Name: analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

이 연구는 생물학 연구 우수성 [허가 번호 1P20GM109005, 국립 항공 우주국 [부여 번호 NNX15AK32A]를 통해 아칸소 공간 부여 컨소시엄의 건강 센터의 국립 연구소 및 산업 안전에 대한 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원 건강 (NIOSH) 인증 번호 2T420H008436]. 저자는 교정이 원고를 편집 크리스토퍼 Fettes에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 입자 수집 및 준비 <ol><li> 높은 볼륨의 총 부유 입자 샘플러의 교정 <ol><li> 질량 유량 제어기에서 샘플러 모터를 분리하고 안정적인 AC 전원 (그림 1)에 모터를 연결합니다. 참고 : 필터는이 절차를 수행하는 동안 사용되지 않습니다. </li><li> 샘플러에 교정기 오리피스와 상단 로딩 어댑터 플레이트를 탑재합니다. 공기 누출이 존재하지 않도록 안전하게 가기 로딩 어댑터 홀드 다운 너트를 조입니다. 샘플러 모터가 정상 작동 온도 (약 10 ~ 15 분)을 따뜻하게 할 수 있습니다. </li><li> 손으로 구멍에 오리피스와 압력 탭의 상단에 구멍을 덮어 누출 검사를 실시한다. 공기를 탈출 만든 고음 ㅎ ㅎ 사운드를들을 수 있습니다. 이 소리가 들리는 경우 누수가 존재로, 상단로드 어댑터 홀드 다운 너트를 다시 조입니다. 소리가 작 으면 누설은 SYS의 다른 가스켓 중 하나 근처TEM. </li><li> 고무 진공 튜브 오리피스의 측면에 압력 탭에 물 압력계의 한 쪽을 연결합니다. 대기 개방 압력계의 반대쪽을 둡니다. 정확한 판독을 보장하기 위해 수직으로 압력계를 잡으십시오. 연속 흐름 레코더의 뒷면을 탭하면 펜의 중심과 정확한 판독을 제공하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 단계를 반복 / 분 (약 매 5~6피트 3 / 분) 30 내지 60 피트의 작동 유량을 나타내는 다섯 유량을 사용 1.1.2. 다섯 가지 위치로 가변 오리피스에 손잡이를 조정하고 다섯 가지 측정 값을. </li><li> 인증 최종 날짜, 날짜, 사이트 위치, 교정 판에 오퍼레이터의 이니셜 대기 온도, 주위 대기압, 샘플러 일련 번호, 일련 번호 오리피스, 오리피스의 기울기와 절편을 기록한다. </li></ol></li><li> 총 부유 입자 샘플 수집 및 중량 측정 분석 <ol><li> 랩알루미늄 호일의 두 개의 층에있는 8 &quot;× 10&quot;석영 섬유 필터. 노에 싸여 필터를 놓고 550 ° C의 온도를 설정합니다. 적어도 4 시간 동안 필터를 굽는다. 노 멋진하자 필터를 검색 할 수 있습니다. CaCO3를 함께 데시 케이 터에서 필터를 놓습니다. </li><li> 10 μg의 정밀도와 마이크로 저울에 필터를 달아. 하루 동안 측정을 세 번 반복합니다. 개별 측정은 25 μg의이어야한다. 이것이 실현되지 않으면, 데시 케이 터에 싸서 필터를 리턴하고, 처리를 다음과 같은 일을 반복한다. </li><li> 대피소 덮개 (그림 2)를 엽니 다. 네 개의 날개 너트를 풀어 황동 볼트와 와셔가 길에서 다운 스윙을 할 수 있도록하여 필터 홀더 프레임을 제거합니다. 지원 화면에서 거친면이 위로, 알루미늄 호일에서 필터를 전개하고 신중하게 중심을 청소 집게를 사용합니다. 제대로 화면에 필터를 맞 춥니 다. </li><li> 화면의 프레임을 놓고 함께 고정충분한 압력을가하면서 황동 볼트와 와셔 가장자리에 공기 누출을 방지 할 수 있습니다. 깨끗한 천으로 필터 홀더 주위에서 먼지 축적을 닦습니다. 닫기 쉼터 뚜껑을 조심스럽게 고정합니다. </li><li> 확인 모든 코드는 해당 콘센트 소켓에 연결되어 있고 송풍기 모터 압력 탭과 연속적인 흐름 레코더 사이의 배관이 연결되어 있습니다. </li><li> 흐름 레코더를 준비합니다. 펜 포인트를 올리고 새 차트를 삽입 펜 암 리프터를 우울. 레코더의 드라이브 허브 차트의 탭을 맞추고 허브에 차트 센터를 낮추기 위해 엄지 손가락으로 누르십시오. 차트에서 올바른 시간이 시간 인덱스 포인터와 정렬 될 때까지 드라이브 허브를 시계 방향으로 회전하여 시간을 설정합니다. </li><li> 수동 샘플러에 전환 컬렉션을 시작합니다. 제대로 잉킹하고 경과 시간 표시가 올바르게 작동 확실하게 확인하기 위해 레코더를 모니터링합니다. </li><li> 샘플링주기의 끝에서, 샘플러, 레코드를 끄시간이 경과 차트를 검색 할 수 있습니다. 필터를 노출 할 수있는 프레임을 제거합니다. 포셉과 끝에서 부드럽게 잡고지지 화면에서 노출 된 필터를 제거합니다. 그 샘플이 두 번 샘플에 닿을 수 있도록 길이 필터를 접어 원래의 알루미늄 호일에 포장. </li><li> 이전 무게에 최소 24 시간 동안의 CaCO3와 데시 케이 터에서 필터를 저장합니다. 단계를 반복 1.2.2 샘플링 후 필터의 무게를 측정합니다. 지퍼 비닐 봉투에 필터를 놓고 분석 할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 수집 된 총 부유 입자 샘플 분석 <ol><li> 저장된 검색 필터를 알루미늄 포일을 전개하고 깨끗한 표면에 테플론 필터를 옮긴다. 집게와 메스를 사용하여 필터의 외부 (흰색) 부분을 잘라 폐기하십시오. <ol><li> 이어서, 100 mL의 플라스크에서, 0.5 &quot;X 0.5&quot;조각 조각 장소에서 필터를 잘라. 초순수 50 ㎖를 추가합니다. 초음파에 플라스크를 배치욕조와 33 ± 3 kHz에서 60 분 동안 초음파 처리. </li></ol></li><li> 100㎖의 환저 플라스크에 0.45 ㎛의 폴리 프로필렌 시린지 필터를 통해 여과 추출물. 추출물의 대략 5 ㎖까지 50 ℃에서 감압하에 로타 뱁 기기를 이용하여 물을 증발 플라스크에 남아있다. <ol><li> 공지 된 중량의 15 mL의 배 모양 플라스크에 잔여 물을 증발시켰다. 건조 추출물 플라스크의 무게를 측정하고 건조 추출물의 질량을 기록한다. </li></ol></li><li> 15 분 동안 초음파 처리에 의해 D 2 O의 400 μL와 건조 시료를 용해하고 5mm 표준 NMR 튜브에 전송할 수 있습니다. 어떤 용해되지 않은 물질을 제거 실온에서 12,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> O.이 NaN 3 1.4 %의 10 μL (최종 진한 : w 0.02 % / V)를 NMR 튜브에 추가 D 2의 300 μL로 반복합니다. NMR 튜브 D 2 O (최종 농도 0.258 밀리미터)로 총 부유 입자 (TSP) -d4 (3.2 ㎎ / ㎖)의 10 μL (32 μg의)를 추가합니다. </li><li>600.17 MHz에서 작동하는 NMR 분광계를 사용하여 1 H NMR 스펙트럼을 획득. <ol><li> 트리플 공명 저온 탐침에 NMR 튜브를 삽입합니다. 다음 순서에 따라 악기를 보정 : 자물쇠, 조정, 심, 90 ° 펄스 길이 보정 및 수신기 이득을 조정한다. </li><li> 디지털 쿼드 검출 모드에서 180 물 선택적 펄스, 8192 스캔, 4 더미 스캔, 8012.57 Hz에서의 스윕 폭을 사용하여 1 D 여기 조각 시퀀스와 25 ° C에서 스펙트럼을 측정, 주파수는 4.70 ppm으로 설정 물 신호 억제, 1.70 오프셋 (offset) 초의 획득 시간, 32,768 시간 영역 데이터 포인트 (TD), 1 밀리 초 시간 구배 (P16) 구배 (D16) 100 마이크로 초 후 복귀 지연. </li></ol></li><li> 공정 1이 (65, 536 데이터 포인트)의 계수를 1 Hz에서 제로 충진 라인 넓어짐을인가하여 H NMR 스펙트럼. 수동 위상과 기준을 수정하고 통합 할 수 있습니다. 0.0 ppm으로 TSP-D4 피크를 설정합니다. </li></ol></li></ol> 2. 입자 노출<ol><li> 문화 설정 <ol><li> (37 ℃), 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 (100 U / ㎖) 0.25 % 트립신 용액 및 칼슘 마그네슘없는 인산 완충 식염수 수욕 (PBS)를 함유 따뜻한 완전한 성장 매체 문화 개시하기 전에 적어도 30 분. </li><li> 배양 된 RAW264.7 세포를 포함하는 5 % CO 2 배양기에서 T75 플라스크를 꺼내 미리 예열 PBS 두 번 2 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 스크래핑이어서 예열 트립신 용액 1 ㎖를 사용하여 조직 배양 용기의 바닥으로부터 점착 RAW264.7 세포시키다. </li><li> 조직 배양 용기로부터 세포를 수집하고 피펫 팅을 반복하여 단일 세포 현탁액을 만든다. 예열이 완료 매체를 100mm 조직 배양 접시에 8000 / cm 2 (총 50 세포)의 밀도로 트리 판 블루 플레이트 세포의 수를 계산. 50,000 세포의 최종 농도가 10 mL의 미디어 볼륨을 조절ml의 당. 주 : DNA 메틸화 분석도 수행되는 경우 플레이트의 수를 두배. </li><li> 37 ℃에서 다시 5 % CO2 인큐베이터에서 새로 도금 RAW264.7 세포를 넣고 24 시간 동안 부착 할 수있다. </li><li> 또한 바이오 캐비닛 여과 입자를 재현 탁. 예를 들어, 5 μg의 / ㎖ 처리 용량 멸균 PBS에서 0.5 ㎎ / ㎖의 농도로 희석 입자 5 밀리그램 / A를 50㎍ / ㎖의 치료 투여 용 용액에. 희석 미리 개월까지 준비하고 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 입자상 물질로 처리하고 <ol><li> 5 % CO 2 배양기에서 세포를 가지고 세포 성장, 세포 형태, 배양 조건 및 오염 거꾸로 현미경을 사용하여 10 배 배율에서 확인합니다. 하나는이 단계에서 적어도 30 % 융합 세포를 가질 것으로 기대한다. </li><li> 무균는 멸균 피펫을 사용하여 미디어를 흡인하고 2 ml의 37 ° C PBS로 배양 용기를 씻고두 배는 완전히 미디어 및 부동 또는 죽은 세포를 제거합니다. </li><li> 배양 용기에 신선한 매체와 입자상 물질의 미리 결정된 투여 량을 첨가하고 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 소정 시간 동안 배양한다. 본 연구에서는 동시 유전 독성 및 epigenotoxic 분석에 사용되는 노광 병렬 72 시간 동안 PM에 RAW264.7 세포를 처리한다. 주 : 세포 독성 부정적인 염색체 분석의 질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 세포 독성, DNA 메틸화, 웨스턴 블 롯팅 또는 유전자 발현 분석과 같은 추가의 분석은 일반적으로 처리 된 세포에서 수행된다. 설명 된 바와 같이 세포를 노출하고 원하는 특정 분석을 진행합니다. 경험이없는 사용자는 CA를 감지 할 수있는 능력을 테스트하는 메틸 메테 인설 등의 긍정적 인 컨트롤을 포함 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 유전 학적 분석 <ol><li> 치료는 중기에서 세포를 체포하기 <ol><li> 그래서 colcemid을 따뜻하게lution 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조 (10 μg의 / ㎖). 오염의 위험을 최소화하기 위해 바이오 캐비닛하에 70 % 알코올로 뚜껑을 닦아 </li><li> 완전 무균 미디어를 제거하고 2 ml의 사전 예열 PBS 2 회 문화 혈관을 씻는다. </li><li> 미리 예열 신선한 매체를 추가 (2 ml의 미디어 / 10 6 세포) 배양 용기에 colcemid 용액 (5 μL / ㎖)를 포함하고 2 시간 동안 품어. </li></ol></li><li> 셀 수확 <ol><li> 수욕에서 따뜻한 트립신 PBS 용액을 30 분 동안 37 ℃에서 유지 하였다. 이후,이 단계에서 무균 상태를 유지할 필요가 없다. </li><li> 완전히 두 번 2 ml를 37 ° C PBS와 문화 용기를 씻어 미디어를 제거 미리 예열 트립신 용액 필요한 볼륨을 추가 (보통 60mm 배양 접시 또는 T25 플라스크 2 mL 및 100mm 접시 또는 T75 플라스크 4 ml의 ) 1 분 동안 37 ℃에서 다시 5 % CO2 인큐베이터에서 배양 용기를 배치했다. </li><li> 탁E 밖으로 배양 용기, 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리하고, 트립신 동작을 중지하는 PBS 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 피펫은 위아래로 적어도 10 시간은 15 ML 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 단일 세포 현탁액 및 전송 세포를 확인합니다. </li><li> 실온에서 아웃 스윙 원심 분리기에서 5 분 400 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. </li><li> , 상층 액을 제거 부드러운 터치하여 세포 펠렛을 휴식, PBS 10 ㎖를 추가하고, 다시 다섯 분 동안 원심 분리. </li></ol></li><li> 저장성 처리 및 고정 <ol><li> 적어도 30 분 동안 37 ° C의 물을 수 욕에서 예열 따뜻한 0.075 M 염화칼륨 용액. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 PBS의 약 0.5 ml를 둡니다. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 중단하고, P200 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을합니다. </li><li> 부드러운 흔들림과 드롭에 의해 미리 예열 염화칼륨 용액 방울의 4 ML을 추가합니다. </li><li> 저장성 페이지에서 세포를 품어20 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 otassium 염화 솔루션입니다. </li><li> 1 액형 빙초산 3 부를 메탄올을 첨가하여 신선한 acetomethanol 용액을 만든다. 실온에서이 갓 준비 정착액을 유지합니다. </li><li> 저장성 처리 후, 튜브에 정착 동량 (4 ml)에 추가로 조심스럽게 튜브를 반전시켜 용액을 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 이 단계의 세포 펠렛의 크기가 증가에서 희끄무레 더 볼 수있게. </li><li> 상층 액을 제거를 4 ml의 신선한 고정액을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 유지한다. </li><li> 5 분 400 XG에 원심 분리기, 뜨는을 제거하고, 4 ml의 정착액 두 더 세척을 제공합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 청소 및 중기 확산 준비 <ol><li> 30 분 동안 완전히 10 % 액체 세제 유리 슬라이드를 담가. </li><li> 30 분 동안 차가운 흐르는 수돗물에 철저하게 슬라이드를 씻어. </li><li> 린SE는 완전히 제거 세제를 증류수에 담가 및 나중에 사용하기 위해 냉장 보관 증류수로 3 회 슬라이드. 참고 : 사용 확산의 균일 성을 용이하게하고 중기 품질을 향상하기 전에 슬라이드를 청소합니다. </li><li> 냉장 젖은 슬라이드에 10 ㎕의 세포 현탁액을 드롭하고 실온에서 건조 하룻밤을 방송 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 염색 및 설치 <ol><li> PBS의 한 부분으로 김사 얼룩 솔루션의 한 부분을 혼합하여 50 ㎖ 김사 염색 액을 준비하고 코 플린 항아리에 붓는다. </li><li> 20 분 동안 염색 액에 담가 슬라이드. </li><li> 헤어 드라이어를 사용하여 슬라이드를 초과 얼룩을 제거하고 즉시 건조 증류수에 슬라이드를 씻어. </li><li> 하룻밤 실온에서 슬라이드를 둡니다. </li><li> 슬라이드에 매체를 장착 한 방울을 적용, 부드럽게, 설치 매체에 커버 슬립을 배치 매체가 천천히 슬라이드에 걸쳐 수 있도록, 제거종이 수건을 초과 매체. 마운트 된 슬라이드 전에 이동하거나 커버 슬립의 이동을 방지하기 위해 현미경으로 볼 적어도 1 시간 동안 건조하도록 허용합니다. 주의 :이 단계에서 모든 거품을 형성하지 않고 신중하게 커버 슬립을 배치하는 것이 중요하다. 거품을 제거하는 과도한 열을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 현미경 관찰과 수차 유형 <ol><li> 중기 좋은 품질의 밝은 필드 현미경을 이용하여 100 배의 배율로 확산의 구조 CA를 검사합니다. </li><li> (100) 중기가있는 CA의 큰 숫자를 유도 치료에 대한 각 치료 그룹에 확산 적어도 50 점수. 작은 효과 크기의 경우, 최대 300 중기 스프레드의 분석 좋습니다. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing,+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O,+12+C+and+7+Li.">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li><li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols:+a+review.">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세포 유전 학적 연구 또는 번호 또는 주로 중기 스프레드 염색체의 구조의 현미경 분석, 각종 질병에 대한 예후, 위험 평가, 치료에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 지금 세포 유전 학적 이상이 암 등 여러 질병의 진행 및 개발과 연결되어 있음을 잘 설정됩니다. 현재까지, CA는 모든 주요 종양 유형에서 발견되었다. 유전 학적 변화 (16)의 다양한 형태를 유도 할 수있는 주요 외부의 위험 인...

입자상 물질 (PM)에 대한 노출은 주로 심폐 질환과 폐암 1에서 매년 3 백만 초과 사망, 원인 것으로 추정되고있다. 오후에 노출 수준을 증가 폐암의 위험이 증가 2에 도시 된 바와 같이 실제로, 오후, 암 연구를위한 국제기구 (그룹 1)에 의해 인간에게 발암 물질로 인식되었다. 흥미롭게도, 거의 모든 암세포 수치 및 / 또는 구조 염색체 이상 항구. 미립자 유기 탄소는 조성 및 크기 분포 배출뿐만 아니라 물리적, 화학적 변형에 따라 변형, 복잡한 이기종 혼합물이다. 그것은 35-55 (크기 PM 2.5 μm의 작은) 도시 PM 2.5 질량 %와 농촌 대륙 배경 PM 2.5 질량 3, 4의 60 % 이상에서 차지하고있다. 수용성 분획은 유기 에어로졸의 30-90%를 차지한다. 유기 화합물의 대다수지방족 탄화수소, 다환 방향족 탄화수소, 및 산소 및 니트로 유도체, 지방족 알데히드 및 ​​알콜, 유리 지방산 및 그 염, 디 - 카르 복실 산, 다작 용성 화합물, 단백질, 및 부식과 같은 거대 분자 (HULIS) 사용을 포함하여 식별 된 질량 분석 기술 5-8 결합 크로마토 그래피 방법. 따라서 이들 화합물은 유기 탄소의 대부분은 9 불명 미립자 유기 탄소 미만 ~ 20 %를 나타낸다. 실험적 증거는 세포 독성, 산화 스트레스, 염증이 PM 관련된 병적 상태의 발전에 관여하는 것을 시사한다. 또한 최근 그러나, PM 해당 노출 시험 관내 시스템에서 인간 피험자 10-12 모두 실험에서, 반복 요소의 DNA 메틸화의 변화를 포함 후성 변경하는 다수의 결과 밝혀졌다. 특히 관심의 효과가있다메이저와 마이너 위성 - - 염색체의 센트로 주변의 염색질 지역에서 발견되는 위성 DNA에 오후. 그것은 그들이 노출 (12) 후 최소 72 시간 동안 감지 할 수있는 이러한 효과는 자연에 의해 지속 할 수 있음을 보였다. 특히 중심절 주위 DNA 메틸화의 변화는 세포 분열 동안 위성 DNA의 mRNA의 성적 증명서, 타협 염색체 무결성의 축적으로 이어질하고, 그 후, 병리학 적 상태 (13)의 다양한 개발 될 수 있습니다. PM에 의한 후생 유전 학적 변화의 단부 점과 CA의 유전 학적 분석 방법의 적응하므로 높은 중요하다. 여기서, 우리는 뮤린 대 식세포 RAW264.7 모델 시스템을 사용하여 시험 관내의 CA 노광 분석 주위 PM 수집 및 제조를위한 방법을보고한다. 대 식세포는 t 따라서, 흡입 된 이물질을 우선적으로 보호를 포함하고,그의 세포주 확립 입자 독성학 11, 12, 14, 15에서 가장 자주 사용하는 모델로서 기능한다.

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

입자상 물질 (PM)에 노출되면 핵의 유전 물질을 포함하는 다양한 세포 성분을 손상시킬 수 있습니다 세계 주요 건강 문제이다. 핵 유전자의 무결성에 대한 PM의 영향을 평가하기 위해, 구조 염색체 이상은 마우스 RAW264.7 대식 세포의 중기 스프레드로 획득된다. PM은 높은 볼륨의 총 부유 입자 샘플러와 주변 공기에서 수집됩니다. 회수 된 물질은 용해 및 수용성 미세한 부분을 유지하기 위해 여과 하였다. 입자를 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 화학 조성을 특징으로한다. 입자 현탁액의 상이한 농도는 미처리 대조군 세포와 함께 72 시간의 총 노출 시간 동안 RAW264.7 마우스 대식 세포의 시험 관내 배양에 첨가된다. 노광 끝에서 배양 중기 세포 체포 colcemid로 처리된다. 세포를 수확, acetomethanol에 고정 저장성 용액, D로 치료유리 슬라이드 상 ropped 최종적 김사 용액으로 염색. 슬라이드는 명 시야 현미경을 사용하여 1000 배의 배율에서 중기 스프레드 구조 염색체 수차 (CAS)에서 평가하기 위해 조사된다. 50 ~ 100 중기 확산은 각 치료 그룹습니다된다. 이 기술은 이러한 염색 분체 형 나누기, 염색 분체 형 교류, acentric 조각, dicentric 및 링 염색체, 두 분, endoreduplication, 그리고 오후에 노출 된 후 체외에서 로버트슨 전좌 등의 구조적 염색체 이상 (CAS)의 검출에 적합하다. 후생 유전 학적 변화에 잘 확립 된 세포 유전 학적 엔드 포인트를 연결하는 강력한 방법이다.

큰 관심은 TSP 샘플러의 위치뿐만 아니라, 모음이 수행되는 년의 시간을 선택하는데주의해야한다. 화학 성분뿐만 아니라 입자의 크기가 실질적 결과에 영향을 미칠 수있다. 수집 된 자료는 흰색 필터에 대해 볼 수 있어야합니다. 정상 마우스 중기 스프레드는 40 acentric 염색체를해야합니다. 이 기술의 목적은 대조군에 비해 처리 된 세포의 비정상 염색체의 비율의 변화 (또?...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

이 프로토콜은 대기 입자상 물질로 치료 한 후 마우스 RAW264.7 대 식세포 관내에서 정량 및 염색체 이상 특성화를위한 기술을 설명한다.

를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em&gt; 체외</em&gt; 시스템

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K 조회수.  University of Arkansas for Medical Sciences.  이 프로토콜은 대기 입자상 물질로 치료 한 후 마우스 RAW264.7 대 식세포 관내에서 정량 및 염색체 이상 특성화를위한 기술을 설명한다. 

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

유전학

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

면역학 및 감염병학

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

생체공학

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics : 수치과 구조 변경의 탐지는 모두 24 인간의 염색체로 동시에 소설 OctoChrome 생선 분석을 사용

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

생물학

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em&gt; Xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

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를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석

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