Name: using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).

1. 터치 유발 응답 분석 <ol><li> 터치 유발 응답 분석을위한 배아 DPF (2)의 제조 <ol><li> 활동이 하루 (17, 18)를 통해 극적으로 변화 할 수 있기 때문에 테스트가 실시되는 날의 시간이 실험 사이의 일관성이 있음을 확인합니다. 주 : 실험을 수행 맹검 시험 순서는 실험적 인공물을 최소화하기 위해 랜덤 화되어야한다. </li><li> 생선을 할당하는 실험을 수행하는 개인에게 알려지지 않은 참조 균주. 자유롭게 사용할 수 온라인 도구 테스트의 순서를 지시 임의의 목록을 생성하여,이에 따라. </li><li> 적어도 1 시간 전에 테스트하기 위해, 융모막에 구멍을 찢어 부드럽게 미세 핀셋을 이용하여 이격 융모막 당기는 dechorionate 배아. 28 ° C 배양기에 반환하기 전에 배양 접시에서 이물질을 제거합니다. </li></ol></li><li> 터치 유발 응답 분석을 수행 <ol><li> 열 역GE는 28 ° C에서 적어도 15 분에 테스트를 시작하기 전에. 이 단계는 온도가 제어되고 28에서 유지됩니다 : 주 &#160; 테스트 기간 동안 C를 °. 온도 활동에 영향을 미칠 것이며, 그 온도를 일정하게 유지하는 것이 중요하다. 가열 단계가없는 경우는 물의 온도가 모니터링되어야하고 모든 실험은 동일한 온도에서 수행되어야한다. </li><li> 배아 매체 (5 mM의 염화나트륨, 0.17의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘이 물에 0.33 mM의 황산 4) 조명 스테이지로 가득 배양 접시를 놓고 페트리 접시 위에 고속 카메라를 탑재합니다. </li><li> 물고기의 빠른 수영 활동 기록을 보장하기 위해 캡처 속도와 같은 초 (1,000 FPS) 당 1,000 프레임을 선택합니다 (예 : 여기에 설명 스트림 픽스 5, 등)와 &quot;작업 공간&quot;탭에서 비디오 카메라 레코딩 소프트웨어를 실행합니다. </li><li> 한 번에 하나의 배아 작업의 MIDD에서 배아를 배치보기의 분야에서 눈에 잘 제브라 피쉬와 함께 배양 접시의 제작. 참고 : 배아 실험의 시작 탈환과 태아의 위치가 일부 질병 모델에서 근육 약화를 촉진 할 수있다 자극과 반복 버스트 반응에 둔감되는 것을 초래할 수 있으므로, 다른로 교체 멀리 전에 수영합니다. </li><li> 은 &quot;기록&quot;버튼을 클릭하여 녹음을 시작하고, 머리의 상단에 무딘 바늘로 가볍게 터치하여 배아에 mechanosensory 자극을 제공합니다. </li><li> 배아가 시야에서 수영 할 또는 휴식에 돌아온 후에 녹화를 중지합니다. 주 : 기계적 자극 다음 버스트 이탈 반응의 첫 0.2 초 이내에 가속도 피크. 따라서, 생선 시야에 기록 이탈 반응의 제 0.2 초간 이상이되도록. 단계 1.2.3에 설명 된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 자동 저장 될.AVI 비디오 파일로. 이러한 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다 둘 다 무료 비디오 캡처 또는 Softonic, 같은 대체 비디오 캡처 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에 배아를 반환 및 테스트를위한 또 다른 배아를 선택합니다. (15) 물고기의 최소한의 테스트를 수행합니다. </li></ol></li><li> 수영 동작의 정량화 <ol><li> 수영 동작을 정량화하기 위해 소프트웨어를 실행하고 .AVI 저장된 동영상 파일을 엽니 다 &quot;배경 차감없이 단일 애벌레 로코&quot;모듈을 선택하십시오. </li><li> 은 &quot;자유&quot;또는 동영상의 메뉴 바의 일부 지역에서 &quot;다각형&quot;툴을 사용하는 분석에 사용된다. 이 지역은 물고기의 원래 위치와 물고기에 수영을 할 것이라는 영역을 모두 포함하고 있는지 확인합니다. 프로브 분석 할 수있는 영역에서 제외되어 있는지 확인합니다. 소프트웨어는 자동적으로 원하는 영역 내 어류의 궤적을 추적한다. </li><li> t을 수행하려면그는 분석, 메뉴 바에서 &quot;실험&quot;을 클릭하고 &quot;실행&quot;을 선택합니다. 원하는 위치에 원 데이터 분석 파일 (.phr 포맷)을 저장 메시지가 나타나면. 저장 한 후 분석을 시작하려면 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 은 &quot;실험&quot;에서 &quot;중지&quot;를 클릭하여 분석을 종료 드롭 다운 메뉴. 결과를 포함하는 윈도우가 표시됩니다. </li><li> &quot;최대 가속도&quot;값을 얻기 위해 오른쪽으로 스크롤. 원하는 경우, 결과 창을 닫고 &quot;결과&quot;에서 &quot;수출 순간적인 결과&quot;버튼을 클릭하여이 데이터를 내보낼 드롭 다운 메뉴. 해당 원시 데이터 분석 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 스프레드 시트 프로그램에서 열 수있는 텍스트 파일을 대상 폴더에 저장됩니다. </li><li> 각각의 물고기, 각 균주에 대한 평균 최대 가속도를 얻기 위해 평균에 대해이 과정을 반복하여 (도 1 참조). 참고 : 다른 방법으로저기서하기g 여기에 설명 된 소프트웨어 등 자유롭게 사용할 ImageJ에 소프트웨어와 유사한 패키지 관련 움직임 데이터를 추출하는데 사용될 수있다. 3 차원 입자 추적기 플러그인은 수영의 궤적을 추적하는 데 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 로코 분석 - 10 분 수영 테스트 <ol><li> 수영 분석을위한 배아 DPF (6)의 제조 <ol><li> 필요한 경우, 정렬 배아 필요한 유전자형에 대한 별도의 배양 접시 (접시 당 25 ~ 30 배아)에 형광 단백질 또는 표현형으로 발현을 조사하고, 배치에 의해, 예를 들면. 대안 적으로, 유전자형은 운동 분석 종료 후 결정될 수있다. </li><li> 3 DPF에서 배양 접시를 다시 검토하고 깐 배아 및 이물질을 제거합니다. 6 DPF 때까지 28 ° C 배양기에 배양 접시를 돌려줍니다. </li><li> 제브라 피쉬 애벌레가 가장 활성화되어있는 시간입니다 오전 9시에서 정오 사이의 모든 균주의 테스트를 수행합니다. 상기 p-에서 테스트 및 위치의 순서를 무작위야생형 및 돌연변이 늦은 샘플은 주기성의 차이 및 다른 실험 바이어스의 영향을 최소화한다. 주 : 활성 하루 동안 극적으로 변할 수 있기 때문에, 테스트 시간이 실험과 일치하는 것이 중요하다. </li><li> 적어도 30 분은 물론 당 하나의 애벌레와 48 웰 플레이트에 시험 장소 유충 전에. 물 표면 그냥 잘의 맨 아래에 있도록 전송 한 후, 기포가없는 보장 우물을 입력합니다. 28 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 타고 시험을하기 전에 5 분 동안 빛에 순응. </li></ol></li><li> 로코의 분석을 수행 <ol><li> 이 유충이 어둠 검출 할 수 있도록, 60 프레임 / 초까지 포착 적외선 디지털 카메라가 장착되는 기록 챔버로 48- 웰 플레이트를 놓는다. 우물 모두가 운동 소프트웨어에 원형 격자 내부에 배치되어 있는지 확인하고 모든 애벌레는 CLE 있음아 흘리 검출. </li><li> 소프트웨어를 실행하고 &quot;추적&quot;모듈을 선택합니다. &quot;파일&quot;에서 &quot;생성 새로운 프로토콜&quot;을 클릭하고 실험에 사용되는 우물의 수를 편집 할 수 있습니다. 실험 기간과 &quot;매개 변수&quot;를 클릭하여 10 분에 통합 기간을 모두 설정 드롭 다운 메뉴와 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;및 이후에 &quot;시간&quot;탭을 선택. 동일한 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;대화 상자에서 &quot;옵션&quot;탭을 클릭하고 &quot;Numeriscope&quot;체크 상자는 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;대화 상자를 닫을 수 있습니다, 다음을 클릭 확인합니다. </li><li> 기록 영역이 우물 하나에 전체 그리드 더블 클릭을 강조 설정합니다. 은 &quot;그리기 영역&quot;버튼을 클릭하고 왼쪽, 오른쪽 및 왼쪽 아래 우물 주위에 그릴 및 소프트웨어가 자동으로 잘 각각의 위치를 ​​확인할 수 있습니다 &quot;빌드&quot;를 클릭합니다. 또한 규모에 무승부바 및 &quot;그룹에 적용&quot;을 클릭합니다. 완료되면, &quot;영역을 그립니다&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 시각적으로 만 물고기의 움직임이없는 배경 신호를 강조하는 수준으로 &quot;감지 임계 값&quot;막대를 밀어 검출 임계 값을 결정합니다. 주 : 검출 임계 값은 균주 따라서 임계 값은 새로운 변형을 테스트 할 때마다 결정해야 할 사이에 다를 수 있습니다. 대표 데이터는 25mm의 검출 한계를 제시 / 초를 사용 하였다. </li><li> 테스트를 시작하기 전에 활동의 탐지 및 크고 작은 운동을위한 운동 임계 값을 입력합니다. 주 : 대표 데이터가 6mm / 초 비활성 임계치와 30mm의 활성 버스트 액 제시 / 초를 사용 하였다. 임계 값은 최소 이동 활성 간주 결정하고 요구 수준은 버스트 활성을 고려 (소 활성으로하지만 버스트 activi 이하 활동 분류를 허용 할타이 임계 값)과 버스트 활동 임계 값보다 큰 (대) 운동. 임계 값 분석은 특정 물고기 균주의 활동에 따라 변경 될 수 있습니다. 주 : 분석은 어느 밝거나 어두운 조건에서 수행 될 수 있지만, 제브라 유충 암 (18)에보다 적극적으로 도시되어있다. </li><li> &quot;매개 변수&quot;에서 &quot;빛 운전 설정&quot;버튼을 클릭하여 0 %에있을 챔버 내부의 빛의 강도를 설정 드롭 다운 메뉴. 결과 대화 상자에서 필요한 조명 설정을 추가합니다. 참고 : 챔버 내부의 빛의 강도는 유충의 활동을 자극하는 테스트 시간 동안 ON과 OFF 설정하는 트리거 될 수 있습니다 </li><li> 녹화 실의 문을 닫고 비디오 녹화를 시작합니다. </li></ol></li><li> 수영 동작의 정량화 <ol><li> 실험이 완료되면 &quot;실험&quot;에서 &quot;중지&quot;를 클릭 드롭 다운 메뉴. 대화 보모든 결과에 X가 표시됩니다. </li><li> &quot;를 포함하는 폴더 열기&quot;에 엑셀 클릭으로 이러한 결과에 액세스하고, 생성 된 폴더에 표시되는 엑셀 파일을 엽니 다. 중요한 매개 변수 &quot;smlct&quot;(작은 운동 횟수), &quot;larct&quot;(대형 이동 카운트), &quot;smldist&quot;(작은 움직임에 물고기에 의해 덮여 총 거리)와 &quot;lardist&quot;큰 움직임의 물고기에 포함 (총 거리입니다 ). 주 : 기록 다음은, 소프트웨어는 또한 10- 동안 운동의 시각적 표현을 포함하고 .PNG 이미지 파일 ((10 분의 기록 화상을 포함)을 아비 파일의 형태로 두 개의 추가 출력 파일을 리턴 분 실험도 2 참조). </li><li> 운동 값이 계산되면 정확하게 계산 된 운동 값이 물고기의 수영의 움직임을 묘사 여부, (그림 참조 검토 할 .AVI 및 .PNG 파일을 재생3). 주 : 여기에 기술 된 소프트웨어를 사용하는 대신, 이러한 자유롭게 사용할 ImageJ에 소프트웨어와 같은 패키지가 locomotory 행동을 추적하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

쥐, 개, 제브라 피쉬, 파리와 벌레 등 다양한 동물 모델은 근육 질환의 유전 및 분자 기초에 대한 우리의 이해를 향해 기여하고 대처하기 위해 치료 방법의 개발을 지원하고있다. 제브라 피쉬 근육 질환 연구를위한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 제브라 피쉬는 시험 관내 배양 시스템에서 불가능 적합한 생리 환경에서 복잡한 근육 패턴을 평가하기 위해 유전자 조작 가능한 시스템을 제공한다. 다른 척추 동물 모델과 달리, 서로 광학적 투명도로 제조 물고기의 다수의 생체 내 화학적 및 유전자 선별 빠르고 높은 처리량을 용이하게한다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아시 근육의 성능을 평가하기 위해 높은 처리량 및 자동화 된 방법을 제공하는 제브라 이동 분석법의 개발을 기술한다. 모두 분석 것은 인정해야하는 일주기 리듬과외부 환경의 자극이 크게 zebrafish의 수영 동작 (17, 18)에 영향을 미칠 것입니다. 같은 제브라 피쉬의 반복 시험은 23 자극 촉감에 반응 감소의 원인이 습관화으로 이어질 것입니다. 따라서, 실험 간 재현성있는 결과를 각 지브라 피쉬 배아를 달성하기 위해 단지 일 및 조명 조건의 시간을 표준화해야 한번 검사 및 수온 조절 단단해야한다. 우리가 직접 근력에 비례 버스트 수영 작용하는 최대 가속도를 측정 할 수있는 DPF 터치를 사용하여이 분석에서 유발. 제브라 피쉬의 이전 기술 측정 전계 및 근육 (14)의 힘 - 생성 능력을 사용하여 자극 근육 수축 실험 장비 다음과 배아의 양단 매로 근력을 조사했다. 이 방법은 t의 용량을 생성하는 힘을 측정하는 동안그는 애벌레 근육이 수영하는 동안 애벌레 근육에 의해 생성 된 실제 힘을 측정하지 않습니다. 따라서 우리는 간접적 근육 상태의 전체 측정 값을 제공하기 위해 통상의 유충 수영 동작 중에 발생하는 힘을 평가하기위한 방법을 개발 하였다. 1000 프레임들의 프레임 레이트로 개별 지브라 피쉬의 움직임을 기록 할 수있는 고속 비디오 시스템은 / 초 눈하여 구별 할 수없는 근육 기능 작지만 상당한 차이를 식별하는 데 사용될 수있다. 그것은 전기 자극 힘 세대의 변화 수영 성능의 변화와 상관 관계를보고하는 방법 이전에보고 관심이 될 것입니다. 또한 터치 응답 분석도 locomotory 동작의 정량적 측정을 제공하기 위해, 예를 들면 수영장 모션 24시 본체 파의 형상 및 속도와 같은 수영 역학을 평가하는데 사용될 수있다 유발. 때문에 zebraf의 자발적인 운동틱 유충 3 DPF 후에는 근육 기능을 측정하는 터치 연상 분석을 수행 할 수 없었다. 반대로, 우리는 6 DPF에 제브라 유충 swum과의 거리를 결정함으로써, 장기간에 걸쳐 근육의 성능을 측정 하였다. 이 시험은, 근육 기능을 간접적으로 측정되지만, 생선 손상된 근육 퇴행 성능 8 25,26 표시를 식별 할 수있다. 이 테스트는 6 분 도보 테스트 유사한 측정을 제공뿐만 아니라 생체 내 약물이나 돌연변이 화면에 자동으로 높은 처리량에 적합뿐만 아닙니다.

지난 십년 동안 점점 제브라 근육 세포 생물학 및 질병을 연구하는데 사용되었다. 광학적 선명도와 결합 된 제브라 피쉬 배아의 급속한 외부 개발, 근육 형성, 성장, 그리고 기능의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 근육 발달의 과정은 매우 제브라에서 보존되고,이 근육 이영양증 근육 병증 선천성 1-8 포함한 근육 질환의 범위의 성공적인 모델링을 허용했다. 제브라 피쉬 모델의 상세한 검사는 이러한 조건의 병리 생물학에 새로운 통찰력을 제공뿐만 아니라 적절한 치료 6,9-13의 테스트를위한 플랫폼을 제공 한 사실이 없습니다. 근육 질환 제브라 모델의 분석은 근육의 성능을 측정하는 신뢰성 있고 재현 가능한 분석에 의존한다. 이전의 연구에 의해 성공적으로 DPF (3,7) 사이 물고기 제브라 피쉬 트렁크 근육 힘 생성 능력을 측정했다전기적 힘 전달 시스템 (14)에 부착 된 고정 물고기의 수축을 자극. 이 힘의 상세한 측정을 제공 할 수 있지만 이상적으로 높은 처리량 실험에 적합하지 않은 수영시 근육의 성능을 측정하는 장점이있다. 제브라 피쉬의 근육 DPF 2에서 완벽하게 작동하고 물고기는 자극에 반응 버스트 수영의 움직임을 유도 할 수 있습니다. 터치 연상 이탈 반응 분석법 수축력의 척도로 사용될 수 버스트 수영 운동시 가속을 측정하는 데 사용된다. 근육 병증 환자에서 근육 기능의 대부분의 활용 방법 중 하나는 총 거리가 하드 평평한 표면 (15, 16)에 걸어 기록 6 분 도보 테스트입니다. 우리는 전체 거리 swum과 모니터링함으로써, 제브라 유충 DPF 6 근육 기능을 측정하기 위해 비교 테스트를 적용하고 10 분 동안 각각의 유충에 의해 움직임의 총 수있다. 이 수행근육의 성능과 신뢰성이 높은 처리율 측정을 제공하는 자동화 추적 시스템을 사용. 두 근육 검사 재현성 있고 제브라 근병증 모델 팔 근육의 성능 차이를 정량화하는 데 사용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1&#039; Blunt Needle</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri Dishes</td><td>Pacific Laboratory Products PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Camera</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>Steps 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pipette</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>Step 1.2.3</td></tr><tr><td>Temperature Control Unit</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox System</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint</td><td></td><td>Steps 1.3.1, 2.2.1</td></tr></tbody></table>

using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish

Zebrafish의 근육 발달은 매우 그들에게 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델을 만드는 포유류 시스템에 보존되어있다. 골격근의 기능에 영향을 미치는 많은 근육 병증 쉽고 빠르게 배아의 처음 며칠 제브라에서 평가 될 수있다. 24 시간 후 수정 (HPF)으로 야생형 제브라 피쉬는 자발적으로 자신의 꼬리 근육을 수축, 48 HPF, 제브라 피쉬 전시 제어 수영 행동으로. 주파수 감소, 또는 다른 변형이 이러한 운동은 골격근 기능 장애를 나타낼 수있다. 수영 동작을 분석하고 초기 제브라 피쉬 개발에 근육의 성능을 평가하기 위해, 우리는 모두 터치 유발 탈출 응답 및 운동 분석을 사용한다. 터치 유발 이탈 반응 분석은 고속 트 위치 근육 섬유의 수축으로 인한 짧은 버스트 동작시 근육의 성능을 평가하는데 사용될 수있다. 이 경우에는 수돗물이 외부 자극에 응답하여머리, 포스트 수정 (DPF) 2 일째 야생형 제브라 피쉬는 일반적으로 날카로운 회전과 함께 강력한 버스트 수영을 나타낸다. 우리의 방법은 가속도 근육 수축에 의해 생성 된 힘에 직접 비례하는, 버스트 수영 동작시의 최대 가속도를 측정함으로써 골격근 기능을 정량화한다. 반대로, 초기 제브라 유충 발달 동안 운동 분석은 근육 활동의 지속 기간 동안 근육의 성능을 평가하기 위해 사용된다. 수영 동작을 모니터링하는 추적 시스템을 이용하여, 자신의 골격근 기능의 반사 6 일된 제브라 활동 거리와 주파수의 자동 산출을 행한다. 수영 성능 측정은 질병 모델과 골격 근육 기능에 영향을 미치는 돌연변이 또는 화학 처리의 높은 처리량 검사의 표현형 평가 가치가있다.

터치 반응 분석이 근력의 비례 측정 속도 및 수영 운동의 가속도를 결정하는데 사용될 수있다 유발. 기계적인 자극에 대한 응답으로 같은 야생형 제브라 피쉬 전시 빠른 수영 동작 DPF 머리 2에 작은 탭있다. 비디오 캡처 개의 상이한 피쉬 근육 병증 모델을 분석 하였다 : (TG ACTA1 D286G-EGFP), 심각한 근육 약화를 갖도록 도시 된 네 말린 근병증의 모델, 중증 근육 결함 설명되었다 된 뒤 시엔 느 근이영양증의 모델 19, 20 DPF 5에서. 일반적인 터치의 영상의 이미지는 그림 1A에 표시됩니다 분석을 불러 일으켰다. 제브라 피쉬의 가속 시험 및 버스트 수영 탈출 응답 (그림 1B)의 첫 번째 0.2 초 이내에 피크에 발견되었다. 이 피크의 최대 가속 g 힘에 비례하는 측정 값을 제공한다골격 근육의 능력을 enerating. Tg는 (ACTA1의 D286G-EGFP) : 평균 276.0 ± 28.8 m / 초 2, N = 3 독립된 복제 실험으로서 = 최대 가속도 값은 각 균주에 대한 평균 최대 가속 값 (평균의 ± 표준 오차)을 얻었다 평균화 (15) 개별 물고기; 야생형 제어 : 평균 = 500.8 ± 50.28 m / 초 2, N = 15 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 - / - 돌연변이 : 평균 = 249.9 ± 19.1 m / 초 2, N = 12-19 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 +/- 이형 : 평균 = 235.9 ± 8.7 m / 초 2, N = 16-27 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD PC2 + / + 야생형의 동형 접합체 : 평균 = 230.9 ± 8.7 m / 초 2, N = 8-27 개별 물고기 (그림 1C)를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험. 예상대로의 Tg (ACTA1의 D286G-EGFP) 물고기 마우스 모델 및 환자 데이터와 일치 8,21,22 감소 근육 기능을 나타내는 최대 가속도의 상당한 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 의 DMD PC2 - / - 돌연변이 물고기 그러나, 20 (도 1D), DPF (3)로부터 근육 결함의 검출과 일치,이 DPF에서의 최대 가속도에 차이를 보이지 않았다. 운동 분석은 근육의 성능의 지표로서 제브라 균주에 의한 활동 swum과 거리를 결정하기 위해 DPF (6)에서 수행 하였다. 테스트 후, 10 분 테스트 기간 동안 수영 운동의 도식적 표현은 각각 느리고 빠른 움직임의 기간을 나타내는 빨간색과 녹색 라인과 비 활동 기간 (그림 2)를 나타내는 검은 선으로, 생성되었습니다. oppos 같은 활동의 상대적으로 더 기간이 개인 야생형 제브라 피쉬 쇼 높은 활동에드 테스트 기간 (그림 2B)를 통해 저 활동의 Tg (ACTA1의 D286G의-EGFP) 물고기에. 수영 동작은 각 물고기 (도 3)로 이동 횟수와 거리 swum과의 각각의 값을 평균하여 정량 하였다. 모두의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) 물고기 (도 3a 및도 3b)와 DMD PC2 - / - 돌연변이 물고기 (도 3C 및 3D)는 각 비교 의하여 수영 이동 거리의 평균 수의 유의 한 감소가 나타났다 컨트롤 : Tg는 (ACTA1 D286G-EGFP) 물고기 : 운동의 의미 수 = 94.3 ± 13.6, 평균 거리 swum과 = 112.9 ± 18.4 mm, N = 45 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; 야생형 컨트롤 : 움직임의 수 = 177.4 ± 14.0 뜻을 의미 거리 swum과 = 300.2 ± 22.8 mm, n은 3 독립적 인 연구(45) 물고기를 포함 eplicate 실험; DMD의 PC2는 - / - 돌연변이가 : 거리 swum과 의미, 움직임의 수 = 163.3 ± 30.0 평균 : 298.4 ± 60.37 mm를, N = 12-20 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 +/- 이형 : 움직임의 평균 수 = ± 38.8 362.3, 거리 swum과 평균 : 660.3 ± 86.1mm N = 17-27 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험을; DMD PC2 + / + 야생형의 동형 접합자는 : 움직임의 수 = 341.9 ± 91.6 의미 = 574.3 ± 170.9mm n은 8-25 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험 거리 swum과를 의미한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> 그림 1 :. 정량 제브라 피쉬 배아 DPF 2 응답 분석을 터치-연상 제어 제브라 피쉬의 (A) 스냅 샷 이미지를하는 동안 2 DPF에서 분석을 터치 보여주고 있습니다. (B) (A)의 제 0.2 초 동안 가속 프로파일하나의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) (빨간색)와 터치 자극의 응용 프로그램에 다음과 같은 단일 제어 (파란색) 제브라 피쉬. 최대 가속도는 점선으로 표시됩니다. (C, D) (C)의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) 제브라 피쉬의 터치 유발 응답 분석에서 기록 된 최대 가속도 (m / 초 2)의 정량 및 (D) DMD PC2 - / - 돌연변이 생선이 DPF에 제브라 대조군에 비해. 오차 막대는 3 복제 실험 ± SEM을 나타냅니다 * P &lt;0.05. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> 그림 2 :. 제브라 피쉬 배아에 대한 운동 분석의 표현 (A) Zebrafish의 배아를 48 웰 플레이트에 배치되고, 운동은 적외선 디지털 카메라를 사용하여 상기에서 기록된다. 레드 라인은 느린 움직임 (소프트웨어에 입력 검출 임계 값에 의해 결정되는) 활동을 묘사 한 검은 선을 묘사 빠른 움직임, 녹색 라인을 묘사와 함께 테스트 기간 동안 제브라 피쉬 운동의 (B) 도식은. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> 그림 3 :. 제브라 피쉬 애벌레 DPF 6 운동 분석의 정량화 운동의 (A) 숫자의 정량화와 (B)의 Tg는에 의해 6 DPF에 제브라 피쉬를 제어 할 수 비교 (ACTA1 D286G-EGFP) 제브라 피쉬를 여행 거리.- / - 6 DPF에 제브라 피쉬 대조군에 비해 돌연변이 물고기의 움직임 (C) 수와 (D)의 정량은 DMD의 PC2에 의해 이동 거리. 오차 막대는 3 복제 실험 ± SEM을 나타냅니다 * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K 조회수.  Monash University. Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function. 

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

생물학

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

신경과학

제브라피시 배아의 독성 평가를 위한 Startle 분석

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

저자 스포트라이트: Zebrafish Embryo Startle Response Assay를 사용한 고처리량 독성 스크리닝

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

요약

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이 비디오의 챕터

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

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라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

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성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이