Name: a method for measuring metabolism in sorted subpopulations of complex cell communities using stable isotope tracing
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
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The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. 대사 추출 <ol><li> 접시에서 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 영양 보충제 (혈청 또는 다른 성장 보조제)에서 삼중의 6 웰 플레이트에서 배양 세포는 세포는 75 %의 합류가 될 때까지. 주 : U- 13 C 40 % 글루코스를 함유하는 RPMI에서 48 시간 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 및 5 % 투석 된 FBS (태아 소 혈청)은 여기 HeLa 세포 배양. 투석 FBS는 레이블이 미디어를 오염시킬 수있는 작은 분자량 대사 물질을 제거하는 데 사용됩니다. 실제 실험 이전에 투석 보충에 세포를 배양하는 세포가 배지에서 정상적으로 성장하고 확인하는 것이 좋습니다. 보충 밤새 뱀 피부 투석 튜브를 사용하여 0.15 M NaCl 용액에서 투석된다. </li><li> 추출 폐기 문화 매체의 날에, 500 μL 차가운 HBSS로 두 번 우물을 씻어 후 폐기합니다. 참고 : 여기에 HBSS 40 %를 포함하는 사용 U-13 C 글루코스가 배양 배지에도 때문이다. </li><li> 추가 600 μL의 100 % 메탄올을 드라이 아이스에 미리 냉각시켰다. </li><li> 얼음을 건조 세포 스크레이퍼와 세포 물질을 제거 할 수있는 요리를 전송합니다. </li><li> 조심 질량 분광 분석까지 -80 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 세포 추출물 피펫. </li></ol></li><li> 모의 분류 세포의 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 주 : 100mm 접시에 48 시간 동안 배양 여기 HeLa 세포 세포의 높은 번호 (~ 4 × 106)은 50 정렬 세포를 얻기 위해 필요하기 때문이다. 헬라 세포 추출물이 숫자는 대사 산물의 좋은 측정을 받아야했다. 사용되는 배양 배지는 40 % RPMI는 U- 13 C 글루코스 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 투석 FBS, 5 %를 함유 하였다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, w 우물을 씻어i 번째 1.5 mL의 따뜻한 HBSS 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 정렬 만 단봉들에 대한 셀 소터 게이팅을 통해 세포, 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에 원심 분리기 분류 세포. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 헬라 세포는 크고 그래서 그들은 가능한 한 그대로 펠렛을 얻기 위해 느린 이벤트 속도와 큰 노즐로 분류되어야한다. throughou 감기 블록 세포 유지t은 신진 대사를 감소 정렬. 정렬 절차의 철저한 설명은 이전 12 설명한다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출하여 액체 크로마토 그래피 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지 - 고해상도 질량 분석 (LC-HRMS) 분석. </li></ol></li><li> 세포주기의 추출 세포 정렬 <ol><li> 문화 미디어 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 참고 : Geminin Fucci 녹색 G1 (음)과 SG2M (양의) 세포로 정렬 할 수 있습니다 (MAG1-hGem) 탐침 (13)를 포함하는 다음 문화 HeLa 세포. 세포는 안정 동위 원소 추적 미디어에서 배양 될 수있다필요에 따라 긴이야. 여기에 우리가 레이블이없는 미디어에서 46 시간 동안을 배양 한 후, 우리는 RPMI 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- (13) C를 함유로 전환 한 15 N2 - 글루타민 2 시간 전에 정렬 시작. 이것은 짧은 펄스 라벨링 필요한 세포주기 단계를 연구 할 수 있도록하기 위해 수행되었다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, 1.5 mL의 따뜻한 HBSS와 우물을 씻어 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀 소터 g을 통해 정렬 세포다음, 파편과 이중선을 ating 관심의 세포 마커에 대한 게이팅, 원심 분리기 분류 세포를 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 신진 대사 속도를 감소 정렬을 통해 차가운 ​​블록 세포를 유지합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출 및 LC-HRMS 분석 할 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 질량 분석 분석 참고 : 여기에 우리가 LC-HRMS 시스템에서 세포 추출물을 분석하기위한 프로토콜을 설명합니다. 세포 추출물의 분석에 대한 대사 체학 방법이 사용될 수있다. 전체 검사분석은 대사 산물의 다양한 검출에 유용 할 수있다. <ol><li> 질량 분석 참조 교정 믹스를 사용하여 기기를 보정합니다. </li><li> 15 초 30 분, 소용돌이 얼음에 해동 세포 추출물. </li><li> 4 ℃에서 13,000 × g으로 10 분 동안 스핀 필터 및 원심 분리하여 세포 추출물 100 ㎕를 옮긴다. </li><li> 액정-HRMS 시스템에 여액 12.5 μL를 주입한다. </li><li> (ZIC-HILIC) 칼럼 (150mm X 4.6 mm, 5 ㎛의 입자 크기) 양쪽이 온성 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피를 이용하여 분리 된 대사 물질 0.1 % 포름산 구배 용출을 이용하여 ZIC-HILIC 가드 컬럼 (20mm mm 2.1 ×) 장착 물에 산 (용매 A) 및 아세토 니트릴 (용매 B). 용매 (A)의 20 % 구배 용출를 시작하고 17 분에서 80 %까지 증가한다. 각각 최소 400 μL의 흐름 -1 컬럼 온도 및 샘플 트레이 23 ° C에서 4 ° C와 4 분 동안이 비율을 유지한다. </li><li> 는 I를 사용하여대사 검출 이온화 소스로서 포지티브 및 네거티브 모드 모두에서 가열 된 전기 분무 (H-ESI II) 및 70,000 전폭 반치 (FWHM)의 질량 분해능의 전체 검사를 획득 모드의 크로마토 그래피 분리에 결합 nstrument ( m / z 200). </li><li> 플로우 (45)의 속도와 350 ° C에서 10 노소 (임의의 단위) 및 설정 증발기 온도와 긍정적 인 모드와 -3.5 kV의 4 kV로에서의 전기 분무 전압에서 시스 가스 및 보조 가스 질소 (순도&gt; 99.995 %)를 사용하여 부정적인 모드입니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 표준이 가능하며 샘플에서 좋은 품질의 피크를 표시하는 대사 산물의 번호를 선택합니다. 양질의 피크 대 잡음비가 높은 신호. 최고 품질을 확인하고 거짓 동위 원소를 포함하지 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 모양 및 / 또는 체류 시간이 다른 동위 원소 피크 가능성이 false입니다. </li><li> 동위 원소 표지 샘플 (질량 동위 원소를 계산을 위해MI) 모든 잘못의 총 피크 면적과 각 MI의 피크 면적을 나누어 분수. </li><li> 로 각각 13 C, 15 N의 농축을 표지 탄소 / 질소 분수를 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> 여기서 n은 대사 산물의 탄소의 총 수 (또는 질소 각각은)이며, 혼합 x의 MI 분율이다. 주 : 모든 계산은 프로그래밍 언어를 사용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리의 방법은 세포의 대사에서의 MID는 세포 대사 활동의 &quot;히스토리&quot;를 반영한다는 원리에 기초한다. 이것은 그들이 이전 셀 정렬 절차 세포의 복잡한 지역에서 발생으로 가능 세포의 하위 집단에서 대사 활동을 조사 할 수있다. 반면, 대사 산물의 피크 지역 분류 세포와 배양 접시 (11)에서 직접 추출 추출 사이에 현저하게 다르다. 일부 다른 화학 성분은 질량 분석, 소위 ...

고등 생물은 더 복잡한 기능에 대해 가지고 협력 별개의 세포 유형의 복잡한 사회를 포함한다. 예를 들어, 종양은 단지 암세포 만, 섬유 아세포, 혈관을 구성하고, 주로 면역 세포가 침투 한 세포를 포함하고; 혈액은 면역 세포 아형 2의 수십의 복잡한 혼합물을 포함, 심지어 배양 세포주는 내강 및 유방암 세포 (3)의 기부 아형 여러 개체군, 구성 될 수있다. 대사 &quot;협력&quot;을 나타낼 수있다 공존 또한, 서로 다른 세포 유형. 예를 들어, 뇌, 성상이 기판 (4)을 산화 한 후 뉴런 &quot;공급&quot;인 락트산 포도당 변환 생각된다; T 림프구는 시스테인 (5)의 소스로 인접 수지상 세포에 의존하는 일부 경우에; 암 세포는 asso과 협력 할 수있다종양 6 ciated 섬유 아세포. 이러한 시스템의 대사 동작을 이해하기 위해서는 본 분리하고 다양한 종류의 세포 대사 활동을 측정하는 것이 필수적이다. 지금까지 세포 유형을 분리하기위한 가장 널리 사용되는 방법은 형광 활성화 세포 분류이다. 이 방법은 세포 유형 또는 관심 상태는 형광 항체, 조작 된 형광 단백질의 발현 또는 다른 염료를 사용하여 &quot;표지&quot;가 제공 될 수 넓게 적용 가능하다. 하나의 옵션은 셀 소터 통해 초기 개별 세포 유형, 다시 배양 얻어진 각 세포 유형이다하고이 배양 물 (7)의 대사 과정을 수행한다. 세포 유형 또는 표현형은 배양 조건에 안정하며, 이러한 세포주기 상태 않으며 공동 배양 물에서 대사 협력으로 과도 행동을 캡처 할 수없는 경우,이 경우에만 가능하다. 이러한 경우를 들어, 신진 대사가 너무 직접 측정해야rted 세포. 이 절차를 선별 세포 신진 대사 8 왜곡 될 응력 세포 주제 때문에 도전이며, 우리는이 방법 (9) (10)를 가지고 단지 약간의 연구 알고있다. 특히, 절대 대사 풍부 측정이 더 이상 신뢰성있게 아미노산 등 주요 대사 산물은 세포 정렬 버퍼에 보관 세포로부터 누출하지 않을 수 있음을 발견 하였다 (11) (정렬 된 분획의 상대 비교가 여전히 유용 할 수 있음). 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 정렬하기 전에 안정 동위 원소와 셀 라벨, 및 세포 대사보다는 대사 산물 존재비에서의 MID에 초점을 맞 춥니 다. MID를 길게 시간 규모 상에 형성되기 때문에, 그들은 적은 정렬 조건에 단기간 노출에 의해 영향을받을 것이다. 우리는 DA를 제공하기에 충분히 민감 전체 스캔 고분해능 질량 분석법을 이용하여 MID를 정량화셀 정렬 시간의 약 30 ~ 60 분을 필요로하는 약 50 만 분류 세포에서 시작 대사 산물의 수백에 따. 배양 접시가 관찰 된 MID는 원래 배양 대표적되도록 이루어진다에서의 비교를 직접 제어 (특정 인구 게이팅없이 셀 소터 구 통과 세포) 및 대사 추출 &quot;모의 정렬&quot;. 안정 동위 원소 추적자의 선택에 따라 다양한 대사 경로는이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-Glucose</td><td>Cambridge isotopes</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N2-Glutamine</td><td>Cambridge isotopes</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (JT Baker), HPLC grade</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3,000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6&amp;nbsp;mm, 5 &amp;micro;m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Produced with a Milli-Q Gradient system</td></tr><tr><td>Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Calibration kit</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&amp;nbsp;</td><td>Wolfram Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method for measuring metabolism in sorted subpopulations of complex cell communities using stable isotope tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

일례로서, 우리가 세포주기의 단계에 따라 정렬 HeLa 세포의 신진 대사를 조사하는 실험을 기술한다. 모두 탄소와 질소에 중앙 대사의 다양한 레이블을 지정하려면, 우리는 U- (13) C-포도당과 U-13 C, 추적자로 15 N 글루타민을 사용하여 48 시간 동안 세포를 배양. 동위 원소의 중간 수준보다 다양한 MI 패턴 (14)을 생성하는 경향이 검증 ...

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

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Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

연구

생화학

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

생체공학

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

생물학

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

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대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

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