This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

모든 절차 이탈리아 법에 따라했다. 쥐의 AF 샘플은 GFP라는 C57BL / 6-Tg는 (UBC-GFP) 30Scha / J 마우스에서 13.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 한 쥐에서 수확했다. 1. 트랜스포존 생산 주 : 트랜스포존 발현 벡터는 표준 클로닝 방법을 사용하여 생성 하였다. 마우스 AF 세포 형질 전환 용 플라스미드 DNA 상업용 키트를 사용하여 제조 하였다. <ol><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 DH5α 박테리아의 50 μL와 플라스미드 DNA 10ng의 섞는다. 20 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 품어. </li><li> 40 초 동안 42 ° C에서 열 충격. </li><li> 2 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 놓습니다. </li><li> 미리 예열 (37 ° C) 원성 국물 (LB) 배지 250 μl를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃ (300 RPM)를 흔든다. </li><li> 0.1 ㎎ / ㎖ 앰피 실린와 LB 플레이트에 각 변형의 30 μl를 확산. 판 건조, 37 ° C 오븐에서 반전 품어 허용ernight. </li><li> 다음날, 오후에, 각각의 변환에서, 멸균 200 μl의 팁을 사용하여, 3 식민지를 선택하고 0.1 ㎎ / ㎖ LB 앰프에 전송합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 (300 RPM) 박테리아를 흔들어. </li><li> 플라스미드 정제 용 상용 장비를 사용합니다. -20 ° C에서 스톡 플라스미드. </li></ol> 2. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 문화 <ol><li> 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트의 코팅 <ol><li> 여섯 개의 우물 각 멸균 0.1 % 젤라틴 1 ㎖를 추가 후드 코트 판. 젤라틴 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C)를 중합 할 수 있습니다. </li><li> 초과 폐기하고, 1 시간 동안 접시를 건조. </li><li> 실온에서 저장 판을 밀봉하고 파라 필름을 사용합니다. </li></ol></li><li> 미토 마이신 C와 MEF의 불 활성화 <ol><li> 37 ° C 조를 이용하여 4 × 10 6 MEF 세포의 병을 해동. </li><li> MEF 매체와 페트리 접시 (150mm)의 후드에서 MEF을 시드. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포 배양. </li><li> (주) 세포가 합류 있습니다 마이 토마 이신 C (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에 장소 세포 (37 ° C와 5 % CO 2) 3 시간 동안. </li><li> 마이 토마 이신 C를 세척 세포와 1 배의 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 매체를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 37 ° C 배양기에 상업 트립신과 장소 세포 2 ㎖를 추가합니다. 후, 트립신 반응을 정지 매체를 차단 18 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 BURKER 챔버를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 5 분 145 XG에 원심 분리기 세포. 상층 액을 버린다. </li><li> 씨앗 60,000 세포 / 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에 불 활성화 MEF의 cm 2. </li><li> AF 및 / 또는 AF-만능 줄기 세포를 파종 전에, 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 세포를 배양. </li></ol></li></ol> 3. 마우스 AF 세포 분리 <ol><li> 시간 제한 교배를 설정하고 질 PLU를 확인공동 주택의 24 시간 후 GS. </li><li> 13.5 DPC 때까지 관찰하고 자궁 경부 전위를 통해 임신 댐을 희생. </li><li> 70 % 에탄올을 사용하여 동물의 복부 벽을 청소한다. </li><li> 가위를 사용하여 복강에 접근하기 위해 복부 벽의 길이를 절개 정중선 개복을 수행한다. </li><li> 집게를 사용하여 자궁을 노출. 1X PBS 얼음에 배치 멸균 가득 100mm 배양 접시에 가위 및 전송을 사용하여 자궁을 제거합니다. </li><li> 10 배 배율에서 AF를 수집하는 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 집게와 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거합니다. 태아 막과 그에 따른 양수 누수에 손상을 피하기 위해주의해야합니다. </li><li> 멸균 1X PBS로 가득 100mm 배양 접시에 태아를 수집하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 깨끗한 100mm 페트리 접시에 좋은 점 집게와 장소 하나 태아의 태반을 잡고. </li><li> 좋은 점 집게를 사용 골목 노른자를 제거합니다. </li><l난&gt; 좋은 점 집게를 사용하여 양막을 방해하고 15 ML 원뿔 유리 병에 인슐린 주사기를 사용하여 각 태아에 대한 AF의 30 μl를 수집합니다. </li><li> AF 컬렉션 후, 1 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 멸균 1X PBS로 각 태아 세척하고, 15 mL의에 AF를 함유하는 원뿔형 튜브를 수집한다. </li><li> 5 분 145 XG에 원심 분리기 AF. 후드 뜨는을 제거하고 펠렛 AF 세포를 시드. </li></ol> 4. 마우스 AF의 세포 배양 <ol><li> 마우스 AF 세포의 파종 <ol><li> 어느 날 전에 시드로, 마이 토마 이신 C 처리 MEF와 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> AF 컬렉션 후, AF 배지를 사용하여 (약 1 × 10 7 세포는 태아에서 얻은 6)를 비활성화 mitotically MEF 상으로 양수로부터 얻은 세포를 시드. </li><li> 매일 매체를 변경, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 배양. </li><li> 문화 7 일, 트랜스 후아래에 설명 된 절차에 따라 AF에는 영향 셀. </li></ol></li></ol> 5. 형질, 만능 줄기-AF 세포 생성 및 문화 주 : 마우스 AF 세포 (PB-CAG-rtTA) 트랜스포존 플라스미드 트랜스 발현 플라스미드 (mPBase)과 관련하여 역방향의 테트라 사이클린 transactivator 더불어 PB-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포존 플라스미드로 형질 감염시켰다. 모든 플라스미드는 교수 안드라스 나기 (33)에 의해 제공되었다. <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 (2 μg의 전체 DNA) 0.5 mPBase의 μg의 0.5 PB-CAG-rtTA의 μg의와 PB-tetO2-IRES-OKMS 1 μg의 혼합. </li><li> 무 혈청 배지 100 μL (- DMEM 둘 베코 변형 이글 배지)로 DNA를 희석. </li><li> (플라스미드 DNA의 비율로 8 μL 형질 제 2 μg의 (DNA)의 형질 전환 제) (예를 들면, 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene) 형질 감염 시약 8 μL를 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 관 함유하는 DNA로. </li><li> 실온에서 15 분 동안 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 인큐베이션. </li><li> / 웰이 용액의 최종 부피 마우스 AF 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 100 μL를 적하 첨가하고 완만 한 소용돌이로 배포한다. 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 하루 후, 독시사이클린 1.5 μg의 / ㎖ (각 웰에 대한 미디어 2 mL)으로 보충 된 신선한 만능-AF 배지로 세포를 공급하여 야마나카의 인자 (인 Oct4, Klf4, cMyc, Sox2이)의 발현을 유도한다. </li><li> 신선한 DOX 함유 배지 (포인트 5.13까지 독시 싸이클린 보충 미디어에서 세포를 유지)를, 통과하지 않고, 매일 세포를 공급. </li><li> mCherry 발현 24 시간 이내에 매일 콜로니 형성 (식민지는 일반적으로 형질 전환 후 20 30 일 사이에 표시)에 대한 세포를 관찰한다. </li><li> 하루 콜로니 피킹 전에, 마이 토마 이신 C 처리 된 MEF가있는 96- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. </li><li> 볼륨 날기의 50 μL에 하나의 식민지를 선택GA 200 μL 피펫, 개별 웰에서 96 웰 플레이트로 순차적으로 전달. </li><li> 하루 후, 상용 트립신의 50 μL를 추가하여 하나의 셀에 각 콜로니를 해리하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 식민지를 해리하는 아래로 피펫합니다. </li><li> 독시 싸이클린 보충 신선한 만능 줄기-AF 매체의 100 μL 가득 96 웰 플레이트 코팅 된 0.1 % 젤라틴에 불 활성화 MEF와 새로운 잘으로 해리 식민지를 포함하는 트립신의 양도 50 μL. </li><li> 세포를 60-70 %의 컨 플루 언스에 도달하면, 24 웰 플레이트의 웰에 나누어. </li><li> 식민지 독시 싸이클린없는 상태로 나타날 경우 확인이 우물, 독시사이클린없이 독시사이클린 한 다른, 2 : 세포가 60-70%의 합류에 도달하면 1 분할. </li><li> IP에-AF 매체에 불 활성화 MEF에, 독시사이클린 독립적 인 만능 줄기-AF 클론을 유지하기 위해 계속합니다. </li><li> 채널 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양매일 매체를 anging. </li></ol> 6. 알칼리성 포스파타제 염색 <ol><li> 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이있을 때마다 제조사의 프로토콜은 다음 알칼리성 포스파타제 염색을 수행한다. </li></ol> 7. 면역 형광 <ol><li> 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이 될 때마다, 비활성 MEF있는 24 웰 플레이트의 웰에 150,000 세포 / cm 2 시드, 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 세포를 성장한다. </li><li> (주의)을 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 웰 당 300 μl를 첨가하여 세포를 고정. </li><li> 0.1 % NP-40 Permeabilize 하시려면하는 세포 300 μl를 추가합니다. </li><li> 0.1 % PBS-트윈 20의 300 μL로 세포를 씻어. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (PBS 1X 10 % 말 혈청) 300 μL를 추가한다. </li><li> (1:10 인 Oct4 (1:80), Sox2이 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog를 다음 일차 항체를 사용하여0)과 SSEA1 (1:80). 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청으로 희석 SSEA1 0.3 M 글리신, 0.1 %의 PBS-트윈 -20. 1X PBS 10 % 말 혈청과 다른 모든 항체 희석. </li><li> 4 ℃에서 밤새 항체를 품어. </li><li> 0.1 % PBS-트윈-20의 300 μl를 씻어. </li><li> 1X PBS에서 10 % 말 혈청 희석 보조 항체를 사용 Alexa594 결합 염소 항 - 마우스 IgG (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭고기 방지 염소 IgG를 (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭 항 - 토끼 IgG의를 (1 : 200) Alexa568 결합 염소 항 - 마우스 IgM의 (1 : 200). 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 1X PBS로 씻어. </li><li> 1X PBS에서 : 훽스트 용액 (10,000 1)와 얼룩 핵. </li></ol> 체외 세포 분화 8. <ol><li> 매달려 드롭 배아 체 (사채)을 형성, 분화 배지를 사용하여 배양 접시의 뚜껑에 (2,000 세포 / 20 μL) 한 방울을 육성. </li><li> 37 ° C에서 요리를 품다4 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 분화 배지에서 3 일간 현탁 배양에 100mm 박테리아 수준의 요리로 사채를 전송합니다. </li><li> 또 다른 14 일간 (DMEM에서 1:10 희석) 기저막 행렬로 코팅 된 24 잘 번호판 플레이트 사채. </li><li> T (1 : 100), αfp (1 : 200) 및 Tubb3 (1 : 500) 37 면역 형광 분석의 경우, 일차 항체를 사용합니다. </li></ol> 9. 생체 기형 종 형성 <ol><li> - / - γC - / - 생쥐 Rag2의 사지의 근육에 1 × 10 6-AF 만능 줄기 세포를 포함하는 1X PBS 100 ㎕를 주입한다. </li><li> 육주 세포 주입 후 자궁 전위를 통해 쥐를 희생. </li><li> 다음과 같은 분석을위한 쥐의 뒷다리에서, 크기에 의해 구별 종양 덩어리를 제거합니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 이소 펜탄 냉동 종양의 7 ~ 10 μm의 두께 횡단면을 잘라. </li><li> 헤 마톡의에 대한D의 에오신 (HE) 얼룩 : <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 종양 조직 구성을 평가하는 HE와 얼룩. </li></ol></li><li> immunoperoxidase 얼룩의 경우 : <ol><li> 실온에서 15 분 동안 4 % PFA로 기형 섹션을 고정한다. </li><li> 0.1 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면. </li></ol></li><li> 다음 항체와 인큐베이션 : Tubb3 (1 : 100) αfp (1시 50분) 및 αSMA (1 : 100) 1X PBS에 1 % BSA에서 희석한다. 1 (Tubb3 용) 37 ° C에서 시간 또는 밤새 4 ° C에서 (다른 항체)에 대한 품어. </li><li> 20 분 동안 100 % 메탄올을 사용하여 블록 옥시다아제. </li><li> 37 ° C에서 45 분 동안 품어 HRP - 복합 (1 : 150) 이차 항체 항 - 마우스는. </li><li> 1X PBS로 씻어. </li><li> 5 분 동안 퍼 옥시 다제 (HRP) 기판 (재료 표 참조)에 품어. </li><li> 5 분 동안 수돗물로 씻어. </li><li> 9 초 동안 헤 마톡 QS로 얼룩. </li><li> 수돗물로 씻어. </li></올&gt; 세포에서 10 RNA 추출 <ol><li> 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용합니다. </li></ol> 기형 종에서 11 RNA 추출 <ol><li> 샘플을 해동 피하기 위해 봉과 박격포와 액체 질소를 사용하여 기형 종을 균질화. </li><li> 조직의 25 mg의 무게. </li><li> RNA 추출을위한 상용 시약 1 mL의 클로로포름 200 μL를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> 13,000 XG에 원심 분리기 15 분 동안 4 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 클리어 뜨는을 전송합니다. </li><li> RNA의 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용 정화합니다. </li></ol> (12) 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 분석 <ol><li> 역전사 (RT) -polymerase 연쇄 반응 (PCR)과 올리고 (DT) 코르위한 역전사 효소를 이용하여 제 1 가닥 cDNA의 합성제조 업체의 프로토콜 땡은 50 NG / cDNA를 μL을 얻었다. 10 NG / μL의 농도의 RNase없는 물과 cDNA를 희석. </li><li> RT-PCR은 1 NG를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 폴리머 라 아제를 사용하여 수행 / μL의 cDNA. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

능성의 유도를 얻기 위해 선택된 방법은 장기 이식에 대한 임상 세포의 안전을 위해 적합하다. 요즘 프로그래밍에 적합한 여러 가지 방법이 있습니다. 비 통합 방법 중에서, 센다이 바이러스 (SEV) 벡터는 감염된 세포의 핵 (40)로 통합하지 않고 대량의 단백질을 생산할 수 및 만능 줄기 세포를 수득하기위한 전략 될 수있는 RNA 바이러스이다. SEV 벡터는 병진 급 IPS 세포의 생성을위?...

산전 진단은 유전 질환 (즉, 염색체 이상, monogenetic 또는 인성 / polygenetic 질환)과 선천성 기형 (즉, 선천성 횡격막 탈장, 낭포 성 폐 병변, exomphalos, 배벽 갈림 증)을 평가하는 중요한 임상 도구입니다. 양수 (AF) 세포는 임신의 두 번째 임신 중 정기적으로 예약 절차에서 획득하는 간단한 (즉, 양수 천자 및 amnioreduction) 또는 제왕 절개 섹션 1, 2입니다. 태아 또는 신생아 환자 AF 세포의 이용은 재생 의학이 소스를 사용할 수있는 가능성을 제공하고, 여러 연구자들은 AF 3, 4, 5, 6에서 분리 된 줄기 세포 집단을 사용하여 서로 다른 조직 손상 또는 질환을 치료하는 가능성을 조사7, 8, 9, 10, 11, 12. 쉽게 질병들은 종종 고정 된 시간 윈도우에서 질병 환자 AF 셀을 획득 할 가능성은 프로그래밍 목적이 셀 소스를 사용하는 아이디어에 방법을 연다. 실제로, AF 세포로부터 유래 된 유도 다 능성 줄기 (IPS) 세포는 출산 전에 적절한 환자 별 치료를 준비하기 위해, 시험관 내 약물 검사 또는 조직 공학 방법에 대한 관심의 세포 분화 될 수있다. 많은 연구가 이미 AF 세포의 능력은 세포 형태 13, 14, 15, 16, 17 &lt;넓은 범위로 재 프로그램과 차별화 될 입증/ SUP&gt; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. 네 개의 전사 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)의 강제 표현을 통해 다카하시 및 재 프로그램 체세포의 야마나카 (28)에 의해 발견 이후, 진행 프로그래밍의 분야에서했다. 다른 방법을 고려하여, 우리는 바이러스 및 비 - 바이러스 성 방법을 구별 할 수있다. 첫번째 부분 재 프로그램 세포주의 결과와의 위험 모두 고효율이지만 레트로 바이러스 유전자 보통 불완전 침묵을 가질 바이러스 벡터 (레트로 바이러스 및 렌티 바이러스)의 사용을 예상삽입 성 돌연변이 29, 30, 31. 즉, 플라스미드 벡터, mRNA의 단백질, 트랜스포존 : 비 - 바이러스 성 방법은 다른 전략을 사용한다. 유전자 서열의 무료 만능 줄기 세포의 유도는 새는 유전자 발현 및 삽입 성 돌연변이 유발의 잠재적으로 해로운 영향을 회피하는 것을 목표로하고있다. 위에서 언급 한 모든 비 바이러스 전략 중, 피기 백 (PB) 트랜스포존 / 트랜스 시스템은 삽입 또는 절제 이벤트 (32)을 촉매하는 유전자와 트랜스 효소의 일시적인 발현을 측면에만 역전 된 말단 반복을 필요로한다. 만능 줄기 세포의 생성을위한 다른 방법을 통해 트랜스포존을 사용의 장점은 레트로 바이러스 벡터의 동일 효율을 나타내는 비 - 바이러스 벡터 방식 벡터 프리 만능 줄기 세포를 얻을 수 있다는 것이다. 이것은 reprogr위한 통합 트랜스포존 인코딩 트레이스 이하로 절단 할 수있다만능 줄기 세포 (33)의 트랜스의 새로운 일시적 발현 다음과 같은 요소를 amming. PB가 다른 세포 유형 34, 35, 36, 37 효율적임을 감안할 때, 바이러스 벡터에 대한 임상 적 접근 방식에 더 적합하며, 생체이 물을 사용하여 현재의 바이러스 생산 프로토콜 달리 이종없는 만능 줄기 세포의 생산을 허용 조건은,이 시스템은 뮤린 AF에서 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 사용된다. 여기에서 우리는 마우스 AF 세포 (IPS-AF 세포) (38)로부터 만능 만능 줄기 클론의 생산을 보여주기 위해 이미 게시 작업을 다음과 같은 세부적인 프로토콜을 제안한다.

<table><tbody><tr><td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Alkaline Phosphatase&amp;nbsp; staining</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>For bacterial selection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bacteria for cloning procedure</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Doxycycline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>For exogenous factors expression</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>72.706</td><td>For PB production&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>For MEF medium</td></tr><tr><td>Fine point forceps</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&amp;nbsp;</td><td>AF isolation</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Used 0.1%, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>For blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Haematoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Nuclei detection</td></tr><tr><td>HE&amp;nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Histological analysis of teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Nuclei detection</td></tr><tr><td>Horse Serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>For blocking solution</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Secondary antibody (immunoperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Peroxidase substrate</td></tr><tr><td>Insulin syringe with needle (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Amniocentesis procedure</td></tr><tr><td>Klf4&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>LB broth (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>For bacterial growth</td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>For mouse AF and iPS-AF cells medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation. Diluted 1:10 in DMEM</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroxidase blocking</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture</td></tr><tr><td>Nanog&amp;nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>For blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Mouse monoclonal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>For RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (solution)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, free of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Petri Dish (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>For MEF culture, tissue culture</td></tr><tr><td>PiggyBac transposase expression plasmid&amp;nbsp;</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>For plasmids purification</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>For plasmids purification</td></tr><tr><td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&amp;nbsp;</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>Sox2&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Goat polyclonal IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Mouse monoclonal IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>For RT-PCR</td></tr><tr><td>T&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Cell culture passaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubb3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G712A</td><td>Mouse monoclonal IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>&amp;alpha;fp&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>Mouse Monoclonal IgG1</td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Mouse Monoclonal IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfection Reagent (FuGENE HD)</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E2311</td><td>For AF cells transfection</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>To perform amniocentesis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l tips</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>70.760012</td><td>To pick bacteria colonies</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 stainless 25U</td><td>To perform amniocentesis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>To clean the abdominal wall of the pregnant dam</td></tr><tr><td>Tissue culture petri dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>For MEF expansion</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>For MEF inactivation</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>For iPS-AF culture</td></tr></tbody></table>

the production of pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells using a transposon system

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

프로그래밍의 능력을 평가하기 위해 마우스 AF 세포를 GFP 마우스의 태아로부터 수집 하였다. 세포는 솔더 (Soler) (a 독시사이클린 - 유도 방식으로 mCherry 형광 단백질에 연결된 야마나카 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)를 나타내고, 원형 트랜스포존 플라스미드 PB-tetO2-IRES-OKMS, 형질 및 테트라 사이클린 transactivator 역방향했다 CAG-rtTA)은 트랜스의 발현 플라스미드 (mPBase)와 함?...

Watch this Scientific Journal Video about The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System at JoVE.com

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza. In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. 

비디오: The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

연구

발생학

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

생물학

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

유전학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...