Name: the drosophila imaginal disc tumor model: visualization and quantification of gene expression and tumor invasiveness using genetic mosaics
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics at JoVE.com

We thank the Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Br&#252;ckner and Istvan Ando for fly stocks, and antibodies. We thank Marek Jindra and Colin Donohoe for comments on the manuscript. This work was supported by the Sofja Kovalevskaja Award to M.U. from the Alexander von Humboldt Foundation and DFG project UH243/1-1 to M.U. from the German Research Foundation.

참고 :이 작업은 eyFLP1을 활용; 행동&gt; Y +&gt; GAL4, UAS-GFP; FRT82B, 욕조 - Gal80 MARCM 82B 그린 테스터 라인 (11). 같은 w 같은 계통의 남성에 MARCM 82B 그린 테스터 처녀를 넘어; UAS-A; UAS-B의 RNAi, FRT82B C의 MUT 유전자형은 유사 분열 재조합이 3 번째 상동 염색체의 오른쪽 팔 사이에 발생하는 자손을 얻을 것입니다. 이러한 방식으로, FRT82B 사이트 원위 위치 유전자 C의 클론 동형 접합 돌연변이는 EAD 뇌 neuroepithelium 내에서 발생한다. 이 클론 유전자 B (그림 1A)에 대한 GFP, 유전자 A와 dsRNA를 표현합니다. 는 X, 2L, 2R, 3L 및 3R에 재결합을위한 다양한 eyFLP-MARCM 테스터 라인을 설립하고, 비행 지역 사회 내에서 사용할 수있다. 1. 플라이 처리, 십자가, 및 준비 <ol><li> 여러 보을 채워 실온에서 해당 MARCM 테스터 재고를 확장동시에 ttles. 충분한 처녀가 후속 십자가 수집 할 수 있도록 2-3 일마다 신선한 병으로 성인 플립. 참고 : 처녀를 수집 할 때,이 여성의 생식력을 타협으로 2 CO하는 장기간 노출을 피하십시오. </li><li> 실험의 규모에 따라 최소 10 MARCM 테스터 처녀와 (예를 들어, 형광 기자와 면역 염색의 영상의 경우) 또는 최소 30 처녀과 10 명의 남성 (예를 들어, 용 병 4 명의 남성을 사용하여 유리 병에 비행 십자가를 설정 RNA 분리 및 침입의 정량). </li><li> 긴 하루를 16 시간 / 8 시간의 명암 사이클에서 25 ° C에서 자손을 올립니다. 유충의 재현 할 준비를 촉진하고 혼잡을 방지하기 위해 새로운 병 / 병에 매 24 시간을 부모 플립. 참고 : 달걀 누워 (AEL) 후 6 일에 시작, 후반 세번째 령 제어 애벌레 정지 공급은 방황 시작하고 pupariation를 입력합니다. 대조적으로, 유충 번데기 - 전이의 개시는 해제 될 수있다누워 또는 EAD가 증식 또는 악성 클론 종양 베어링과 애벌레의 존재. </li></ol> 2. 세 번째 탈피 애벌레를 수집 <ol><li> 면역 염색의 경우, 약 20 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 부드럽게 유리 병 또는 병에서 애벌레를 선택하고 인산염 완충 식염수 (PBS) 가득 배아 유리 접시에 그들을 전송하는 집게를 사용합니다. <ol><li> RNA 분리 및 침입의 정량화를 들어, 적어도 80 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 표면이 덮여 때까지 유충을 포함하는 비행 병에 PBS를 분출하기 위해 물총 병을 사용합니다. </li><li> 주걱 음식의 상단 층을 연화 페트리 접시에 유충을 포함하는 식품 매쉬 붓는다. 집게를 사용하여 부드럽게 애벌레를 선택하고 PBS로 가득 배아의 유리 접시로 전송합니다. </li></ol></li><li> PBS의 UNT와 유충을 씻으십시오위원장 모든 잔여 음식이 제거됩니다. 애벌레 몸 전체 랜덤 GFP 양성 반점 (그림 2A, 2B 및 참조 토론 섹션)을 수행하는 모든 &quot;표범 애벌레를&quot;폐기 16X 배율로 8 형광 실체 현미경 아래의 유충을 검사합니다. 참고 : RNA 분리를 들어 1 분 동안 70 %의 EtOH의 끝에서 두 번째 세척 단계를 포함한다. </li><li> 해부 때까지 얼음에 PBS에서 선택한 애벌레가 들어있는 접시를 놓습니다. 30 분 내에 처리 유충은 추위와 굶주림의 부작용을 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 애벌레 3. 해부 <ol><li> 실체 현미경 하에서 EAD를 해부하기 위해 부드럽게 유리 접시 바닥에 대한 유충의 중간 부분을 눌러 포셉 한 쌍을 사용합니다. 두 번째 집게로, 애벌레 입 후크를 잡아 멀리 신체 (그림 2C)에서 그들을 잡아 당깁니다. 참고 : 당기는 힘은 EAD 파이를 연결하는 광섬유 줄기를 중단하는 것이 충분하다뇌 로브에 대한 연구. 뇌 또는 부품 EAD 부착 유지하고 그들의 존재는 상기 애플리케이션에 바람직하지 않은 경우, 겸자 두 쌍의 도움으로 광섬유 줄기 잘랐다. (예를 들어, RAS의 V12의 scrib 1) EAD 뇌 로브 사이의 연결이 점점 overgrowing와 클론 세포를 마이그레이션하여 시간에 가려된다 침습적 종양하십시오. <ol><li> 온전한 복부 신경 코드 (VNC) (그림 2D)과 EAD / 뇌의 복잡한을 준비하려면 몸의 중앙에 유충을 잘라 집게를 사용합니다. 후방 절반을 폐기하십시오. </li><li> 한 집게의 끝 사이의 애벌레 몸의 앞쪽 절반을 잡고, 두 번째 집게의 끝 입 후크에 눌러 첫 번째 집게 쌍과 그 위에 표피를 압연하여 애벌레 내부 아웃 플립. </li></ol></li><li> 조심스럽게 EAD 쌍을 남기면서 모든 외부 조직 (예를 들어, 침샘, 지방 본문 및 창자)을 제거하거나 집게를 사용하여입 후크에 연결된 EAD / 뇌 복잡한. 위에있는 표피에서 입 후크를 풀다. 몸의 근육과 표피 (도 1B, 2C, 2D)에 연장 축삭 돌기를 절단하여 VNC를 무료로 제공됩니다. 참고 : 입 고리가 집게로 조직의 안전 조작이 가능하고 세척하는 동안 조직을보다 효율적으로 침몰하고 쉽게 인식을 용이하게한다. PBS에 고정되지 않은 유지하면 상대적으로 빠른 EAD 변화 형태를 해부. 20 ~ 30 분에 해부 시간을 제한합니다. </li><li> 조직을 전송하려면, 코트 나머지 몸을 피펫 팅하여 P20의 마이크로 피펫 팁은 위아래로 여러 번 전기자. 큰 EAD / 두뇌 단지를 전송하려면, 가위로 P20의 마이크로 피펫 팁을 잘라. 주 : 코팅 절차는 전송 중에 점착 및 해부 조직의 손실을 방지하기 위해 중요하다. P20 마이크로 피펫을 사용하면 원치 않는 한계 희석, 정착액 PBS 용액으로의 전달을 최소화한다. <ol><li> 면역 염색의 경우, 전송400 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정액으로 가득 0.5 ML 튜브로 EAD를 해부. 큰 EAD 1 ml의 PFA 1.5 ML 튜브를 사용하여 / 뇌 단지는 침입의 득점에 대한 의미. 주의 : PFA는 매우 독성이다. 보호 장갑과 복을 착용 할 것. 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. </li><li> RNA 분리를 들어 차가운 PBS로 가득 찬 새로운 유리 접시에 해부 EAD를 전송합니다. 샘플 오염을 최소화하기 위해, 링과 림프 땀샘에서 EAD를 청소 집게를 사용합니다. </li><li> 집게 (도 2E)을 사용하여 상기 안테나 디스크 입 후크 사이의 접속을 절단하여 후크 입에서 EAD를 분리. RNA 분해 및 유전자 발현 유물을 방지하기 위해, 30 분에 해부 시간을 제한 할 수 있습니다. 7 단계로 진행합니다. 참고 : 숙련 된 연구자가 애벌레 수집 및 세척에 필요한 30 분을 제외한 시간에 약 60 유충을 해부 할 수 있습니다. 총 RNA 수익률은 유전자형과 developmenta 사이에 다릅니다 EAD 크기에 따라 달라집니다리터 단계. 후반 세번째 령 유충 80-100 제어 EAD 쌍 해부 5-8 μg의 총 RNA를 생성한다. </li></ol></li></ol> 4. 고정, 면역 염색 및 장착 <ol><li> 실온에서 하향 경사하면서 25 분 동안 PFA의 정착액에 샘플을 수정합니다. 정착 시간은 조직 형태학 및 단백질의 항원 성 변화없이 60 분까지 연장 될 수있다. </li><li> nutator를 사용하여 10 분 동안 세 번 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBST로 정착 및 세척 샘플을 제거합니다. 각 세척 단계 (400 μL / 0.5 ML 튜브)에 대한 PBST의 충분한 양을 사용합니다. 참고 : 고정 EAD / 뇌 복합체는 면역 염색을 필요로하지 않는 침입의 득점에 대한 의미. GFP 신호가 고정 된 후에도 계속 표시됩니다. 최종 해부를 위해 4.4 단계로 진행합니다. <ol><li> 면역 염색을 위해, 실온에서 교반과 함께 20 분 동안 (0.3 % BSA와 PBST) 블로킹 용액 200 μL의 블록 조직. <ol><li> 꼼꼼한으로 품어가볍게 흔들어 섞으면 진 항체를 4 ℃에서 밤새 블로킹 용액 100 ㎕로 희석 하였다. 권장 항체 희석 차 항체 데이터 시트 또는 게시 된 문헌을 참조하십시오. 참고 : 차 항체 희석 최적화해야 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 어두운 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 2 시간 동안 진탕하면서 또는 PBST에서 5 ~ 10 분간 세척 이후, 형광 이차 항체로 염색 된 조직을 차단 용액으로 희석 하였다. </li><li> 워시 샘플을 세 번 PBST에서 10 분. </li></ol></li></ol></li><li> DAPI 염색 용액 500 μL와 PBST를 교체합니다. F - 굴지 레이블을 지정하려면, DAPI 염색 용액에 형광 염료를 결합 팔로이 딘을 추가합니다. 어둠 속에서 15 분 장동 후, PBST 10 분 동안 한 번 조직을 씻으십시오. 주 : F 액틴 라벨링 DAPI 염색과 독립적으로 수행 될 수있다. </li><li> 최종 해부 단계를 들면, 1 ml의 파이를 사용하여 PBS 채워진 유리 접시에 다시 조직을 전송pette. 입 후크를 클립 집게의 두 쌍을 사용. <ol><li> 분석을 방해 할 수 있습니다 자란 EAD로 광학 줄기를 절단하여 EAD에서 침입의 정량에 사용되는 뇌를 분리합니다. </li></ol></li><li> 객관적인 슬라이드에 장착 매체의 드롭 (A 22mm X 22mm의 coverslip에 15 μl를) 놓습니다. 집게 팁의 도움으로, 얇은 층으로 매체를 배포 할 수 있습니다. P20의 마이크로 피펫으로 장착 매체에 EAD, 뇌 또는 EAD / 두뇌 단지를 전송합니다. </li><li> 조직을 배포하고 슬라이드에 VNC를 곧게 포셉의 조언, 텅스텐 막대를 사용합니다. </li><li> 설치하는 동안 거품, 첫 번째 터치 한 설치 매체에 커버 슬립의 가장자리와 집게의 도움으로 장착 매체에 천천히 이하의 형성을 방지 할 수 있습니다. 커버 슬립의 가장자리 주위 초과 장착 매체를 흡수 닦아 필터 종이 또는 조직의 작은 조각을 사용합니다. 참고 : DABCO / 폴리 (비닐 알코올) 4-88 설치 매체 굳어시간 내에서 4 ° C에서. 슬라이드는 4 ℃에서 달 동안 저장 될 수있다. </li></ol> 5. 공 촛점 이미징 <ol><li> 20X, 40X 및 60X 오일 목표에 장착 된 공 초점 현미경을 사용하여 단일 공 촛점 섹션과 스택을 획득. </li><li> 픽셀 포화를 방지합니다. 오프셋 화상 해상도, 레이저 입력 전력, 이득 프레임 평균화하는 Z 시리즈의 스텝 크기를 포함하여 동일한 이미지 포착 파라미터를 사용하여 상이한 유전자형 (21, 22) 사이의 픽셀 세기들의 비교를 허용하는 모든 유전자형에 대한 위치 설정을 유지한다. 참고 : EAD / 두뇌 단지의 시각화를 들어, 최대 돌기를 생성하고 각각의 이웃 이미지 만들기. 최종 이미지 준비, 패널 조립 후 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 밝기와 대비를 조정합니다. </li></ol> 종양 침윤 6. 정량 <ol><li> 종양 invasivenes의 다른 수준을 특성화하는 채점 시스템을 정의침윤의 공간적 패턴과 뇌 VNC에 확산 GFP 양성 세포의 양을 고려이야. 문서 (그림 3A)에 대한 평가 시트를 준비합니다. </li><li> 마운트는 적어도 80 24mm X 50mm의 coverslip에 따라 장착 매체의 40 μl를 사용하여 하나의 슬라이드에 각각의 유전자형에 대한 손상 머리를 고정. <ol><li> 편견 득점을 허용하려면, 채점 절차는 편견되도록, 슬라이드를 익명화하는 중립적 인 파티를 부탁드립니다. 독립적으로 두 실험실 구성원 익명 처리 슬라이드를 평가합니다. 계산이 완료된 후에 만 ​​유전자형이 개시되어있다. </li></ol></li><li> GFP 필터 세트가 장착 된 형광 실체 현미경 아래에 장착 뇌의 블라인드 점수에 의해 악성 종양의 정도를 평가합니다. 이미 이중 계산 (그림 3B)를 방지하기 위해 본 한 두뇌에 라벨 마커를 사용합니다. </li><li> 유전자형에 따라 정의 된 침습성 각 범주에 떨어지는 두뇌의 비율을 계산합니다. 통계들 결정ignificance 카이 제곱 테스트 (그림 3C)를 사용하여. </li></ol> 7. RNA 분리, DNase의 치료 및 품질 검사 참고 : 다음 단계에 사용 된 모든 시약 (솔루션, plasticware은)의 RNase 활동이 없어야합니다. 항상 장갑을 착용 및 유기 용제 작업 화학 후드를 사용합니다. <ol><li> 1.5 ml의 튜브에 코팅 된 P20의 마이크로 피펫 팁과 깨끗한 EAD를 전송합니다. </li><li> 튜브의 바닥 조직 싱크하자, 조심스럽게 PBS를 제거하고 100 μl의 RNA 용해 시약 (최대 140 EAD에 대한 충분한)로 교체합니다. </li><li> 텍싱에 의해를 Lyse 조직. 이 시점에서, 샘플을 액체 질소에 냉동 깊은 -80 ℃에서 보관하거나 직접 표준 RNA 분리 프로토콜을 사용하여 처리 될 수있다. 참고 : 여러 해부 라운드에서 유사한 유전자형의 샘플 RNA 용해 시약에 한 번 풀 수 있습니다. </li><li> RNA 용해 시약 0.9 ml의에 샘플 볼륨을 입력합니다. 클로로포름의 0.2 ML을 추가하고 vigoro 샘플을 혼합15 ~ 20 초 동안 usly. </li><li> 실온에서 2 내지 3 분 인큐베이션 후, 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리. </li><li> 상간을 방해하지 않고 새로운 튜브로 무색 위 수성 상을 포함하는 RNA를 전송합니다. 이 단백질과 게놈 DNA가 들어 있으므로 멀리 계면에서 그대로. 주 : 회수 볼륨 균질화 사용 RNA 용해 시약의 부피의 약 60 %이어야한다. </li><li> 이소 프로필 알코올 0.5ml를 첨가하여 RNA를 침전. 볼텍스하고 실온에서 10 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 75 % 에탄올 600 μL로 한 번 RNA 펠렛을 씻는다. 짧은 소용돌이와 원심 분리 (4 ℃에서 7 분간 10,000 XG) 후 모두 에탄올을 취소하고 5 ~ 10 분 깨끗한 조직 닦아에게에 오픈 튜브를 배치하기위한 RNA 펠릿 공기가 건조 할 수 있습니다. 참고 : RNA 펠렛은 작은 불투명 / 화이트 성으로 볼 수 있습니다튜브 또는 눈에 보이지 않는 하단의 잘 익은. 나머지 에탄올 방울 신중 P10의 마이크로 피펫 팁으로 제거 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁을 몇 번 텍싱 또는 솔루션을 전달하여 DEPC 처리 된 물 50 μL의 RNA를 녹여. </li><li> 게놈 DNA의 오염을 최소화하기 위해, DNase의 1 μL (2 U / μL) 및 DEPC 처리 된 물에 10 배의 DNase 완충액 10 μl를 함유하는 혼합물 50 μl를 첨가하여 전체 RNA의 DNase로 치료. 소용돌이와 스핀 다운. </li><li> 수조 또는 30 내지 40 분 동안 가열 블럭에서 37 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 배양 후, 각 샘플에 DEPC 처리 된 물 100 μl를 추가합니다. </li><li> , DNase의에서 효소 활동하고 깨끗한 RNA를 비활성화 페놀의 200 μl를 추가하려면 : 4 ° C에서 7 분 동안 10,000 XG에서 1 분 원심 분리기에 대한 샘플 솔루션, 소용돌이 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (1 ~ 25 : 24). </li><li> 조심스럽게 새로운 튜브에 RNA를 함유하는 상부 수 성상을 전송. 동일한 볼륨을 추가 (200 μL)클로로포름, 혼합 위에서 원심 분리 단계를 반복합니다. </li><li> 신중 상부 상 모아서 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피를 첨가하여 RNA를 침전, pH가 5.2 100 % 에탄올 DEPC H 2 O 2.5 권으로 제조. 텍싱에 의해 철저하게 섞는다. 참고 : 침전 믹스 0.5 μL 글리코겐 (20 μg의 / μl를) 추가는 RNA 펠렛을 시각화하는 데 도움이됩니다. 실리콘이 낮은 바인딩 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 사용하여, RNA의 손실을 최소화한다. </li><li> 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 RNA를 침전. 참고 : 배양 밤새 수행 할 수 있습니다. 샘플뿐만 아니라 -80 ° C에 배치 될 수있다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 RNA. 세척하고 7.9의 기술에 다음과 같은 건조 펠렛. </li><li> DEPC 처리 된 물 10 ~ 15 μL에서 RNA를 녹인다. -80 ° C에서 보관 RNA. </li><li> 230 nm의, 260 nm의 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정하여 RNA의 양과 순도를 결정합니다. RNA 공동 계산협약을 적용하여 ncentration 40 μg의 / ㎖ RNA와 동일한 nm의 260에서 1 OD 그. 참고 :하는 A 230분의 260 비율은 2.0-2.2의 범위에 있어야하는 동안 &quot;순수한&quot;RNA의 280 분의 260 비율은 2.0 같습니다. 1.7와 2.0 사이는 A 260/280 비율 RNA 샘플은 cDNA 합성 등의 하류 어플리케이션에 적합하다. mRNA의 서열 - 라이브러리의 제조를위한 RNA의 질과 양을 자동 전기 시스템을 이용하여 확인한다. 28S / 18S 비율은 1.8 이상이어야합니다. </li></ol>

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V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>del Valle Rodr&#236;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li><li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis.">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li><li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing.">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging.">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

기술은 초파리의 유전 모자이크 분석 및 유전자 기능 (33)를 조작하기위한 가장 정교한 도구들이다 생성합니다. 그것은 눈이없는 증강 활성 9,18 인 조직에서, 즉, 공간적으로 제한된 방식으로 시각적으로 표시, 유 전적으로 정의 된 클론의 유도를 할 수 있습니다대로 eyFLP - MARCM 시스템은 강력하고 강력한 입증되었습니다. 여러 유전 적 병변이 동일한 셀에 결합 ...

암 발생률과 사망률을 극적으로 전 세계적으로, 특히 노인들 사이에서 증가하고 질병의 가장 유 전적으로 이질적인 그룹 중 하나를 나타냅니다. 암은 고유의 종양 억제 메커니즘을 탈출하고 통제 분할하는 종양 시작 세포에서 클론 적 기인한다. 죽음과 분화를 억제하면서 협력 적 성장, 증식과 운동성을 촉진 유전자 병변의 점진적 축적은 매우 악성 전이성 치명적인 종양으로 초기 양성과 성장을 변환합니다. 이것은 유전 적 변형에 더하여, 종양 진행이 미세 환경에서 복수 종양 세포 유형 (예를 들어, 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 사이의 주변의 스트로마 및 크로스 토크의 변화를 필요로한다는 증거가되고있다. 종양 기질 상호 작용을 포함하여 악성 변환을 기본 분자 원리를 이해하는 것은 예방하기 개발에 매우 ​​중요하다기 및 조기 검진 전략뿐만 아니라 새롭고 효과적인 치료법은 암 전이 및 약물 내성을 방지한다. 과일 초파리 비행은 빠른 생성 시간 때문에 암 연구 1-4위한 매력적인 시스템이되었다, 파리와 인간의 거의 모든 유전자의 조작을 용이하게 고급 유전자 도구의 제한으로 유전자 중복과 부 사이의 노드 신호의 놀라운 보존 일시적으로 공간적으로 제한 방법. 다양한 악성 종양 유전자 정의 재현성 MARCM 기술 5를 사용 달리 야생형 조직에서 전구 세포의 서브 세트에 이득 - 및 기능 상실 돌연변이를 도입함으로써 초파리 설계 될 수있다. MARCM 도구는 FLP / FRT는 (FLP 재조합 효소 / FLP 인식 대상이) FLP 아웃 7 GAL4 / UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 8 표적 유전자와 유사 분열 재조합 (6) - 중재 결합발현 시스템 구. dsRNA를 유도 유전자 침묵에 대한 종양 유전자 또는 형광 단백질 cDNA를 또는 반전 DNA의 반복을 포함한 모든 UAS 기반 유전자의이 방법의 표현으로, 특정 유전자 궤적과 재결합으로 인해 GAL4 리프레을 잃은 세포의 복제에 제한됩니다 (도 1A). 클론 패치가 녹색 형광 (GFP) 또는 적색 형광 단백질로 표시 (예를 들어, RFP,을 DsRed, mCherry)는 쉽게 개발, 격리 및 분석을 통해 추적 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이들 동작은 직접 인접하는 야생형 조직과 비교 될 수있다. 따라서, 질문은 유전 적 병변의 자율이 아닌 자율적 인 효과를 편리하게 공부하실 수 있습니다 세포 관련의. 포유 동물과 마찬가지로, 만 클론은 여러 종양 병변은 초파리에서 악성되고 포유 동물의 암의 주요 특징을 요점을 되풀이 결합된다. 그들은 세포 사멸을 회피 염증을 유발, 불멸과 INVA되고, overproliferate시브는 궁극적으로 호스트 10-17를 죽이는. 여기, 우리는 프로토콜이 MARCM 기술을 사용하여 초파리 유충의 눈 / 더듬이와 뇌 조직에서 유전자 정의 클론 종양을 생성하기 위해 설명합니다. 이 방법은 눈이없는 인핸서 (eyFLP) (18, 19)의 제어하에 효모 FLP 재조합 효소를 발현하는 MARCM 테스터 재고에 의존한다. 이러한 방식으로, GFP 표지 클론 peripodial 및 주상 EAD의 상피 세포 및 배아와 애벌레 단계 (그림 1A, B 및 기준 20)을 통해 뇌의 neuroepithelium 모두에서 생성됩니다. neuroepithelium는 차별화 된 광학 로브 뉴런을 생성 neuroblasts에 상승을 제공하면서 EAD가 성인 눈, 안테나와 머리 캡슐로 개발로 클론 쉽게 성인이 될 때까지 올 수 있습니다. 우리 드 모자이크 조직의 광범위한 분자 기능 및 표현형 특성을 용이하게하기 위해,서기관 세 번째 령 유충에서 EAD과 뇌의 해부에 대한 프로토콜은 세 가지 다른 응용 프로그램을 처리하는 방법을 간략하게 설명합니다 : (ⅰ) 형질 전환 형광 기자와 면역 검출, 종양 침입 및 (ⅲ) 분석 (II) 정량 유전자 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 또는 높은 처리량의 mRNA 서열 (mRNA의 서열 -) (도 1C)을 이용하여 변경한다. 면역 염색 프로토콜은 특정 항체와 관심있는 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 형질 전환 형광 전사 기자는 특정 신호 전달 경로의 활동에 편리하고 정확한 시공간 정보를 제공합니다. 세포 계보 특정 기자 한편, 모세 조직 내의 별개의 유전자형 간의 종양 세포 집단에 정량적 변화를 반영한다. 침략 행동의 정량은 유전자형 사이의 종양 악성 종양의 비교를 용이하게에스. 마지막으로, RNA 분리에 대한 모자이크 EAD의 수집 및 처리를 설명하는 프로토콜은 각각 QRT-PCR 및 게놈 전체의 mRNA-SEQ, 다음 역전사 등 모두 크고 작은 규모의 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다. 이 분석에서 얻어진 정성 및 정량 데이터는 클론 종양의 사회적 행동에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, 그들은 개인의 유전자, 유전자 네트워크와 다른 단계의 종양 미세 환경과 종양의 측면의 역할에 대한 기능 연구를위한 견고한 기초를 생산하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&amp;uuml;rzm&amp;uuml;hle Brecht, Eggenstein, Germany</td><td>00262-0500</td><td>Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Corn syrup</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Soy flour</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-4-benzoate/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>H5501</td><td>Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila fly food vials</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Germany</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Vial plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fly food bottles</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Bottle plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CHOH-]&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>81381</td><td>Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39&amp;nbsp;ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50&amp;nbsp;&amp;deg;C and centrifuge 20&amp;nbsp;min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>158127</td><td>4% PFA fixative recipe: Dissolve 4&amp;nbsp;g PFA in 80 ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O on a magnetic stirrer plate heated to 55&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 &amp;micro;l Triton X-100 and fill up with Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml. Store aliquots at -20 &amp;deg;C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A3059</td><td>Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled phalloidin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 &amp;deg;C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335</td><td>DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store aliquots at 4 &amp;deg;C. Used in dilution 1:1,000 in PBST.</td></tr><tr><td>Mouse anti-H2 antibody</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass embryo dish (30&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&amp;auml;ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Precision Wipes</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera</td><td>Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>FV1000</td><td>Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20&amp;times; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&amp;times; UPlanFL (NA 1.30) and 60&amp;times; UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50&amp;nbsp;mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40&amp;nbsp;mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15&amp;nbsp;mW) and Red Laser diode 635 (20&amp;nbsp;mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Drosophila cooled incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td>&amp;nbsp;Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Squirt bottle</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Digital Rocking Shaker</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>2302700</td><td>The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D5758</td><td>Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, stir overnight and autoclave.</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&amp;micro;l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate trihydrate</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>27652.232</td><td>Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust the pH to 5.2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>100983</td><td>Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automated Electrophoresis Station</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>Prepare 100 &amp;micro;M stock solutions in DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France</td><td>4030</td><td>Store aliquots of 25 &amp;micro;l at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3&#039;</td></tr></tbody></table>

the drosophila imaginal disc tumor model: visualization and quantification of gene expression and tumor invasiveness using genetic mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

초파리 EAD에 정의 된 유전자형 GFP 마크 패치를 생성하는 eyFLP-MARCM 기술의 가능성을 증명하기 위해, 클론의 세 가지 유형이 유도되었다 : 경우 1 제어 발현 GFP (2) 악성 종양이 작고의 종양 형태를 나타내는 종양 억제 유전자 낙서의 동형 접합 손실 (scrib 1)의 배경에서 G 단백질 라스 (라스 V12), (3) overgrowing하지만 비 침습적 라스 V12</s...

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

11.0K 조회수.  University of Cologne.  이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

연구

발생학

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue organization. Drosophila melanogaster has emerged as a popular experimental model system in cancer biology to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. In particular, genetic tools for Drosophila imaginal discs (developing epithelia in larvae) enable the creation of transformed pro-tumor cells within a normal epithelial tissue, a situation similar to the initial stages of human cancer. A recent study of tumorigenesis in Drosophila wing imaginal discs, however, showed that tumor initiation depends on the tissue-intrinsic cytoarchitecture and the local microenvironment, suggesting that it is important to consider the region-specific susceptibility to tumorigenic stimuli in evaluating tumor phenotypes in imaginal discs. To facilitate phenotypic analysis of tumor progression in imaginal discs, here we describe a protocol for genetic experiments using the GAL4-UAS system to induce neoplastic tumors in wing imaginal discs. We further introduce a diagnosis method to classify the phenotypes of clonal lesions induced in imaginal epithelia, as a clear classification method to discriminate various stages of tumor progression (such as hyperplasia, dysplasia, or neoplasia) had not been described before. These methods might be broadly applicable to the clonal analysis of tumor phenotypes in various organs in Drosophila.

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Mosaic clone analysis in Drosophila imaginal disc epithelia is a powerful model system to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. Here we describe a protocol to induce tumors in Drosophila wing imaginal discs using the GAL4-UAS system, and introduce a diagnosis method to classify the tumor phenotypes.

종양의 유도 및 진단<em&gt; Drosophila</em&gt; 상피 디스크 상피 세포

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

암 연구학

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

신경과학

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

프로그래밍 가능한 자동 나노리터 인젝터 를 사용한 초파리 멜라노가스터 에서의 종양 동종이식

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

의학

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

생물학

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

그만큼

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의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서