Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

MNP을 감지하는 방법으로서 참고 :이 섹션은 금 나노 입자의 하이브리드 매개 성장에 따라 MNP를 감지하는 절차를 설명합니다. <ol><li> 프로브 DNA 농도 100 μM에서 (5&#39;-티올 GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자를 준비합니다. (21) 참고 : 여기에 사용되는 볼륨이 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자의 요구 사항에 따라 달라집니다. 이 실험의 수를 실시 할에 따라서 달라집니다. 우리는 일반적으로 스페어로 초과 AuNP 프로브 입자를 준비합니다. 이 단계에 사용 된 볼륨 조절하고 유연하다. <ol><li> 농도 1 OD / ㎖에서 금 나노 입자 용액 (13 내지 17 ㎚)에 (100 μM, 단계 1.1에서 준비를) 프로브 DNA를 추가합니다. </li><li> 도데 실 황산나트륨의 최종 농도를 가지고 NAC (12 H 25 SO 4, SDS) 및 인산염 완충액 (PBS) 0.01 % 및 0.01 M, respectivel 행와이. </li><li> 20 분 후, 염화나트륨 (2 M)과 PBS (0.01 M) 0.01 % SDS로 유지하면서 용액에 0.05 M의 염화나트륨의 농도를 가지고, 20 분 동안 배양한다. </li><li> 1 M 20 분 간격의 최종 농도 0.1 M의 단위 염화나트륨 농도를 증가시킨다. </li><li> 23 ° C에서 와류 믹서에 진탕 밤새 품어. 진동 속도만큼 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼성 해짐에 따라 실험에 영향을주지 않습니다. </li><li> 30 초 동안 7,000 XG에서 금 나노 입자를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li><li> 25 nM의 (AuNP 프로브 용액)의 농도에서 탈 이온수 (DI 수)로 AuNP 프로브 입자를 추가한다. </li><li> 타겟 DNA 샘플을 준비한다 ( &#39;3 개의 염기쌍 미스 매치 : 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC -3- 완전히 상보 여섯 염기쌍 불일치를 : 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;)의 농도로0.06, 0.11, 0.17, 각각 0.20, 0.30, 0.50 μM. </li><li> 염화나트륨 (14 μM)와 DNA 샘플 (350 μL)에 AuNP 프로브 솔루션 (6 μL, 25 nm의)를 추가합니다. </li><li> DNA 혼성화 5 분 동안 23 ℃에서 와동 혼합기 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼합물을 흔들어. </li><li> AuNP 성장을위한 솔루션 (DNA 샘플과 AuNP 프로브의 혼합물)에 NH 2 OH (6 μL, 400 밀리미터) 및 HAuCl 4 (6 μL, 25.4 mm)를 추가합니다. AuNP의 성장은 종료 약 30 초 소요됩니다. 착색의 꾸준한 변화 이상의 1 시간을 유지합니다. 주의 : HAuCl 4 피부에 접촉했을 때 심각한 독성 효과를 얻을 수 있습니다. 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 장갑을 착용하고 HAuCl 4 사용할 때 연기 찬장을 사용하십시오. </li></ol> 공기 방울 조작 플랫폼 2. 제작 참고 : P 다음 PDMS 기반 방울 조작 플랫폼은 두 개의 구성 요소를 포함수퍼 소수성 표면과 공기 채널 층 (5 ㎜)와 DMS 막 (100 μm의). 멤스 공정없이 일반적인 가공 공정의 제작이 미세 유체 성분의 조형하는 금형 PDMS 주조 및 복제하기 위해 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 포함 디바이스, 레이저 미세 가공을 제조하는데 사용 하였다 수퍼 소수성 표면 (도 3 참조). <ol><li> 마이크로 구조체와 PMMA 계 마스터 주형 (도 3 참조)를 생성하기 위해 드릴 비트 (0.5 mm)를 구비 한 CNC 기계를 사용한다. 드릴 비트 7mm / sec의 이송 속도와 회전을 26000 rpm의 속도를 사용한다. PMMA를 스크랩을 제거하고 상기 마스터 주형의 표면을 세정하기 위해 송풍기 및 DI 물을 사용한다. </li><li> PDMS의 기반과 비 10 경화제의 혼합물을 준비한다 : 1. 모든 기포가 제거되고 30 분 동안 또는까지 건조기 내부의 혼합물을 탈기. </li><li> 일에 PDMS를 부어즉 마스터 몰드와 공기 챔버의 역 마이크로 구조 (PDMS 막)와 공기 채널 (PDMS 층)을 얻기 위해 오븐에서 60 ℃에서 3 시간에 대한 PDMS 굽는다. </li><li> (손으로) 마스터 금형에서 PDMS 층을 제거합니다. 공기 흡입 입구의 PDMS 층에 구멍을 펀치. </li><li> 산소 플라즈마 처리 시스템의 챔버로 PDMS 막의 상기 PDMS 층 및 유리 기판을 넣어. 산소 플라즈마 처리 후, 10 분 동안 핫 플레이트 (90 ° C)에서 함께 PDMS 막의 상기 PDMS 층과 유리 기판을 접합. </li><li> 레이저 절삭 기계 (PDMS 막면을 위로)에 복합 칩을 넣어. 초 소수성 영역 (15mm × 12mm)를 정의 할 .DWG 파일을 가져옵니다. 그림 3을 참조하십시오. 직접 PDMS 막 (전력 12 W, 스캔 속도 106.68 mm / 초)에 초 소수성 영역을 생성하기 위해 CO 2 - 레이저 기계와 PDMS 멤브레인을 새기다. </li><li> 씻어 DI 물과 초 소수성 표면을 청소표면에서 떨어져 탄화 잔기. </li><li> 솔레노이드 밸브를 통해 공기 흡입구 및 진공 펌프에 연결 (도 4 참조). 디지털 I / O의 USB 모듈과 컴퓨터와 제어 솔레노이드 밸브를 연결합니다. </li></ol> 공압식 플랫폼에 MNP의 검출 3. 운영 주 :이 부분은 공기 방울 조작 플랫폼 비색 및 급속 MNP를 식별하는 동작을 설명한다 (도 5 참조). 모든 단계가 23 ° C (주위 온도)에서 장소와 상대 습도 85 %를 가져 가라. <ol><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역 (10 μL, 0.5 μM)을 대상 DNA 샘플 방울을 배치합니다. </li><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역의 AuNP 프로브 방울을 (10 μL, 25 nm의) 배치합니다. </li><li> 솔레노이드 밸브 및 SI로 PDMS 막의 편향을 일으키는 공기 흡입을 제어mple 프로그램 (예를 들어, LabVIEW는). 물방울이 서로 충돌하여 유착되도록 PDMS 막에 (각각 표적 DNA와 프로브 AuNP 함유) 물방울의 이동 경로를 따라 각 공기 실의 공기 흡입을 제공한다. -80 kPa의 (게이지 압력)의 진공 펌프의 작동 압력을 사용합니다. <ol><li> 또한, 수동으로 한 방울 완전히 혼합으로 공기 흡입을 제어 할 수 있습니다. 손으로 연결하거나 시험의 초기 단계에서 튜브 진공 펌프 및 공기 챔버의 입구를 분리합니다. </li></ol></li><li> 솔레노이드 밸브의 제어 시스템을 사용하여 3 분 동안 혼합 효율을 향상시키기 위해 앞뒤로 합체 액적 롤의 공기 흡입을 제어한다. 타겟 DNA와 AuNP 프로브는 잘 혼합하여 3 분 이내에 혼성화된다. 각각의 구동 주파수 및 5 Hz에서 -80 kPa의 (게이지 압력)의 작동 압력을 사용한다. </li><li> NH 2 OH (2 μL, 400 mM)을하고 HAuCl를 함유하는 액 적을 배치공기 방울 조작 플랫폼의 소수성 영역 4 (2 μL, 25.4 mm)이다. </li><li> 방울이 서로 병합 충돌 있도록 공기 흡입구 (-80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. 이어서 전후로 합체 액적 롤 1 분간 혼합 효율을 향상시킬 수 있도록 상기 공기 흡입관 (5 Hz에서 -80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. </li><li> 측정 및 육안 합체 방울의 색을 기록한다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜에서는 간단한 비색 방법은 MNP는 0.11-0.50 μM에서의 microcentrifuge 튜브 범위의 농도에서 구현 될 수 감지. 또한, 제안 된 MNP 검출 방법은 DNA 스크리닝 및 기타 생물 의학 응용에 대한 높은 가능성을 가지고 공기 방울 조작 플랫폼에서 수행된다. 실제로, 샘플 DNA 농도의 검출 범위는 운영 플랫폼의 혼합 효율에 의존한다. 합체 물방울이 완전히 혼합되도록하려면,이 프로토콜의 중요한 단계?...

DNA 서열에서 단일 염기쌍 차이 인 단일 염기 다형성 (SNP)는 가장 흔한 유전 적 변이의 하나이다. 현재 연구의 SNP는 질병 위험, 약제의 효능 및 유전자 기능에 영향을주지하여 개인의 부작용과 연관되어 있음을보고한다. 1, 최근의 연구는 2 차원 또는 다중 점 돌연변이 (멀티 염기 다형성) 특정 질환 및 개별 원인 밝혀 질병의 효과의 차이. 3,4- 염기 다형성의 검출은 질환의 사전 선별 때문에 필수적이다. 서열 - 특이 적 올리고 뉴클레오티드의 신속한 검출을위한 간단하고 효율적인 방법은 매우 지난 20 년에 개발되었다. 등 프로브 고정화, 형광 라벨, 겔 전기 영동을 포함한 절차를 일반적으로 DNA 돌연변이를 식별 포함하는 1,5 현재 접근, 6,7 그러나 이러한 방법은 일반적으로 expen 긴 분석 과정을 필요로시브 장비, 잘 훈련 된 기술자, 샘플 및 시약의 중요한 소비. 체적 고유의 물리 화학적 성질에 대한 표면적의 비율이 큰 나노 입자와 특정 바이오 마커에 대한 고감도 저렴 검출 플랫폼으로서 적합한 물질이다. 금 나노 입자 (AuNP)는 널리 올리고 뉴클레오티드 프로브를 수정할 때문에 큰 능력의 DNA의 검출을 위해 사용된다. 8-10 SNP 검출 기술도 AuNP을 사용하여 개발 하였다. 11-13 본 연구에서 우리는을 검출하는 신규 한 측색 방법을 채용 다 염기 다형성 (MNP) AuNP 프로브 DNA 혼성화 - 매개 성장으로. (14)이 간단하고 빠른 프로빙 방법이 이론에 기초하는 접합 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 또는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 가변 길이 AuNP의 성장의 크기 및 형상에 영향을 AuNP (도 1 참조). 15 DNA 검출이 방법을시약의 작은 소비, 작은 분석 기간 (몇 분), 임상 진단 및 국내 의료 검진에 대한 전향 적으로 적용 열 제어없이 간단한 절차를 제공합니다. DNA의 감도, 검출 한계 및 특이성을 개선하기 위하여 실험 프로토콜을 대규모 장치의 적은 부분을 필요 전통적인 실험 프로토콜 진화 16 그러한 마이크로 유체 시스템 및 단순화 된 상기 DNA 서열을 검출하는 방법에는 여러 미세 유체 시스템은 개발되어왔다 바이오 센서. 마이크로 유체 시스템의 DNA 검출 방법은 여전히 이종 SNP를 식별하는 하나의 판독을 위해, 그러나, 신호 증폭 및 형광 판독기 같은 PCR (중합 효소 연쇄 반응)과 같은 후속 처리의 계기 장치를 필요로한다. (17, 18)를 간단한 개발 이후의 처리없이 플랫폼 직접 멀티 염기 다형성의 결과를 판독매우 바람직하다. 비교 잘 사용에, 종래의 미세 유체 시스템을 폐쇄, 미세 유체 장치가 유망 같은 명확한 광경, 샘플에 액세스 할 수있는 쉬운 방법, 직접 환경 접근성과 더 용이하게 형성 캐비테이션 또는 계면 방해의 여러 장점을 제공하는 오픈 표면 채널. 19 우리의 이전 작품은이있는,이 플랫폼, 방울 동시에 수송과 흡입력을 이용하여 구동 에너지로부터 간섭을받지 않고 조작 할 수 있습니다에 오픈 표면의 물방울 조작 (그림 2 참조). (20)에 대한 간단한 공압 플랫폼을 도입 생물 및 화학 분야에서 큰 잠재력. 이 공기 플랫폼 따라서 AuNP 프로브 DNA 혼성화 매개 성장의 개념을 사용하여 비색 방법과 조합 MNP 감지 DNA 샘플의 조작을 수행하는 데에 이용 하였다. 이 논문에 제시된 프로토콜 설명오픈 표면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성의 단순한 시각적 감지. 이 작품은 멀티 염기 다형성 (polymorphism)이 육안으로 감지 할 것을 확인; 제안 된 공기 플랫폼은 생물학적, 화학적 응용 프로그램에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>benchtop engravers</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>laser cutting machine</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment system</td><td>Femto Science Inc. Korea</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>solenoid valve</td><td></td><td></td><td>home built</td></tr><tr><td>vacuum pump</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP solution</td><td>TAN Bead Inc., Taiwan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (with 5&#039;-end labeled thiol)</td><td>MDBio, Inc., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>UniRegion&amp;nbsp;Bio-Tech,. Taiwan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>J. T. baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine solution (NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Chloroauric acid (HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td><td>VM-2000</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

다 염기 다형성 (MNP)를 검출하는 간단하고 시각적있어서 열린면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 행 하였다. 비색 DNA 검출이 접근 방식은 금 나노 입자 프로브 (AuNP 프로브)의 하이브리드 매개 성장을 기반으로했다. AuNP의 성장의 크기와 구성은, 프로브와 하이브리드 DNA 샘플의 수에 의해 지배된다. 나노 입자의 형상 및 크기 - 특정 의존의 광학 특성에 기초하여, 프로브에 샘플 DNA 절편의 미스 매칭 수를 판별 할 수있다. 시험은 각각 시약 및 샘플 DNA를 함유하는 물방울을 통해 수행하고,가요 성 PDMS 계 소수성 멤브레인의 제어 공기 흡입 반송 및 공압 플랫폼에서 혼합 하였다. 물방울은 어떤 측면 EFF와 높은 생체 적합성 인 제안 공압 플랫폼에 오픈 표면에 동시에 정확하게 전달 될 수있다액적 내부 DNA 샘플 요법. 두 방식들을 제안 결합 다중 염기 다형성 공기 방울 조작 플랫폼 시야에서 검출 될 수있다; 추가 장비가 필요하지 않습니다. 최종 결과에 플랫폼에 방울을 설치에서 절차는 기존의 방법보다 훨씬 적은보다 5 분 걸립니다. 또한,이 결합 MNP 검출 방식은 매크로 시스템에 비해 현저하게 작다 각 연산에 ​​10 μL의 샘플 용적이 필요하다.

본 연구에서는 세 개의 DNA 샘플을 AuNP 프로브의 DNA 혼성화 매개 성장을 통해 검출하는 간단하고 신규 한 방법을 사용하여 시험 하였다. 프로브 DNA와 삼가지 DNA 샘플의 순서는, 특히, cDNA를 프로토콜의 1 단계에 나와있는, TMDNA (세 염기쌍 일치하지 않는 DNA) 및 SixMDNA (여섯 기본 쌍 일치하지 않는 DNA)을 (완전히 보완 DNA를 조사하기 위해). 여기서 테스트 DNA 샘플을 프로브에 불?...

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다.

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K 조회수.  National Taiwan University.  이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다. 

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

유전학

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, along with a thermoplastic elastomer (TPE) microfluidic droplet generation device. Epigenetic markers are used for WBC&#160;subtyping which is of important prognostic value in different diseases. This is achieved through the quantification of DNA methylation patterns of specific CG-rich regions in the genome (CpG loci). In this paper, bisulfite-treated DNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) is encapsulated in droplets with mdPCR reagents including primers and hydrolysis fluorescent probes specific for CpG loci that correlate with WBC sub-populations. The multiplex approach allows for the interrogation of many CpG loci without the need for separate mdPCR reactions, enabling more accurate parametric determination of WBC sub-populations using epigenetic analysis of methylation sites. This precise quantification can be extended to different applications and highlights the benefits for clinical diagnosis and subsequent prognosis.

Epigenetic markers are used for white blood cell (WBC) subtyping through the quantification of DNA methylation patterns. This protocol presents a multiplex droplet polymerase chain reaction (mdPCR) method using a thermoplastic elastomer (TPE)-based microfluidic device for droplet generation allowing for precise and multiplex methylation-specific target quantification of WBC differential counts.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

생물학

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62607">Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.&#160;

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

PCR Techniques

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Source: Kahyo, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58199">Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

Source: Kahyo, T., et al. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the ...

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

Source: Bonner, E. R. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59721" target="_blank">Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

Source: Bonner, E. R. et al. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

요약

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microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

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혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

디지털 핵산 정량 분석 실험의 단순 대량 판독

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