Name: rapid molecular detection and differentiation of influenza viruses a and b
Uploaded: 2017-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
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We thank the Clinical Microbiology Service staff of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center for help in collecting clinical specimens. This study was supported in part by a research agreement between MSKCC and Alere Scarborough (SK2013-0262).

윤리 선언문 : 사용 왼쪽 위에 임상 검체 승인 기념 슬로안 케터링 암 센터 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 준수합니다. 1. 분석을 실행하기 전에 참고 : 인플루엔자 A와 B의 분석은 비 인두 면봉 표본과 바이러스 성 전송 매체에 저장 인두 면봉 승인. 면봉은 키트에 포함되어 있으며 최적의 성능을 위해 사용되어야한다. 그러나, 레이온, 발포체, 또는 폴리 에스테르 솜 비강 면봉 또한 비강 면봉 샘플을 수집하기 위해 사용될 수있다 플록. <ol><li> 비강 면봉 샘플을 수집하려면, 가장 눈에 띄는 배수가 또는 가장 혼잡 콧 구멍에 면봉을 삽입합니다. 저항이 충족 될 때까지 부드럽게 회전으로, 콧 구멍에 면봉을 누르고 천천히 콧 구멍에서 제거하기 전에 비강 벽에 여러 번 회전합니다. 면봉을 저장하고 바이러스 전송 매체 (VTM) 3 ㎖를 포함하는 유리 병에서 그들을 수송. 참고 :주의 깊은 관심 appropr하기늦었 표본 수집은 잘못된 결과를 얻을 수 있습니다 부적절한 표본 컬렉션으로주의해야한다. 참고 : 면봉 표본이 수집 한 후 가능한 한 빨리 테스트해야합니다. 단, 최대 2 시간 동안 실온에서 저장 또는 검사가 바로 사용할 수없는 경우에는 최대 24 시간 동안 2-8 ℃로 냉각 될 수있다. 갓 수집 된 표본은 최적의 테스트 성능에 이상적이다. 부적절한 시료 처리, 저장 및 / 또는 전송 잘못된 결과를 산출 할 수있다. 참고 : 예방 조치로,이 테스트를 수행하는 개인 표본을 처리 할 때 보편적 인 예방 조치를 수행하여 잠재적으로 감염 모든 표본을 처리해야합니다. </li><li> 시험 전에 실온에 모든 샘플을 가져와. 주 : 모든 시험 성분을 하나만 사용하기위한 다수의 테스트를 수행하는 데 사용되어서는 안된다. 다른 로트 번호의 키트 구성 요소를 함께 사용하지 마십시오. 자신의 유효 기간이지나 키트 시약을 사용하지 마십시오. </li><li> ROO에 파란색 샘플 수신기를 가져와시험 전에 m 온도. 오렌지 시험 기재를 실온으로 가온 할 필요없이 테스트 될 수있다. </li><li> 때까지 즉시 사용하기 전에 호 일 포장에있는 모든 시험편을 둡니다. 악기의 측면에있는 전원 버튼을 눌러 기기를 켭니다. 사용자 ID 입력하고 Enter 키를 누릅니다 &#39;OK를.&#39; </li></ol> 2. 테스트 실행 <ol><li> 테스트 프로세스를 시작하려면, 기기 화면에 &#39;테스트 실행&#39;을 누릅니다. 온 스크린 키보드 또는 바코드 스캐너를 눌러 사용하여 환자 ID를 입력 후 확인을. &#39; 뚜껑을 열고 오렌지 시험베이스 홀더에 오렌지 시험베이스를 삽입합니다. </li><li> 정확한 테스트가 화면을 누릅니다에 표시되어 있는지 확인 &#39;OK.&#39; 파란색 샘플 수신기 홀더에 파란색 샘플 수신기를 삽입합니다. 참고 :이 올바른 작동 온도에 도달 용출 버퍼를 방지하고 테스트 성능에 영향을 미칠 수 있으므로 기기에 배치하기 전에 샘플 수신기를 열지 마십시오. </li&gt; <li> 샘플 수신기가 준비가 될 때까지 기다립니다. 악기에 연결되면, 호일 씰을 제거하고 샘플 수신기로 시험 할 환자 면봉을 배치합니다. 참고 : 호일을 제거 할 때 제자리에 남아 있는지 확인하기 위해 샘플 수신기의 가장자리에 두 손가락을 놓습니다. </li><li> 적극적으로는 면봉의 표본을 제거하는 데 도움을 혼합으로 샘플 수신기가 측면에 면봉 머리를 누르면 10 초 동안 액체에 면봉을 섞는다. 를 눌러 &#39;확인&#39;을 진행한다. 바이러스 운반 매체에 저장된 테스트 면봉은 10 초 동안 와동 VTM 경우 샘플 수신기 200 μL를 추가한다. </li><li> 파란색 샘플 수신기에 흰색 전송 카트리지를 누릅니다. 주황색 표시등이 상승 할 때까지 샘플 수신기 눌러 계속합니다. </li><li> 들어 올린 다음 테스트베이스에 전송 카트리지를 연결합니다. 카트리지 전송이 올바르게 연결되면 주황색 표시 등을 관찰 내려. 뚜껑을 닫고 &quot;테스트 완료&quot;될 때까지 열지 마십시오메시지가 화면에 나타납니다. </li></ol> 3. 품질 관리 <ol><li> 홈 화면에서 &#39;실행 QC 테스트&#39;를 터치합니다. 품질 관리 테스트를 선택 실행합니다. &#39;확인&#39;을 터치하고 화면에 테스트를 완료하라는 메시지에 따라 시험을위한 품질 관리 샘플과 일치하도록 시험 유형을 확인합니다. </li></ol> 4. 결과 해석 <ol><li> 테스트 실행이 완료된 후, 인플루엔자 A, B, 알 아형의 존재를 해석하여 화면에 표시된 시험 결과를 관찰한다. 유효하지 않은 결과를 테스트를 반복합니다. </li></ol> 5. 유지 보수 및 청소 <ol><li> 악기와 70 % 에탄올 또는 10 % 표백제 용액으로 매일 주변 벤치 영역을 청소합니다. 청소 젖은 보풀이없는 천으로 세정 용액을 스프레이. 악기에 직접 솔루션을 붓지 마십시오. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

인플루엔자 바이러스는 이환율과 사망률의 중요한 세계적으로 원인입니다. 인플루엔자의 신속하고 정확한 진단은 호흡기 시즌 동안 독감 발생을 관리하는 주요 열쇠 중 하나입니다. 기타 항원 - 기반 테스트 신속하고 수행하기 쉽다; 그러나, 낮은 민감도 (13)를 갖는다. 한편, 기존의 분자 테스트는 감도를 향상,하지만 수행하고 더 비용이 많이 드는 더 많은 경험 실험실 기술자를 필요로하고있다. 이 연구 및 프로토콜에 기술 된 인플루엔자 A와 B 분석은 기술이 우리가 보여 인플루엔자 바이러스 A와 B의 검출 및 분화에 대한 등온 증폭을 기반으로 인플루엔자 A와 B에 대한 CLIA-면제, 빠른 분자 테스트입니다 대표적인 결과는 또 다른 분자 계 패널 호흡 분석과 비교하여 평가 하였다 보관 냉동 NPS VTM 샘플의 패널의 인플루엔자 A와 B 분석법의 성능을 입증한다. T 값을 갖는 시편 많았다. 상기 분석은 인플루엔자 바이러스 90.2 % 민감도 98.1 % 특이성와 검출을 통해 인플루엔자 바이러스 B의 검출을위한 개선 된 성능을 가졌다. 여기서의 결과는 이전에 발행 된 문헌 26, 27, 28과 일치한다. 이 연구는 두 가지 중요한 제한이 있습니다. 먼저 샘플을 테스트하기위한 플랫폼 VTM에 보관 하였다. 그러나, 샘플이 시험되는 시간에 플랫폼이 샘플 타입 FDA 승인을하지 않았다. 따라서, VTM에 희석은 감소 할 수있다낮은 역가 VTM 시료의 검출. 둘째, 인플루엔자 A 및 B 시험 분석 된 시료는 RP 테스트 반면 시험 전에 그들이 수신 된 직후에 새로운 시험편 행해졌 6~9 달 동안 -70 ℃에서 보관되었다. 이 시료를 냉동하는 상기 샘플 인플루엔자 검출을 저감하는 것이 가능하다. 인플루엔자 A &amp; B의 분석은 몇 가지 단계를 가지고 수행 할 수 간단하다. 그러나, 적절하게 완료해야하는 두 가지 주요 단계는 그들이 오류가 발생할 경우 사용자가 문제를 해결할 수있다. 처음에 분석을 설정할 때 제자리에 클릭 할 때까지 첫째, 전송 카트리지는 시험베이스에 연결되어 있어야합니다. 이 두 가지가 적절히 확보되어 있지 않으면 실행이 실패하고 처음부터 반복 될 필요가있을 것이다. 둘째, 악기 전에 샘플을 추가로 2 분 동안 예열 할 필요가있다. 이 워밍업 시간 후 사용자는 샘플을 추가 전송 C를 연결하는 30 초를시험베이스에 artridge, 뚜껑을 닫습니다. 이 단계가 완료되기 전에 시간이 경과하면 기기는 실행을 실패하고 설정 한 샘플은 처음부터 반복해야합니다. 분석의 한계가 약간 호흡 패널에 비해 시간 및 낮은 민감도에 손을 확대 부착 포함 또한 인플루엔자 A. 부속 유형하지 않는 분석에 사용될 수있는 유일한 표본 유형 인두 면봉 또는 저장되는 NPS는 바이러스 전송 매체; 이러한 하부 호흡기 시험편 같은 다른 표본 타입에 대한 분석의 성능은 평가되지 않았다. 이 프로토콜의 모든 단계가 중요한 것이 중요합니다. 로 작성된 프로토콜에서 수정 또는 편차는 낮은 성능이나 분석의 결과 수 있으며, 사용자에 의해 평가해야합니다. 이 기술의 장점은 심지어 기술 불구하고, 수행하는 15 분 소요되며, 장비가 작은 풋 프린트를 가지고 있다는 것입니다분자 방법을 기반으로 수행하기 위해 특별한 훈련이나 자격을 필요로하지 않습니다. 본 연구에서 평가 된 인플루엔자 A 및 B 분석은 인플루엔자의 진단 RIDTs 대안이 될 가능성이있다. 상기 시스템은 짧은 전체 테스트 시간의 장점을 가지고있는 작은 풋 프린트를 가지며, 사용하기 쉽다. 전반적으로, 장비의 설계는 현장 진료 시험하기에 적합하다.

인플루엔자 바이러스 감염은 질병률과 사망률 매년 1, 2, 3 상당량 초래한다. 복잡하지 않은 인플루엔자는 발열, 근육통, 두통, 비 생산성 기침 4, 5로 헌법과 호흡기 증상을 특징으로한다. 기본 동반 질환과 이전 개인, 어린이, 면역 저하 환자, 환자는 폐렴, 심근염, 중추 신경계 질환 또는 사망 6, 7과 같은 심각한 합병증에 대한 높은 위험이 있습니다. 인플루엔자 감염은 질병 심각도와 길이 8을 줄일 수 있습니다 증상 발현 48 시간 이내에 항 바이러스 치료의 메시지 관리에 다른 호흡기 바이러스에서 유일하다. 인플루엔자의 신속한 식별도있다불필요한 항생제 (9) (10)의 사용을 줄이기 위해 도시. 또한, 인플루엔자 감염 입원 환자는 적절한 감염 관리 예방 조치와 격리 된 방에 배치해야합니다. 임상 인플루엔자 구별하기 그러나, 비 인플루엔자 바이러스로 인한 호흡기 질환이 어려울 수있다. 이러한 이유로, 인플루엔자 신속하고 정확한 진단 시험은 임상 환자의 관리를 위해 매우 중요하다. 여러 분석은 검출 및 인플루엔자 바이러스의 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 그들이 사용하고, 15 분 11 12 30 내 결과를 제공하는 간단한 때문에 신속한 인플루엔자 항원 검출 검사 (RIDTs)은 광범위 치료 시점 시험으로 임상에서 사용된다; 그러나, 그 감도가 크게 (10-80%) 제조사 및 인구에 따라 시험되는 변화와 인플루엔자 타입 subtyPE 13, 14, 15. 직접 형광 분석법 (DFAS)는 RIDTs 위에 우수한 감도를 제공하지만, 처리 시간이 더 (~ 3 시간)이며, 숙련 기술자 (16), (17)에 의해 완료되어야한다. 바이러스 성 문화는 인플루엔자 진단을위한 황금 표준되었습니다 모두 RIDTs 및 DFAS 18 감도를 향상되었습니다. 그러나, 인플루엔자 바이러스 성 문화는 환자 관리 19 원조에 자사의 유틸리티를 감소, 완료 2-14 D에서 걸릴 수 있습니다. 마지막으로, 핵산 증폭 검사 (NAAT)는 인플루엔자 진단에 새로운 골드 표준으로 배양 기술을 대체하고있다. NAAT는 몇 시간 인플루엔자를 검출하는 가장 큰 감도를 갖는 것으로 간주된다. 그러나 NAAT 가장 비싼 분석하고 5를 수행하는 특수 장비 및 기술자가 필요 <s업&gt; 20, 21, 22, 23, 24, 25. 여기에 설명 된 인플루엔자 A와 B 분석은 쉽게 사용할 수있는 첫 번째 CLIA-면제 분자 빠른 독감 테스트입니다. 이 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 적 프라이머와 등온 증폭을 사용하는 칼자국을내는 효소 증폭 반응 (NEAR)을 이용하여 작동합니다. 이 분석은, B에서 인플루엔자 A 차별화 설정하고 하나의 샘플을 처리하는 데 2 ​​분을 필요로하며, 완료하는 데 15 분 총이 필요합니다. 여기, 우리는 인플루엔자 A &amp; B 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 또, 샘플 데이터 (바이러스 전송 매체에 저장 보관 된 시편 인두 면봉 (NPS)의 상기 인플루엔자 A 및 B의 성능 분석을 비교 VT 세트 제공다른 호흡기 병원체 패널 분석에 M).

<table><tbody><tr><td>Alere i Instrument</td><td>Alere</td><td>NAT-000 (Global), NAT-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Influenza A &amp;amp; B 24 Test Kit</td><td>Alere</td><td>425-000 (Global), 425-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Barcode Scanner</td><td>Alere</td><td>EQ001001</td><td></td></tr><tr><td>Alere Universal Printer</td><td>Alere</td><td>55115 (Global), alereiprinter&amp;nbsp;(US)</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l precision pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l disposable pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viral transport medium</td><td>Remel</td><td>M4-RT</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid molecular detection and differentiation of influenza viruses a and b

인플루엔자는 인간 인플루엔자 바이러스 A 및 B에 의한 전염성 호흡기 질환이며 질병률과 사망률 매년 상당한시킨다. 인플루엔자 A 및 B의 분석은 제 CLIA - 면제 분자 빠른 감기 시험 유효했다. 인플루엔자 A와 B 테스트는 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 사용하여 작동합니다. 여기에, 냉동에 인플루엔자 (A)의 성능과 B의 분석은, 호흡 패널 분석 비교 하였다 표본 바이러스 수송 배지 (VTM)에 저장된 비 인두 면봉 (NPS)를 보관. 인플루엔자 A 및 B 시험의 성능은 호흡 패널 기준있어서 결과를 비교함으로써 평가 하였다. 총 인플루엔자 바이러스 A에 대한 민감도는 67.5 % (95 % CI (CI), 56.6-78.5)이었고, 특이도는 86.9 % (CI, 71.0-100)를했다. 인플루엔자 바이러스 B 테스트에 대한 민감도 및 특이도는 90.2 %였다 (CI, 68.5-100각각)와 98.8 % (CI, 68.5-100). 이 시스템은 완벽하게 통합 된, 폐쇄, 소형 풋 프린트 시스템에서 실행되는 다른 현재 사용 가능한 분자 분석 및 간단한, 피펫없는 절차보다 훨씬 짧은 테스트 시간의 이점이있다. 전반적으로,이 연구에서 평가 된 인플루엔자 A와 B의 분석은 현장 진료 신속 인플루엔자 진단 검사의 역할을 할 가능성이있다.

본 연구에서는 보관 NPS 표본은 2013 NPS 시편 3 ㎖에 제출 된 2012년 12월 15일 3 월 1 일 사이에 인플루엔자 발생시 메모리얼 슬론 - 케터링 암 센터 (MSKCC)에서 독감 같은 증상으로 제시 입원 환자에서 수집 VTM의 및 연구 기간 동안 인플루엔자 A, A-1, A-3, B를 포함하는 호흡기 바이러스 (RP)의 패널을 검출하는 분자 분석과 일상적인 임상 실습의 일환으로 테스트 3,675 NPS 표본은 제출 된 테스트를 위해 MSKCC 임상 실험실. 그 표본, 45, 425, 37, 77의 각각 RP로, A-1, A-3, A--않은 subtypable (Au),은 및 B를 인플루엔자 양성 반응 바이러스. 360 긍정적 인 표본, 인플루엔자 아형 각각 40 샘플, 37 금의 총. 또한, 직전 또는 포지티브 각 시료 후에 실험실에 도착 1-2 네가티브 샘플은 후속하는 전기 및 전자 테스트를 위해 선택되었다인플루엔자 A 및 B와 ng를 분석. 총, 인플루엔자 A 및 B의 분석은 79 인플루엔자 바이러스 A, 37 인플루엔자 바이러스 B, 240 음극, 4 잘못된 결과 (내부 제어 실패) (표 1)을 검출. RP 만에서 인플루엔자 A에 긍정적이 만 B 분석에 긍정적 인 44 샘플 (46) 불일치 결과가 있었다. 세번째 분자 계 인플루엔자 분석법 43분의 33 감지 44 불일치 시편에 수행 (8 인플루엔자 바이러스 A, (21)의 Au, 2 인플루엔자 바이러스 B) 된 RP가 양성인 및 0/1 양 (인플루엔자 바이러스 A) 인플루엔자 A 및 B에 의해 분석. 둘 이상의 분석법 간의 계약은 정확히 식별 여겨졌다. 전체 인플루엔자 바이러스 A의 인플루엔자 A와 B 전체적인 분석 민감도 (95 % CI (CI), 56.6-78.5) 67.5 %였다. 인플루엔자 A는 아형에 대한 민감도는 A-1, 84.6 % (CI, 58.5-100), A-했다<html> (3), 90.2 % (CI, 62.8-100), 및 금, 21.9 % (CI, 19.6-24.1). 인플루엔자 바이러스 A에 대한 전반적인 특이도는 86.9 % (CI, 71.0-100)를했다. 인플루엔자 바이러스 B 테스트의 경우, 민감도와 특이도는 각각 90.2 % (CI, 68.5-100)와 98.8 % (CI, 68.5-100)를했다. (그림 1) 전반적으로, 불일치 결과 표본의 평균 CT 값이 조화 된 결과 (p&gt; 0.000 16.4 ± 0.48 대 25.7 ± 0.51)에 대해 얻어진 것보다 유의하게 높았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54312/54312fig1.jpg" /> 그림 1 : 각각 각 인플루엔자 아형에 대한 분석에 의해, 긍정과 부정했다 샘플 RP 분석에 의해 결정 평균 CT 값. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001.1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54312/54312table1.jpg" /> 표 1 : VTM에 인플루엔자 A &amp; B의 성능은 기준 결과와 비교 시편.

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Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

rapid-molecular-detection-differentiation-influenza-viruses

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K 조회수.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center.  우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다. 

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

생체공학

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

호흡기 바이러스 검출을 위한 멀티플렉스 RT-qPCR 분석

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

저자 스포트라이트: 호흡기 바이러스의 다중 검출 발전 

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...