의 프라이밍 방법에 대하여 설명 하였다. 이 그대로 MSC의 타원체가 생체 내에서 제공 할 수있는 방법을 우리는 또한 설명했다.

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 &quot;손실 / 감소&quot;MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다. 많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 4, 5, 7. 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우8, 9, 10. 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 4, 5, 6을 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 ​​것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 6, 8, 9에 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 11 요인을 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 8, 12, 13를 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 (12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 &quot;뺑소니&quot;로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 (2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 8, 10, 14 악용 될 수있는 현상을 증가한다. 기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS (14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.

<table><tbody><tr><td>MEM-&amp;alpha; (minimal essential medium alpha)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (fetal bovine serum), premium select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>component of complete culture media for all types of cells</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>component of complete culture media for all types of cells</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>component of complete culture media for all types of cells</td></tr><tr><td>Sterilization Filter Units, 0.22 &amp;micro;m PES membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>media sterilization</td></tr><tr><td>150 mm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>D8554&amp;nbsp;SIGMA</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>Thermo Forma water-jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; humidified incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 3110</td><td>incubation of cultured cells</td></tr><tr><td>Early passage MCSs</td><td>Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&amp;amp;M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott &amp;amp; White</td><td>NA</td><td>preparation of 2D and 3D cultures of MSCs</td></tr><tr><td>water bath</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>warming media to 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>manual liquid handling</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>handling sereological pipetes</td></tr><tr><td>Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>liquid handling</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>cell culture processing</td></tr><tr><td>0.25% trypsin/EDTA solution</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>lifting adherent cells and dispersing cell aggregates</td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>cell centrifugation</td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>cell centrifugation</td></tr><tr><td>Eppendor refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Model 5810R</td><td>cell centrifugation</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>cell counting</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells</td></tr><tr><td>HSA (Human serum albumin)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Component of xeno-free MSC media</td></tr><tr><td>rHSA (recombinant Human serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&amp;nbsp;SIGMA</td><td>Component of xeno-free MSC media</td></tr><tr><td>Total RNA isolation Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Total RNA extraction</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Sample homogenization prior to total RNA extraction</td></tr><tr><td>RNAse-free DNase Set&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>On-column DNA elimination during total RNA extraction</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&amp;nbsp;ALDRICH</td><td>inhibition of RNAses in RLT buffer</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>mixing sample</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA concentration and quality</td></tr><tr><td>High capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>transcription of total RNA into cDNA</td></tr><tr><td>Gene Expression Assays</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>varies</td><td>primer/probe combination for real-time PCR</td></tr><tr><td>Fast Universal PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>master mix for real-time PCR reaction</td></tr><tr><td>Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>real-time PCR</td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>cell centrifugation, sample collection and storage</td></tr><tr><td>(-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model Thermo Forma 8695</td><td>sample storage</td></tr><tr><td>PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>KGE004B</td><td>estimation of cytokine concentration in the sample</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024;10566-032</td><td>macrophage culture media</td></tr><tr><td>J774 mouse macrophages</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>mouse macrophage cell line</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; macrophage stimulation</td></tr><tr><td>LPS (lipopolysaccharide)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; macrophage stimulation</td></tr><tr><td>Mouse TNF-a ELISA kit</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MTA00B</td><td>estimation of cytokine concentration in the sample</td></tr><tr><td>Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>M1000B</td><td>estimation of cytokine concentration in the sample</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>splenocyte culture media</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; spheroid delivery; splenocyte preparation</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; splenocyte stimulation</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Splenocyte preparation</td></tr><tr><td>Red blood cell lysis solution (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>removal of red blood cells during splenocyte isolation</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;#947; (interferon gamma) ELISA kit</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MIF 00</td><td>estimation of cytokine concentration in the sample</td></tr><tr><td>LNCaP prostate cancer cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>DNA-based cell proliferation assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>cell number measurement based on DNA content</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>component of lysis reagent</td></tr><tr><td>EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>calcium chelator, component of lysis reagent</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>RNA degradation for measurement of DNA</td></tr><tr><td>Filter-based multi-mode microplate reader</td><td>BMG Technology</td><td>NA</td><td>Microplate assays (ELISA, cell quantification, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td></tr><tr><td>HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>resupsension of MSC spheroids prior to &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; injections</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>Anesthesia for &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; injections</td></tr><tr><td>Oxygen, compressed gas</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>For use with isoflurane</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2 cabinet</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 1385</td><td>Sterile cell culture</td></tr><tr><td>Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>Delivery of shperoids into peritoneal cavity</td></tr><tr><td>Sterile micropipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>varies</td><td>liquid/cells handling</td></tr></tbody></table>

production and administration of therapeutic mesenchymal stem/stromal cell (msc) spheroids primed in 3-d cultures under xeno-free conditions

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 &#39;타원체&#39;를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.

현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 &#39;타원체&#39;을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사용되는 것으로 묘사 연구 및 임상 응용 프로그램. 구 생산에 필요한 세포의 다수 cm 2 당 일반적으로 저밀도 100-200 세포를 중간 엽 줄기 세포를 시딩하고 약 80 % 합류 (도 2까지 6-7일 위해 세포를 확대하여 일주일 이내에 취득 할 수있다 ). 세포 성장 동역학은 매일 생존 세포를 계수함으로써 결정 강력한 확장 단계 (3-7 일) 1~2일 간략한 유도기 (도 2c를 &lt;다음 지적/ STRONG&gt;). 통로 (2) 또는 제 3 엽 줄기 세포는 통상적 CCM에서 배양 된 세포를 냉동 보존 1,000,000 단일 바이알로부터 50-100000000 세포를 수득 하였다. 확장 및 수확 후, 중간 엽 줄기 세포는 타원체, μL 당 일반적으로 500 ~ 1,000 세포를 생성하는 높은 세포 농도로 일시 중단됩니다. 매달려 드롭 배양 이후에 (도 3) 대칭 적절 접시의 바닥에 위치되는 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면 상에 중간 엽 줄기 세포를 함유하는 배지 25-40 ㎕의 액 적을 이송에 의해 제조된다. μL 당 714 세포에서 CCM의 35 μl의 방울에 현탁 경우 (예 : 드롭 당 25,000 세포), 중간 엽 줄기 세포는 먼저 결국 드롭 (그림 3C)의 정점에서 72 시간에 하나의 컴팩트 한 영역을 생성하기 위해 병합 작은 집합체로 조립한다. 회전 타원체는 MSC 확장에 최적화 된 시판 XF 미디어의 여러 종류에 72 시간에 걸쳐 형성여기 XFM-1 및 XFM-2라고도합니다. 그러나 XFM-1 단일 컴팩트 분야의 형성은 13 ㎎ / ㎖ 인간 혈청 알부민 (HSA), CCM의 추정 된 총 단백질 함량 (도 3d)를 반영하는 농도의 보충을 필요로한다. 단일 소형 구체 쉽게 HSA없이 또는 단백질 무료 αMEM (그림 3D)에서 기본 XFM-1에서 형성하지 않습니다. 적절한 화학적으로 정의 된 XF 매체 (예 XFM-1 + HSA)에서 구 조립, MSC 표현형의 변화 근본적으로 (그림 4), 때, PGE2 및 TSG6 (그림 4C)을 포함하여 상향 조절하는 다수의 항 염증 인자의 발현 중. 그러나 TSG6 및 PGE2의 생산은 현저하게 HSA (그림 4C)없이 XFM-2 또는 XFM-1의 분야로 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 증강되지 않습니다. 특히 이러한 항 염증 인자뿐만 아니라, 항암 요인 TRAIL 및 IL-24가 높은 경우 t, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층하는 구형 엽 줄기 세포에 비해 상향 조절 된그는 인간의 혈액 (그림 4D)에서 준비 중 재조합 HSA (RHSA) 또는 임상 등급 HSA (CHSA) 보충 XFM-1에서 배양 한 분야입니다. 다양한 미디어 제형으로 제조 MSC 분야의 치료 가능성을 평가하기 위해, 여러 가지 실제 테스트는 (그림 5) 수행됩니다. 타원체의 면역 조절 성 특성은 첫째 LPS 자극 식세포 및 CD3 자극 된 비장 세포 / 림프구 (그림 5)에 의해 생성 된 사이토 카인의 수준에 구 CM의 효과를 측정하여 시험 관내에서 결정된다. MSC에서 CM은 CCM 식세포 TNFα 및 IFNγ의 비장 XFM-1 / HSA 현저히 억제 생산 분야에서 배양하면서 동시에 항 염증 사이토 카인 수준이 증진 IL-10 (도 5a 및도 5b). 분야의 항암 특성은 구 형상 (O)의 영향을 측정함으로써 평가되고N 성장 된 LNCaP 전립선 암세포의 형태. XF 매체 XFM-1 / HSA 효과적으로 FBS 함유 CCM (도 5C 및 5D)과 유사한 된 LNCaP 증식을 감소시켰다. 중요한 것은, 그대로 MSC 스피어 (도 6) 생체 내에서 세포의 항 염증 활성을 테스트하기 위해 마우스의 복강 내로 투여 될 수있다. 이 실험을 위해,이 분야 XF 상태를 유지하면서 플라스틱 배관에 그 접착력을 최소화 HSA의 낮은 농도를 함유하는 HBSS로 주입을 위해 준비된다. 이어서, 구체 쉽게 적절한 표준 복강 내 주사를 위해 배치 된 니들 / 카테터 조립체 (도 6c과도 6d)를 통하여 피펫 (도 6b)을 이용하여 포집 관 (도 6a)에서 전송 한 후 주입 될 수있다. 이 방법을 이용하여, MSC의 타원체 규칙적 일 수무결성 (그림 6 세대 6H)을 방해하지 않고 효율이 90 % 이상 (그림 6E 및 6F)에서 전송. 복강 내에 카테터 팁의 부적절한 위치는 가난한 구 납품 및 높은 유지 (그림 6 층)에 연결됩니다. 중요한 것은, 피펫 / 카테터 내의 구 보존 레벨 질적 육안 검사로 결정되거나, 정량적 / 수집 잔류 구체 용균 시판 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트 (도 6F)로 세포 수를 측정함으로써. 포스트 분사 구 보존 분석 실험 중에 포함 / 제외 기준을 만들 수 있습니다. 특히, TSG6 및 PGE2의 높은 수준을 분비하는 CCM 및 XFM-1 / HSA 회전 타원체의 능력은 드롭 문화 (그림 6I)에 걸려에서 구체의 전송 후 최소 6 시간을 유지됩니다. 자신의 체외 EF 유사fects는 XFM-1 / HSA 분야는 염증성 TNFα (그림 6J)을 감소시키면서 즉시 복막에 정맥 LPS의 관리, 강화 된 PGE2 및 IL-10 수준으로 전신 염증의 유도에 따라, 마우스의 복강에 주입. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig1.jpg" /> 그림 1 : XF 조건에서 구형 마이크로 조직으로 준비하는 중간 엽 줄기 세포의 secretome를 활용하기 위해 개발 플랫폼의 도식 표현. 단층 문화 (1) 등의 확장에 따라, 중간 엽 줄기 세포는 프라임 / 세포를 활성화 높은 세포 농도로 배양 접시 (2)의 뚜껑에서 방울을 걸려에서 일시 중단됩니다. 72 시간 후, (3) 조정 배지 (CM) 및 (4) 본래 타원체가 소적에서 수확 다양한 하류 어플리케이션에서 이용 될 수있는 두. 형상은 면역 조절 인자뿐만 아니라 다른 치료 COMPON 풍부엔트. 매달려 방울 형성 컴팩트 타원체 쉽게 도관 (6)을 통해 생체 내 투여 효과적으로 피펫 (5)를 사용하여 전송 될 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig2.jpg" /> 도 2 단층 배양 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 성장 특성. 통로 (2)의 중간 엽 줄기 세포는 15cm 접시 (접시 당 15,000 세포)와 CCM 7 일간 배양 낮은 밀도 (cm 2 당 100 셀)을 접종 하였다. 보통 하루 5 ~ 6 (수확하기 전에 24 ~ 48 시간)에 다시 3 일에 변경 하였다. 세포를 플레이 팅 후 MSC들 삼일 (A) 7 일간 (B)의 대표적인 위상차 현미경 사진. 스케일 바 = 200 μm의. 중간 엽 줄기 세포의 (C) 성장 동역학3 기증자로부터 얻은 날 (7)에 일이 매일 가능한 부착 세포의 수를 계산하여 결정 하였다 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig3.jpg" /> 그림 3 : XF 매체에 MSC의 타원체를 프라이밍에 대한 드롭 문화를 걸려 제조. 기술을 묘사 (A) 사진이 빠르게 조직 배양 접시 뚜껑의 아래쪽에 방울을 걸려 층합니다. (B) 사진 교수형을 설명하면 요리의 기초 위에 반전과 뚜껑의 위치 후 삭제합니다. (C) 위상차 현미경으로 시각으로 매달려 드롭 25,000 엽 줄기 세포의 집계에 시간에 따른 변화를. 목적은 드롭의 정점에 집중했다. 스케일 바 = 500 μm의. (D) 난 ...MSC 분야의 GES가와 FBS (예 : CCM)없이 αMEM, XFM-1 및 HSA없이, 그리고 XFM-2와 HSA없이 등 다양한 미디어 제제를 사용하여 드롭 문화를 걸려 3 일 후에 형성했다. 스케일 바 = 200 μm의. 패널 D의 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig4.jpg" /> 그림 4 : 3-D XF의 문화 MSC 활성화의 평가. (A) 분야 / CM은 / 반전 접시 뚜껑을 기울 셀 리프터를 이용하여 에지 방울 강요 72 시간 후에 수확한다. 25,000 세포로부터 조립 분야를 쉽게 수집 중에 가시화 될 수있다. (B) approxi의 사진많은 조직 배양 접시의 뚜껑에서 수집 한 500 구를, 후면부. 분야는 빠른 속도로 원심 분리하지 않고 튜브의 바닥에 내려. 72 시간을 ELISA로 측정 한 후, PGE2의 (C) 단계는 MSC 분야에서 분비. 실시간 RT-PCR은 TSG6 수준을 측정 하였다. TSG6 및 PGE2 모두 타원체에서 MSC 활성화를 선별하기위한 중요한 지표이다. XF 매체 XFM-1 + HSA는 PGE2와 TSG6 생산 (빨간색 상자)의 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하고 (*** p &lt;0.001, αMEM 샘플에 비해) 학생의 t-test를 분석 하였다. (D) PGE2 ELISA 및 실시간 RT-PCR CCM, 13 ㎎ / ㎖ 재조합 HSA (RHSA) 특별히 보충 XFM-1에서 제조 분야에 대한 분석, 또는 인간의 정맥 혈액으로부터 제조 된 임상 등급 HSA (CHSA). 접어 변화가 부착 된 단층 중간 엽 줄기 세포 (RQ = 1)에서 측정 하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고 (** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001 비교 스튜던트 t 검정에 의해 분석 된단층 중간 엽 줄기 세포). 패널 C와 D의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig5.jpg" /> 그림 5 : 생체 기능 분석에서 드롭 문화를 걸려에서 수집 MSC-CM의 항 염증 및 항암 특성을 평가. (A) LPS 자극 된 마우스 대 식세포 (MQ)를 기준으로 TNFα 및 IL-10 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 효과를 나타내는 ELISA를 대표 결과. (B) 항 CD3 항체로 자극 된 마우스의 비장 세포 (SPL)에 의해 IFNγ 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 영향을 보여주는 ELISA 결과를 대표.<html> CCM 및 XFM-1 / HSA 제조 MSC 분야에서 기본적인 CCM 및 XFM-1 / HSA 또는 조정 배지 (CM)로 처리 된 LNCaP 전립선 암세포의 (C) 위상차 현미경 사진. 된 LNCaP 세포를 RPMI 배지 (대조군)에서 배양 하였다. 스케일 바는 200 μm의입니다. 된 LNCaP 전립선 암세포의 성장 (D) 양적 변화는 시판되는 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트로 측정 하였다. 점선은 잘 5,000 세포의 파종 밀도를 나타냅니다. 모든 패널의 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, 스튜던트 t 검정 (** p &lt;0.001)로 분석 하였다. 모든 패널의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 로드 / 55126 / 55126fig6.jpg &quot;/&gt; 도 6 : 20G 정맥 바늘 / 도관 시스템을 사용 XF 조건 하에서 제조 된 중간 엽 줄기 세포의 손상 타원체, 효율적인 전송. (A) 0.2 % HSA가 포함 된 HBSS에 주입을 준비 XFM-1 / HSA MSC의 분야와 15 ML 원뿔 튜브의 대표 사진. (B) 200 μL 피펫 팁에 흡인 후 MSC 분야의 대표적인 사진. (C) 마우스에 그대로 MSC의 타원체를 관리하는 데 사용되는 20 G 바늘 / 카테터 어셈블리의 이미지. 폴리 우레탄 카테터 어댑터 내로 피펫 팁의 적절한 위치 설정을 보여주는 (D) 이미지. 즉시 배양 접시에 카테터를 통해 통과 후 MSC 분야의 (E) 이미지. 약 100 중 95 구를 옮겼다. 마우스의 복강 내로 구 전달 (F)의 효율은 유지 / 용균 분야를 수집하여 측정 하였다용해 분야의 총형로부터 얻은 세포의 수에 대하여 상용 DNA 기반 세포 분석을 통해 정량 피펫 / 카테터 측정 셀 번호. 빨간색 점선은 90 %의 전송 효율을 나타낸다. 불량 구 전달 (71 %)은 하나의 주입 (화살표)으로 관찰 하였다. (G) 패널 E의 분야의 위상차 현미경 (보기 확대). 스케일 바 = 200 μm의. (H) 조직 배양 접시 상에 전송 후 XFM-1 / HSA 구 16 시간의 위상차 현미경 사진. 중간 엽 줄기 세포의 섬유 아세포, 스핀들 형상의 형태가 구형에서 이전 셀에서 유지된다. 스케일 바 = 200 μm의. TSG6 및 PGE2는 CM 수행 된 소염 인자 (I) ELISA 분석법을 2 ml의 αMEM / 2 % FBS를 포함하는 6 웰 플레이트로 분야의 전사 후 6 시간을 모았다. XF 매체 XFM-1에서 제조 분야는 / HSA는 TSG6 및 PGE2 분비 (빨간색 상자)의 가장 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균으로 표현± SD가, 학생의 t-test를 분석 하였다 (*** p &lt;0.001, αMEM 샘플에 비해). 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. (J) 독소의 정맥 내 주사 (LPS)에 의해 도전 마우스에서 TNFα의 수준을 감소시키면서 복막 PGE2 및 IL-10을 증가 복강 내로 주입 타원체하는 능력을 예시하는 대표 그래프. 샘플은 염증과 80 타원체 전달 유도 후 복막 세척액 6 시간으로 얻었다. 데이터는 평균 ± SD로, 학생의 t-test를 분석 하였다 표현 (* P &lt;0.05, 대조군과 비교 ** P &lt;0.01). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55126/55126fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

11.8K 조회수.  University of Mary Hardin-Baylor. The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

연구

생체공학

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) substrates such as tissue culture polystyrene (TCPS). However, characteristic changes of PDL cells have been observed during in vitro culture. This phenomenon is probably because the 2D TCPS differs from the in vivo three-dimensional (3D) microenvironment. Compared to cells cultured on 2D substrates, cells grown in a 3D microenvironment exhibit more similarities to in vivo cells. Therefore, 3D cell culture models provide a promising alternative for conventional 2D monolayer cell culture. To improve conventional PDL cell culture models, we have recently developed a 3D cell culture method, which is based on spheroid formation of PDL cells on chitosan films. Here, we present detailed cell spheroid culture protocols based on chitosan films. The 3D culture system of PDL cellular spheroids overcome some of the limitations related to conventional 2D monolayer cell culture, and thus may be suitable for producing PDL cells with an enhanced therapeutic efficacy for future periodontal tissue regeneration.

Here, we present protocols of culturing human periodontal ligament (PDL) cell spheroids by chitosan films. The culture of three-dimensional (3D) cellular spheroids provides an alternative to conventional tissue culture polystyrene (TCPS) culture system.

키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

발생학

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

생화학

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>병아리 배아에서 인간 줄기 세포 스페로이드의 거동을 조사하기 위한 무표지 이종이식 모델

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

병아리 배아에서 인간 줄기 세포 스페로이드의 거동을 조사하기 위한 무표지 이종이식 모델

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

<meta charset="utf8"></head><body>치료 평가를 위한 탈모증을 캡처하는 3D-PDAC 모델

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the dense desmoplastic extracellular matrix (ECM) that surrounds the tumor and reduces vascularization, generally termed desmoplasia. A variety of drug combinations and formulations have been tested to treat the cancer, and although many of them show success pre-clinically, they fail clinically. It, therefore, becomes important to have a clinically relevant model available that can predict the response of the tumor to therapy. This model has been previously validated against resected clinical tumors. Here a simple protocol to grow desmoplastic three-dimensional (3D)-coculture spheroids is described that can naturally generating a robust ECM and do not require any external matrix sources or scaffold to support their growth.
Briefly human pancreatic stellate cells (HPaSteC) and PANC-1 cells are used to prepare a suspension containing the cells in a 1:2 ratio, respectively. The cells are plated in a poly-HEMA coated, 96-well low attachment U-well plate. The plate is centrifuged to allow the cells to form an initial pellet. The plate is stored in the incubator at 37 &#176;C with 5% CO2, and media is replaced every 3 days. Plates can be imaged at designated intervals to measure spheroid volume. Following 14 days of culture, mature desmoplastic spheroids are formed (i.e. average volume of 0.048 + 0.012 mm3&#160;(451 &#181;m x 462.84 &#181;m)) and can be utilized for experimental therapy assessment. Mature ECM components include collagen-I, hyaluronic acid, fibronectin, and laminin.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Desmoplastic Spheroid Model을 사용한 암 치료 반응 검증

Pancreatic cancer remains one of the toughest cancers to treat. Therefore, it is critical that pre-clinical models evaluating treatment efficacy are reproducible and clinically relevant. This protocol describes a simple co-culture procedure to generate reproducible, clinically relevant desmoplastic spheroids.

공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

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3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

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병아리 배아에서 인간 줄기 세포 스페로이드의 거동을 조사하기 위한 무표지 이종이식 모델

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공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

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