C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

참고 : 샘플 동의를 주었다 환자를 얻었다. 모든 프로토콜을 검토하고 적절한 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 인간의 조직과 세포를 처리하는 동안, 항상 당신의 기관에 의해 지정된, 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)주의 사항을 준수합니다. 시약 1. 준비 <ol><li> FACS 버퍼를 준비 : 10 ML의 FBS, 188 5 ㎖ 폴록 사머 500 mL의 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 mL의 펜 연쇄상 구균 (PBS)를 추가합니다. </li><li> 혼합물을 소화 준비 : 0.375 g C.의 hemolyticum의 콜라게나 제 II 형 분말과 5 ㎖ 폴록 사머 멸균 199 / EBSS 매체 (188) 500 mL를 넣고. </li><li> 표준 매체를 준비 : 50 ML의 FBS 500 mL를 둘 베코의 변형 이글 중간에 5 mL의 펜 연쇄상 구균을 추가합니다. </li></ol> 2. 수확과의 ASC의 분리 참고 : 적절한 기관 승인이 인체 조직을 사용하는 및 분리 시간 동안 제자리에 있는지 확인잃어버린 줄기 세포. 인간의 복부를 확보 측면에, 또는 선택 과목 지방 흡입 수술을받은 건강한 기증자로부터 피하 지방을 허벅지. 플라스틱 흡입 용기에 지방을 유지합니다. <ol><li> 원래 플라스틱 용기에 지방에 : 1 비율로 1 멸균 PBS를 추가합니다. (500 ㎖ 지방이 존재하는 경우, 500 ㎖의 PBS를 추가). 30 초 동안 부드러운 교반 혼합. 수층 흡인에 부착 된 10 mL의 플라스틱 피펫 수층을 하부 (도 1), 그리고, 흡에 정착 폐기 할 수있다. </li><li> 대형 플라스틱 용기에 지방을 가만히 따르다하고 1 혼합물을 소화 추가 : 1의 비율. 용기를 닫고 70 % 에탄올로 외부를 청소합니다. 파라핀 필름으로 뚜껑을 밀봉. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 180 rpm에서 오비탈 진탕 컨테이너 선동. </li><li> : 1 비율로 1 표준 매체를 추가하여 소화를 중화. (1,000 mL의 지방 혼합물이있는 경우, 1,000 mL로에게 표준 매체를 추가). </li><li> 동일하게 (25)의 짝수로 액을 분배0 mL의 플라스틱 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ℃에서 20 분 동안 300 XG에 혼합물 </li><li> 뜨는을 대기음 그대로 펠렛을 떠날주의하십시오. 각 원뿔 튜브 5 mL의 표준 매체를 Resuspend 펠릿. </li><li> 한 50ml의 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 현탁액을 필터. 그런 다음, 4 ℃에서 15 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 상등액을 흡인하고 5 ㎖ 실온 RBC 용해 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 실온에서 15 분 (RT) 300 XG에서 원심 분리하여 실온에서 5 분 동안 방치시키고. </li><li> 뜨는을 대기음 15 mL의 표준 매체에 펠렛을 재현 탁. 다시 한 50㎖ 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 필터링. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔에서, 밀도 기반의 분리 (시약의 목록 참조)을 위해 설계된 15 ML의 polysucrose 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 다음에, 45 ° 각도로 튜브를 들고 신중 측에 세포를 피펫튜브 polysucrose 솔루션의 상단에있는 세포 현탁액은 부드럽게 층 (그림 2) 그래서. 주 : 용액의 표면에 피펫 세포에 중요하다. 이 돌이킬 수없는 혼합물을 생성하므로 세포의 현탁액에 polysucrose 솔루션을 추가하지 마십시오. 마찬가지로, polysucrose 솔루션의 중심에 세포를 피펫하지 않습니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에이 혼합물을 원심 분리기. 낮은 가속 사용 (2 - 10 명 중 3)이 단계 0으로 원심 분리기의 브레이크 기능을 설정합니다. 참고 : 중간에 흐림, 바닥에 분명, 연어 색의 상단에 : 세 가지 레이어가 표시됩니다. 중간 계층은 관심의 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> 10 mL를 피펫을 사용하여 조심스럽게 중간 층을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 주 :이 완전히 중간층의 일부를 남긴다보다 상부 및 하부 층의 일부를 가지고 중간층 전송 과정에서하는 것이 좋다. </li> &lt;리&gt; 혈구를 사용하여 세포를 세어 총 생균 수를 결정합니다. 참고 : 일반적으로 사용 트리 판 블루 세포 계산을 지원하기 위해 0.8 %의 최종 농도로 세포 혼합액에 첨가 하였다. 유력한 살아있는 세포는 파란색 염료를 차지하지 않습니다과 흰색이 나타납니다. </li></ol> BMPR-IB 양성 세포와 세포 함유 비계의 준비를 위해 정렬 3. FACS <ol><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. (2.13 단계에서 수행 된 세포 수에 기초하여) 100 μL 당 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁. </li><li> 라벨 플라스틱 원심 관에 적어도 1 천만 셀로 이동 &quot;BMPR-IB.&quot; 별도로 표시된 별도의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 100 μL FACS 버퍼에 백만 세포를 전송 &quot;흠.&quot; 은 &quot;흠&quot;튜브에 1 mL의 FACS 버퍼를 추가합니다. FACS는 EXPER 부분을 정렬하는 동안 얼음에서 FACS 완충액 세포의 나머지 유지iment가 수행되고있다. 이 세포 레이블 &quot;정렬되지 않은합니다.&quot; 컨트롤 나중에 실험에서 이러한를 사용합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 &quot;BMPR-IB &#39;관 형광 항 인간 BMPR-IB 항체의 적절한 양을 추가한다. 항체를 배포 부드럽게 상하 혼합물을 피펫. 참고 : 우리는 1:10 희석에 인간 BMPR-IB / ALK-6 APC - 복합 항체를 사용합니다 (자세한 내용은 시약의 목록 참조). 그러나, 다른 제조업체의 항체는 다른 권장 농도를해야합니다. </li><li> 빛을 유지하는 방법으로 얼음 양동이를 커버. 셀 / 항체 혼합물을 30 분 (또는 항체를 제조사의 지시에 따라) 동안 앉아 할 수있다. 주 : 안티 BMPR-IB 항체는 이차 항체를 필요로하는 차 접합 항체 오면, 제조업체의 지시에 따라 이차 항체와 얼음의 별도의 염색 공정을 수행한다. </li><li> 양쪽 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 5 분 동안 300 XG. 펠렛을 대기음하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 1 ㎖의 FACS 완충액으로 펠렛 세포를 재현 탁. 또 다시 5 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 조심스럽게 상층 액을 흡인 및 1 mL의 1 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁. </li><li> 새로운 레이블이 유리 FACS 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 &quot;BMPR-IB&quot;, &quot;흠&quot;및 &quot;정렬되지 않은&quot;세포를 필터링합니다. 세포가 필터에 남아되지 않도록 500 μL FACS 버퍼와 필터를 씻어. 또한 &quot;BMPR-IB 양성&quot;을 표시 두 개의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 2 mL의 표준 매체를 추가 &quot;BMPR-IB 음성.&quot; FACS 기계에 정렬 된 세포를 수집하기 위해이 두 가지를 사용합니다. </li><li> FACS 기계에서 형광 마커 음의 게이트를 정의하기 위해 흠없는 세포를 사용합니다. </li><li> 100 미크론 노즐 각각 콘 튜브로 정렬 BMPR-IB 양 및 음의 세포를 사용하여표준 매체 이닝. FACS 기계가이 능력이있는 경우 정렬 동안 4 ° C에서 냉각이 튜브를 유지합니다. 참고 : 샤론 외 알에 의해 조브 제 13 조를 참조하십시오. FACS 정렬을위한 우수한 프로토콜. </li><li> 혈구를 사용하여, 각각의 튜브에 세포를 계산. 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 &quot;&quot;BMPR-IB 양성 &quot;BMPR-IB 음성&quot;및 &quot;정렬되지 않은&quot;튜브를 원심 분리기와 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 그 후 250 μL 당 백만 세포의 농도를 표준 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 미리 잘라 4mm PLGA (폴리 [락트산 - 코 - 글리콜 산]) 하이드 록시 아파타이트로 코팅 된 지지체를 얻습니다. 24 웰 플레이트의 우물에 각 발판을 놓습니다. BMPR-IB 양성 정렬되지 않은, 그리고 BMPR-IB 음 (그림 3) : (. 내가합니다 .e, 20 셀) 세 그룹 중 하나에서 세포 현탁액 50 μL 각 발판을 커버. 참고 : 제발소호 등의 알에 의해 조브 제 14 조를 참조하십시오. PLGA 인공 지지체의 구성에 대한 자세한 내용은. </li><li> 부분 (골격의 탈수를 방지하기 위해)의 뚜껑 플레이트를 커버하고, 30 분 동안 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다 표준 배지 주변 빈 웰 채운다. </li></ol> 두개골 결함 및 ACS 함유 비계의 적용 4. 작성 참고 : 적절한 기관 승인이 살아있는 생쥐의 두개골 결함의 생성을 제자리에 있는지 확인합니다. 이 프로토콜은 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> 이소 플루 란 가스 흡입 또는 주입 지속성 칵테일 마취제를 사용하여 CD-한 누드 마우스를 마취. <ol><li> 단독으로 가스를 사용하기 위해, 마취 실에 마우스를 위치시키고이 산소의 흐름을 시작 - 이소 플루 란 2 % 농도 3 L / 분. 마우스는 f를 일단ully 의식, absorbant 패드 따뜻한 물 순환 담요 위에이 발생하기 쉬운 배치하고 산소와 이소 플루 란의 동일한 농도와 마취 코 콘에 그 주둥이를 놓습니다. 조심스럽게 호흡을 모니터링하고 필요에 따라 이소 플루 란의 농도를 조정합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 마취 챔버 내에 마우스를 마취, 주입 된 지속성 마취 칵테일을 사용하고 마취 칵테일 주입. 마취 실에서 마우스를 제거하고 그 행동을 관찰. 참고 : 마우스가 잠시 마취에서하지만 몇 분 내에 나타날 수있다 다시 완전히 주입 마취의 효과에 따라 마취해야합니다. absorbant 패드로 덮여 따뜻한 물 순환 담요에 마우스를 전송합니다. 참고 : 마취 칵테일을 위해, 우리는 생리 식염수에 케타민 10 ㎎ / ㎖과 자일 라진 1 ㎎ / ㎖를 포함하는 혼합물, 복강 전달하는 것이 좋습니다. 이 혼합물의 표준 용량은300 μL 100 ㎎ / ㎏과 자일 라진 10 ㎎ / ㎏을 케타민와 동일합니다 30 g을 마우스합니다. 주 사용 마취제에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. </li><li> 마취의 깊이를 결정하기 위해 발가락 핀치 책략을 사용합니다. 이 가볍게 외과 의사에 의해 핀치 때 적절하게 마취 마우스는 발을 철회하지 않습니다. </li><li> 각막의 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀의 SR 피하을 관리 할 수 ​​있습니다. 참고 : 우수한 통증 완화의 수술 결과 이전에 진통을 제공. </li><li> 전체 절차 동안 마우스의 호흡 속도를 모니터링한다. 참고 : - / 분 (100) 숨을 제대로 이소 플루 란에서 마취 마우스 (50)의 호흡이 있어야합니다. 증가 된 호흡은 감소 호흡 속도는 마취가 너무 깊은 나타낼 수 있습니다 동안 마취가 너무 빛을 나타냅니다. </li></ol></li><li> 포비돈 - IOD와 두개골의 지느러미 측면의 피부를 준비오프라인 용액을 70 % 에탄올 세번 하였다. 노출 수술 부위를 떠나, 멸균 커튼으로 드레이프. 주 : 멸균 수술 장갑을 착용하고 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 유지한다. 그러한 멸균 드레이프와 멸균 도구로 멸균 표면과 객체를 터치합니다. 보조 조명, 오픈 봉합 패킷 등을 조정 한 </li><li> 15 블레이드 메스를 사용하여 지느러미 두개골의 대부분에 걸쳐 연장 시상 중간 선 절개를합니다. 미세 톱니 집게를 사용하여 오른쪽 마루 뼈를 노출시키는 절개 오른쪽의 피부를 철회. </li><li> 멸균 4mm 다이아몬드 코팅 트레 드릴 비트와 드릴을 이용하여 마루 뼈 통해 결함 드릴. 경막 층에 뼈 과거의 결함을 연장하지 마십시오. (그림 4) </li><li> 결함에 발판을 놓은 다음 나일론 봉합사를 실행하는 피부 절개를 닫습니다. </li><li> 마우스를 모니터링하고 표준 수술 후 치료 a를 제공제도적 지침에 ccording. <ol><li> 그것을 복구하는 동안 깨끗한 케이지 내부에 깨끗한 종이 타월에 마우스를 유지합니다. 케이지의 절반은 따뜻한 물 순환 담요 위에 배치되어야하고, 마우스는 처음이 반으로 배치해야합니다. </li><li> 이 ambulate하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스 방치하지 마십시오. 완전히 복구 될 때까지 다른 마우스와 케이지에 수술을 시행 한 마우스를 반환하지 않습니다. </li></ol></li><li> 테스트 할 각 지지체의 새로운 마우스로 위의 단계를 반복합니다. 뜨거운 구슬 살균기 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 수술 사이에 수술 도구를 소독. </li><li> 얼마 후 절차 후 2, 4, 6 및 8 주째에, 두개골 폐쇄 결함 비율을 분석하는 마이크로 CT 스캔을 사용한다. 참고 : 리바이스 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 두개골 결함의 마이크로 CT 스캔에 대한 설명 (6). </li><li> 경우 실험 공단 인TE 클린 안락사 챔버에 넣어서 2 L / min의 속도로 챔버 내로 탄산 가스의 유동을 시작하여 마우스를 안락사. 호흡이 완전히 (후 약 10 분)을 중단 한 후 안락사를 확인하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 실험 완료 후 선택적으로, 사용 단면 조직 학적 염색 결함 내 골 형성을 평가. 참고 : McArdle 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 뼈를 준비 자세한 내용은 12 조직학에 대한 표본. 조직 학적 및 염색 기술 검토를 들어, 외과 병리학 (15)의 수동으로 조직 학적 설명서를 참조하십시오. </li></ol>

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The authors have no disclosures to make.

프로토콜 내에서 중요한 단계 의 ASC의 수확하는 동안, 중요한 단계는 콜라겐과 지방의 적절한 소화합니다. 부적절한 소화의 ASC의 낮은 수율 발생합니다. BMPR-IB + 세포를 FACS 정렬 동안 신중 양성하는 게이트를 정의하는 것이 중요하다. 너무 느슨하게 게이트를 정의하는 것은 순수하지 정렬 인구의 원인이 될 수 있습니다. 두개골 결함의 생성 동안, 두개골의 뼈를 통해 결함을 드...

손상, 감염 또는 경부암 인한 주요 골 결손 환자의 회복 및 삶의 질에 큰 영향을 미친다. 다른 기술은 환자의 몸으로부터 뼈 건강 이러한 결함을 채우기 위해 존재하지만,이 이동은 자체 이환율과 합병증 1, 2, 3의 위험도를 전달한다. 또한, 일부 결함이 충분한 기증자 뼈 결함을 채우기 위해 사용할 수없는 너무 크거나 복잡하다. 보철 장치는 뼈 결함을 작성을위한 잠재적 인 옵션이 있지만 이러한 감염 위험, 하드웨어 오류 및 이물 반응 (4) 등 여러 가지 단점과 연결되어 있습니다. 이 때문에, 환자 자신의 세포를 이용한 생물학적 5 골 대체재 공학 가능성에 관심이있다. 지방 유래 기질 세포 (의 ASC)이들은 환자 자신의 지방 조직에서 풍부하게 가능하고 새로운 뼈 조직 (6, 7)를 생성하여 뼈의 결함을 치유 할 수있는 능력을 입증하기 때문에이 애플리케이션에 대한 가능성을 갖는다. 세포의 ASC는 여러 다양한 연구 집단은 특정 세포 표면 마커에 대한 선택하는 향상된 골 형성 활성 (8, 9)와 세포 집단을 생산할 수 있음을 보여 주었다이다. 가장 조골 전위의 ASC를 선택하면 이들 세포 시드 발판 큰 골 결손을 재생할 수있는 가능성을 증가시킬 것이다. 뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 시그널링은 골 형성 분화의 ASC (10) 및 (11)에서 골 형성에 중요한 것으로 알려진 BMP 수용체 타입 IB (BMPR-IB)를 조절하는 매우 중요하다. 최근에, 우리는 수 b BMPR-IB의 표현을 보여 주었다전자는 강화 된 골 형성 활동 (12)의 ASC를 위해 선택하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 생체 내 두개골 결손 모델을 사용하여 골 형성 활동의 분석 뒤에 인간 지방에서의 ASC를 BMPR이-IB가 발현의 분리를위한 프로토콜을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>100 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 blade scalpel</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon nylon suture, 18&quot;, P-3 needle,&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB primary antibody</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>BioGel PI surgical gloves</td><td>M&amp;ouml;lnlycke Health Care</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo needle driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 nude mouse</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Drill: Circular knife 4.0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Drill: Z500 Brushless Micromotor</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Absorbent Underpads, 20&quot; x 24&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4&quot; x 4&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS medium</td><td>GE&amp;nbsp; Life Sciences</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isoflurane</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forceps with teeth</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forceps with teeth</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PLGA scaffolds</td><td>Proprietary Formulation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, 10%</td><td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Polylined Sterile Field, 18&quot; x 24&quot;</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>696</td><td>Cut a rectangular hole of the appropriate size</td></tr><tr><td>Polysucrose Solution: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine Prep Solution</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol alcohol prep swabs</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid isolation of bmpr-ib+ adipose-derived stromal cells for use in a calvarial defect healing model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

마이크로 CT 명확하게 두개골 결함을 보여줍니다 수술 당일에 이루어 스캔. 이 때 4mm 결함에 더 증식가 없을 것입니다. 후속 검사는 기준에 비하여 시간 경과에 따른 결함의 크기를 정량화하는 시간에 걸쳐 얻어진다. BMPR-IB-및 정렬되지 않은 세포 (그림 5)과 비교했을 때 BMPR-IB + 세포와 시드 결함은 결함의보다 신속한 폐쇄를 입증해야한다. 또한, 결함을 포함 ?...

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Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K 조회수.  Stanford University School of Medicine. Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

생체공학

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. Adipose-derived stromal cells (ASCs) have proven to be an abundant source of multipotent stem cells capable of undergoing osteogenic, chondrogenic, adipogenic, and myogenic differentiation. Many studies have explored the osteogenic potential of these cells in vivo with the use of various scaffolding biomaterials for cellular delivery. It has been demonstrated that by utilizing an osteoconductive, hydroxyapatite-coated poly(lactic-co-glycolic acid) (HA-PLGA) scaffold seeded with ASCs, a critical-sized calvarial defect, a defect that is defined by its inability to undergo spontaneous healing over the lifetime of the animal, can be effectively show robust osseous regeneration. This in vivo model demonstrates the basis of translational approaches aimed to regenerate the bone tissue - the cellular component and biological matrix. This method serves as a model for the ultimate clinical application of a progenitor cell towards the repair of a specific tissue defect.

This protocol describes the isolation of adipose-derived stromal cells from lipoaspirate and the creation of a 4 mm critical-sized calvarial defect to evaluate skeletal regeneration.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

의학

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous high-quality cells for experimental requirements. mBMSCs could be widely used in therapeutic applications as tissue engineering cells in case of craniofacial diseases and cranio-maxillofacial regeneration in the future due to the excellent self-renewal ability and multi-lineage differentiation potential. Therefore, it is important to obtain mBMSCs in large numbers.
In this study, bone marrow was flushed from the mandible and primary mBMSCs were isolated through whole bone marrow adherent cultivation. Furthermore, CD29+CD90+CD45&#8722; mBMSCs were purified through fluorescent cell sorting. The second generation of purified mBMSCs were used for further study and displayed potential in differentiating into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Utilizing this in vitro model, one can obtain a high number of proliferative mBMSCs, which may facilitate the study of the biological characteristics, the subsequent reaction to the microenvironment, and other applications of mBMSCs.

This article presents a method that combines whole bone marrow adherence and flow cytometry sorting for isolating, cultivating, sorting, and identifying bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandibles.

쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

<meta charset="utf8"></head><body>재생 연구를 위한 Rat Calvarial Suture-Bony Defect 모델 표준화

The Establishment of Calvarial Suture-Bony Composite Defects in Rats: A Standardized Model for Suture-Regenerative Therapy Investigation

Large-scale calvarial defects often coincide with cranial suture disruption, leading to impairments in calvarial defect restoration and skull development (the latter occurs in the developing cranium). However, the lack of a standardized model hinders progress in investigating suture-regenerative therapies and poses challenges for conducting comparative analyses across distinct studies. To address this issue, the current protocol describes the detailed modeling process of calvarial suture-bony composite defects in rats.
The model was generated by drilling full-thickness rectangular holes measuring 4.5 mm &#215; 2 mm across the coronal sutures. The rats were euthanized, and the cranium samples were harvested postoperatively at day 0, week 2, week 6, and week 12. &#181;CT results from samples collected immediately post-surgery confirmed the successful establishment of the suture-bony composite defect, involving the removal of the coronal suture and the adjacent bone tissues.
Data from the 6th and 12th postoperative weeks demonstrated a natural healing tendency for the defect to close. Histological staining further validated this trend by showing increased mineralized fibers and new bone at the defect center. These findings indicate progressive suture fusion over time following calvarial defects, underscoring the significance of therapeutic interventions for suture regeneration. We anticipate that this protocol will facilitate the development of suture-regenerative therapies, offering fresh insights into the functional restoration of calvarial defects and reducing adverse outcomes associated with suture loss.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Calvarial Suture-Bony Composite Defect에 대한 표준화된 Rat 모델의 개발 및 평가

We describe the detailed surgical procedures of calvarial suture-bony composite defects in rats, alongside the investigations into the short-term and long-term prognoses of the model. We aim to construct a standardized model for developing suture-regenerative therapies.

쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함의 확립: 봉합사-재생 치료 조사를 위한 표준화된 모델

Large-scale calvarial defects often coincide with cranial suture disruption, leading to impairments in calvarial defect restoration and skull development ...

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

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뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함의 확립: 봉합사-재생 치료 조사를 위한 표준화된 모델

쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함의 확립: 봉합사-재생 치료 조사를 위한 표준화된 모델

쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함의 확립: 봉합사-재생 치료 조사를 위한 표준화된 모델