Name: a rapid strategy for the isolation of new faustoviruses from environmental samples using vermamoeba vermiformis
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
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1. 샘플 컬렉션 <ol><li> 서로 다른 환경과 지역의 70 샘플을 수집합니다. 세인트 피에르 드 Meyzoargues (프랑스), 마르세유 (프랑스) 파크 Borély의 호수에서 15 샘플의 마을에서 5 더러운 물 샘플,이 경우, 다음을 사용 (15) 바다 물 25 강 물 샘플 알프스 (프랑스)에서 마르세유 Samena (프랑스)에서 바위 입구에서 퇴적물과 샘플, 그리고 마지막으로, 라 시오타의 하수에서 10 샘플 (프랑스). </li><li> 어떠한 처리없이 실온에서 1 분 동안, 접종 전에 균질화 소용돌이 샘플. </li></ol> 2. 격리 절차 <ol><li> 블라인드 문화 절차 및 샘플 예방 접종에 대한 준비 호스트 <ol><li> 사용 V. 공동 배양을위한 세포 지원과 같은 vermiformis (주 CDC19). </li><li> (프로테아제 - 펩톤 - 효모 추출물 포도당 매체의 30ml를 가진 75cm 2 세포 배양 플라스크에, PY를 28 ° C에서 아메바를 유지지). 표 1에 PYG 구성을 확인하시기 바랍니다. 참고 : 48 시간 후, 아메바는 정상적인 카운트하여 카운트 슬라이드 (예 Kovaslides)에 의해 정량화된다. </li><li> 10 분 동안 720 × g으로 원심 분리하여 5 × 5 6 세포 / ㎖, 펠렛 아메바 (10)의 농도로 세포를 수확. </li><li> 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 멸균 페이지의 amoebal 식염수 (PAS) 표 1의 30 ml의에서 아메바 펠렛을 다시 일시 중지합니다.이 세정 절차를 반복합니다. </li><li> 약 106 아메바 / ml의 농도의 항생제 및 항진균제 혼합물 기아 배지 30 ㎖에서 아메바를 다시 일시. 기아 매체는 encystment 또는 곱셈없이 살아 남기 위해 그것을 가능하게하는 아메바에 대한 생존 매체입니다. 표 1의 구성을 확인합니다. 주 : 항균제 혼합물은 10 μg의 / ㎖ 반코마이신 10 μg의 / ㎖ 이미페넴, 20 μg의 / ㎖ 시프로플록사신, 20 μ 포함g / ㎖ 독시사이클린, 20 μg의 / ㎖ 보리 코나 졸. 이 조합은 감소 또는 바이러스 증식을 변경할 수 있습니다 세균과 곰팡이 오염을 줄이기 위해 봉사했다. </li><li> 직접 습한 환경이 포함 된 가방 안에 젖은 압축을 배치하는 구성 (아메바의 준수를 선호하는 96 웰 플레이트 평평한 바닥에 200 μL의 아메바 단일 층에 각 샘플의 25 μl를 접종하고 습한 환경에서 30 ° C에서 부화 )의 증발을 방지하기 위해 판. 이 프리모 문화입니다. 모든 샘플 접종없이 아메바의 두 우물을 남겨; 이는 음성 대조군으로 작용한다. 사흘 동안이 프리모 문화를 품어. </li><li> 사흘 첫 번째 접종, 하위 문화 모든 현미경 관찰하지 않고 상기 한 바와 같이 신선한 아메바에 프리모 문화 판 후. 프리모 배양과 동일한 조건 하에서 3 일 동안 새로운 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 배양이 세 번째 일 후와 동일한 방법으로 최종 배양을 수행전자 primo- 및 하위 문화. 이틀 동안 최종 문화를 품어. 그런 다음 검출로 진행합니다. </li></ol></li><li> 자동 유동 세포 계측법에 의해 용해의 검출 참고 : 흐름과 함께 시각 장애인의 문화는 세포 계측법 분리의 이전 표준 시스템 다르다. 그것은 더 민감한 정밀하고 자동화합니다. 검출 목적을 위해, 우리는 높은 속도 및 현미경 관찰없이 용해를 검출하기 위해 개발 된 새로운 기술을 적용 하였다. 이 기술은 검사 샘플 유리하고 이전 기술보다 더 나은 감도를 가지고있다. 7-9 <ol><li> 용해를 검출하는 최종 공동 배양 96 웰 플레이트를 사용한다. </li><li> 세포 계측기의 전원을 켜고 제조 업체의 프로토콜에 따라 낮은 소음을 얻기 위해 깨끗하고 세정주기를 실행합니다. </li><li> 높은 처리량 샘플러 사이토 자동으로 96 웰 플레이트에서 샘플을로드하고 accordin 40 분 이내에 완전히 자동화 된 수집을 수행하는 흐름과 결합 (HTS)을 실행제조 업체의 프로토콜 g. </li><li> 다음과 같이 HTS를 설정 : 샘플 볼륨을 150 μl를, 볼륨 50 μl를 혼합 속도 (180), 혼합 (5)의 수를 혼합, 각 시료 400 ㎕를 사이에 세척 볼륨, 속도 2.5 μL / 초, 기록 된 이벤트 만의 수를 흐른다. </li><li> 게이트에 제 위해 아메바 인구 최종 공동 배양 마이크로 플레이트의 음성 대조군 웰을 평가하고 그 물리적 특성에 따라 이러한 셀 호스트의 비율을 결정한다. 균일 한 아메바 인구와 파편과 소음에 해당하는 낮은 이벤트의 두 번째 인구를 가지고해야합니다. 참고 :이 게이팅 절차는 앞으로 산란에 의해 예상 크기에 의해 하나의 세포에서 세포 내 파편과 덩어리를 구분합니다. 정확하게 최상의 게이팅 방법을 이용하여 각각의 인구의 비율을 결정하는 것이 중요하다. 이 비율은 원생 동물의 많은 유형을 사용하는 경우 특히, 다를 수 있습니다, 그래서 그것은 negativ을 가지고 항상 중요하다샘플의 나머지 기준 인구로서 사용될 수있는 전자 제어. </li><li> 취득 샘플을 클릭하여 게이트를 시작합니다. </li><li> 10,000 건의 이상 이벤트의 수를 기록한다. </li><li> 화살표를 사용하여 관심있는 아메바 인구 지역화. 이 문을 정의하는 방법이다. </li><li> 자동으로 전체 판을 실행 게이팅 후, HTS의 자리를하자 또는 &#39;홈&#39;을 클릭하여 플레이트를 찾습니다. 크기와 구조 매개 변수에 따라 데이터 수집 및 분석을 수행 (각각, FSC (전방 산란)와 SSC (사이드 분산)). 참고 : 아메바 - 게이트 인구의 손실을 감지하는 아메바 용해에 대한 책임 병원성 에이전트의 존재를 알립니다. 바이러스 감염과 연관된 원충 용해 분석기에 의해 게이트와 신뢰성있는 음성 대조군으로 사용 된 것과 같은 비 - 감염된 인구 비교 아메바 인구의 50 %를 용해하는 임의로 설계 임계 값이 검출된다. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. 용해 감지 후 새로운 균주 특성 <ol><li> 예비 염색 자이언트 바이러스의 존재를 공개 <ol><li> 유동 세포 계측법에 의해 용해 감지 한 후, 나머지 아메바을 중단하는 용해 공동 문화를 피펫. 그런 다음 직접 10 분 동안 800 XG에서 현탁액의 50 μl를 cytocentrifuge. </li><li> 원심 분리 후, 순수 메탄올 용액과 슬라이드를 고정한다. 블루 에오신 / 아주르 및 DAPI 염색 상업적 빠른 염색을 이용하여 슬라이드를 얼룩과 바이러스 공장의 존재를 확인하기 위해 1000 배의 배율에서의 광학 현미경 하에서 관찰한다. <ol><li> 빠른 염색 들어, 제 에오신 용액에 슬라이드를 뛰어 후 인산 완충 용액으로 45 초 동안 슬라이드 린스 마지막 6 초 블루 아주르를 포함하는 제 2 고정 용액에 슬라이드 급락에 직접 전달하고, (4 초간 3 회 반복) pH가 7.2. 다음 observati로 진행, 실온에서 건조 슬라이드를 남겨주세요에. </li><li> DAPI 염색, 보증금 고정 건조 슬라이드 상에 DAPI 상업 원액의 15 μl를하십시오. 빛으로부터 보호는 관찰로 진행합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 전자 현미경 <ol><li> 슬라이드의 제 1 식별 한 후, 배양 상청을 전자 현미경으로 관찰 거대 바이러스의 존재를 평가한다. </li><li> 예금 글로우 방전 그리드 상에 긍정적 인 샘플의 5 μL. 실온에서 약 20 분 동안 기다립니다. </li><li> 거기에 10 초 동안 1 %의 몰리브덴 산 암모늄의 작은 방울을주의 깊게 그리드와 보증금을 건조시킵니다. 5 분 동안 건조 그리드를 남겨주세요. </li><li> 200 keV의에서 현미경을 전자로 이동합니다. </li><li> 홀더에 그리드를 배치; 현미경으로 홀더를 소개합니다. 해당 아이콘을 클릭하여 진공 개요를 확인합니다. 닫기 밸브는 스폿 사이즈 5에서 관찰을 시작하고, X 25,000의 배율. </li><li> ImageJ에 또는 직접를 사용하여 거대한 바이러스를 측정취득 화면에있는 현미경의 측정 도구를 사용하여 현미경 LY. 주 : 약 200 nm의 캡시드 크기로 Faustovirus 그룹으로 샘플을 분류. </li></ol></li><li> 분자 생물학 주 :이 확인 후, 분자 생물학 시험 전자 현미경 하에서 동일한 캡시드의 크기 및 모양을 갖는다 Marseillevirus에서 Faustovirus를 구별하기 위해 확인에 중요한 있었다 동일한 호스트 특이성을 갖고 있지 않는다. Marseillevirus이 Vermamoeba에 성장하지 수 있으며, Faustovirus이 Vermamoeba 날짜에 실패 같은 가시 아메바와 같은 다른 아메바에 성장하는 모든 시도에 따라 다릅니다. 설계 및 Reteno 등의 작품에 나열된 특정 프라이머 / 프로브 시스템의 응용 프로그램입니다. 바이러스 유전자의 증폭 및 염기 서열을 통해 새롭게 절연 바이러스보다 정확한 예비 분류 할 수 있었다. <ol><li> 전의제조사의 프로토콜에 따라 자동 추출 시스템을 사용하여 배양 양성 샘플에서 요로 DNA. </li><li> Reteno 등의 설명에 따라 PCR은 열 순환기를 사용하여 실시간을 수행합니다. 19 </li><li> 증폭에 사용 된 동일한 프라이머를 사용하여 시퀀스. DNA 지시 RNA 폴리머 라제 서브 유닛 1 유전자를 대상으로 프라이머를 사용 Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA의 CAT GAT GGT CAC ATA G-3 &#39;(앞으로) 및 Fstv_S2R 5&#39;-TTG CAC CTC CGC는 AGT TAA A-3&#39;(역)와 Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA 프로브. </li></ol></li></ol> 4. 바이러스 생산, 정제 및 게놈 시퀀싱 <ol><li> 엔드 포인트 희석 복제에 대한 하나의 바이러스 아메바 문화를 배양. </li><li> 제조 : PYG 30 ㎖, 10 Vermamoeba의 vermiformis ㎖의 이미 작은 플라스크에 웰로부터 전송 절연 바이러스 5 ㎖를 함유하는 20 플라스크를 준비한다. </li><li> 완료 될 때까지 30 ° C에서 품어아메바의 용해. 모든 아메바가 용해 될 때까지 거꾸로 광학 현미경으로 매일 관찰한다. </li><li> 완전 용해 후,받는 사람에 모든 플라스크를 풀. 파편을 제거하기 위해 0.45 μm의 필터로 필터링. </li><li> 75 분 동안 89,800 XG에서 초 원심 분리하여 정제를 시작합니다. 원심 분리를 시작하기 전에 튜브의 무게를 조정해야합니다. </li><li> 원심 분리 후, 흡인 각 튜브의 상등액을 제거하고 원심 분리를 반복하기 전에, 보정에 사용 된 것과 동일한 부피 PAS의 펠릿을 다시 일시. </li><li> 이와 같이, 상층 액을 제거하고 인산 완충 식염수 1 ㎖ (PBS)의 모든 펠릿을 다시 일시. </li><li> (0.22 μm의 필터로 여과 PBS 100ml에 수크로오스 27.5 g)의 25 % 슈 크로스를 이용하여 생성 된 바이러스를 정제. <ol><li> 자당의 8 mL 및 바이러스 현탁액 2 ㎖를 사용합니다. 1 시간 15 분 동안 89,800 XG에 원심 분리기. PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. -80 ° C에서 보관하십시오. </li&gt; </ol></li></ol>

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	<li>Raoult, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+1.2-megabase+genome+sequence+of+Mimivirus.">The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus.</a> Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).</li><li>Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+viruses+in+the+oceans:+the+4th+Algal+Virus+Workshop.">Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop.</a> Virol J. 2, 52-52 (2004).</li><li>Monier, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+mimivirus+relatives+are+probably+large+algal+viruses.">Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses.</a> Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).</li><li>Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+distribution+of+large+DNA+viruses+in+the+sea.">Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea.</a> Genome Biol. , (2008).</li><li>Claverie, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimivirus+and+Mimiviridae:+Giant+viruses+with+an+increasing+number+of+potential+hosts,+including+corals+and+sponges.">Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges.</a> J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).</li><li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+megavirome+in+humans.">Evidence of the megavirome in humans.</a> J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+characterization+of+new+environmental+giant+viruses+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ Microbiol. , (2012).</li><li>Pagnier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+improvements+in+mimiviridae+and+marseilleviridae+isolation+from+amoeba.">A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba.</a> Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+Amoeba+Viruses+with+Genomes+Up+to+2.5+Mb+Reaching+That+of+Parasitic+Eukaryotes.">Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> PNAS. , (2014).</li><li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Isolation+of+Mimivirus+in+a+Patient+With+Pneumonia.">First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia.</a> Clin Infect Dis. , (2013).</li><li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shan+virus:+a+new+mimivirus+isolated+from+the+stool+of+a+Tunisian+patient+with+pneumonia.">Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia.</a> Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).</li><li>Claverie, J. -. M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimivirus:+the+emerging+paradox+of+quasi-autonomous+viruses.">Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses.</a> Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).</li><li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+with+more+than+1,000+genes:+Mamavirus,+a+new+Acanthamoeba+polyphaga+mimivirus+strain,+and+reannotation+of+Mimivirus+genes.">Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes.</a> Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).</li><li>Claverie, J. -. M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+questions+about+giant+viruses.">Open questions about giant viruses.</a> Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).</li><li>Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Van Etten, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+really,+really+big+virus.">Another really, really big virus.</a> Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> J.Virol. , (2015).</li><li>Co&#351;kun, K. A., Oz&#231;elik, S., Tutar, L., Elald&#305;, N., Tutar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+free-living+amoebae+from+tap+water+in+Sivas,+Turkey.">Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey.</a> Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).</li><li>Bradbury, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-living+amoebae+recovered+from+human+stool+samples+in+Strongyloides+agar+culture.">Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture.</a> J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).</li><li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water.">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li><li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus.">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li><li>Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+virus+infecting+the+novel+shellfish-killing+dinoflagellate+Heterocapsa+circularisquama.">Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama.</a> Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Faustovirus이 ASFV에 가까운 새로운 Megavirales 가족의 첫 번째 구성원이 될 수 있다는 가능성을 먼저 Reteno 등., (19)에 의해 제안했지만 약간의 차이는 여전히 구별 할 수있다. Faustovirus이 Asfarviridae 가족에 가입해야할지 대신 새로운 추정 바이러스 제품군을 형성할지 여부를 명확 나타납니다. 이 문제는 추가 조사, 그 형태의 특히보다 포괄적 인 특성, 숙주 범위, 복제주기 및 유전자 레퍼토리가 필요합니다. 더 Faustovirus 유전자형을 위해 팬 - 게놈을 확장하고 더 나은이 바이러스 그룹 또는 가족의 기원과 친척을 이해하기에 격리되어야한다. 우리가 사용하는 기술은 우리가이 잠재적 인 새로운 가족의 새로운 구성원을 분리 계속할 수있었습니다. 이 기술은 잘 검출하는 농축 단계의 역할을 약간 수정 공 배양 기술과 결합된다. 후 데이터의 취득을위한 유동 세포 계측법에 의해 요구되는 시간샘플 ndreds 이전 표준 공존 배양 시스템에 비해 중요한 장점 인 반 시간을 초과하지 않는다. 9 기술은 특히 더 높은 감도와 정확한 정량의 관점에서, 기존의 표준 시스템보다 훨씬 더 낫다. 출시 70 샘플, 우리는이 바이러스의 환경 적 특이성 또는 생태계에 대한 정보를 제공 할 수있는 하수에서 두 더 Faustoviruses을입니다. 실제로, 원생 Vermamoeba의 vermiformis위한 Faustovirus의 특이성 (19)뿐만 아니라 Asfarviridae 23 중 HcDNAV 새로운 구분이 바이러스 와편 모 조류 Heterocapsa 종의 많은 균주 감염하지만 식물성 플랑크톤의 다른 유형을 감염시키는 능력이 있다는 사실이 24 제안하는 Asfarvirus 또는 가까운 친척 중 호스트 특이성의 존재. 이러한 발견은 새로운 작용 세포 지지체의 사용을 의미이러한 종류의 바이러스를 가질수 특정 또는 불특정 호스트 s가. 우리의 방법은 상이한 조건에서 원생의 다른 유형에 적응 될 수있다. 우리의 방법 마크는 바이러스 분리 및 배양 기술의 관점에서 진행. 요약하면, 가장 적절한 항균 곰팡이 혼합물 농축 단계는 모든 가능한 세균 또는 진균의 오염 제거에 매우 중요하다. 일상적인 문화에서 사용되는 PAS 매체 Vermamoeba 종에 부적절한 것으로 보인다 동안 빠른 encystment는 배양 24 시간 후에 관찰 되었기 때문에 우리의 기아 매체는, 공동 문화에 가장 적합한 조건에서 아메바를 유지하는 가장 좋은 방법이었다. 이는 이전 기술은 지금까지 실패했다 최적의 배양 조건을 향한 큰 걸음이었다. 여기에서 설명하는 배양 프로토콜을 이용하여 최상의 결과를 얻기 위하여, 탐식 할 신선한 아메바을 사용하도록 권장한다. 항생제 및 항진균제 혼합물 원생 생물 용 비 독성이어야<html> ; 따라서, 혼합물에 사용 protozoon의 생존 능력을 테스트하는 것이 좋습니다. 모든 사용 재료는 멸균되어야한다. 작품은 어떤 것 오염을 방지하기 위해 미생물 확보 후 클래스 II에서 수행되어야한다. 설명 된 바와 같이 배양 시간과 문화의 세 단계는 존중되어야한다. 유동 세포 계측법 검출하기위한 처리 시간은 연구 유기체에 따라 교정 될 수있다. 일본어 게이팅에서 인구에서 작은 변화가 관찰 될 수 있으나, 이는 참조로 사용 인구 신뢰성 대조군에 의존한다. 우리는 바이러스 &#39;곱셈을 마스킹 박테리아의 성장을 할 수있는 문화에서 찾을 수 있으며, 아메바에 대한 병원체입니다 수 있습니다 다중 내성 세균은 어떻게 든 우리의 바이러스 분리 방법을 제한 할 수 있습니다. 항생제 혼합물을 변화 혹은 때때로 이러한 제한을 관리한다 크기가 200nm 이하의 박테리아를 제거하기 위해 배양 물을 여과. &quot;&gt; 이러한 모든 적합한 조건이 더 잘 다양한 기원, 잠재적 인 병원성을 이해하는 바이러스 증식을 지원하는 새로운 최적 분리 절차.이 기술은 새로운 바이러스, 특히 Megavirales의 발견에 상당한 이점을 제공한다 제공한다.

거대 바이러스의 Megavirales 순서에 속하는 특히 이들의 발견은 완전히 입경 게놈의 복잡성의 관점에서 바이러스의 세계를 바꾸었다. 바이러스는 이전 소기업 것으로 생각하고 Mimivirus 모든 규칙을 위반 등장 하였다. 1 군 유전체학 데이터 환경에서 2-5뿐만 아니라, 인간에서뿐만 아니라 거대 바이러스의 편재를 제안한다. (6) 따라서, 여전히 필요가있다 대규모 이러한 바이러스를 검색 할 수 있습니다. 이 거대한 바이러스의 다양성이 인간의 샘플 12, 13 및 환경 시료의 다양한 선별하여, 전 세계적으로도 7-11하지만를 수생 환경의 다양성과 관련 퇴적물뿐만 아니라 샘플링하여 평가 하였다. 7,9 가시 아메바의 풍뎅이 아목의 mimivirus이었다 식세포 원생 생물, 주로 가시 아메바 종을 사용하여 공동 문화입니다. 14-16 거대 바이러스의 전체 컬렉션은 또한 다음이었다과학계는 가시 아메바 종에 대한 연구 및 격리 절차를 제한 만든이 지정된 원생 호스트에서입니다. 분명히 하나의 호스트 종에이 신뢰는 바이러스의 많은 부분이 간과되고 가져왔다. 거대 바이러스 CroV가 높은 운동성 해양 원충 카페테리아 roenbergensis 절연 있다는 사실은 17,18 새로운 계통 또는 거대 바이러스 패밀리를 발견하기 위해 원생 동물의 넓은 범위를 사용할 필요성을 나타낸다. Reteno 등은. 이전에 사용 된 적이 셀 호스트와 같은 다른 원생 동물을 선택 관리, 거대한 바이러스의 새로운 아스파 관련 계통 (새로 명명 된 Faustovirus를)입니다. (19) 이 바이러스 계통의 구성원을 확장하기 위해 새로운 Faustovirus 유전자형을 분리하기위한 시도에서, 우리는 우리의 격리 절차를 수정하고 새로운 Faustoviruses을 수확 할 수있는 환경 시료를 선별를 사용했다. 우리 다음새로운 균주의 특성을하기 위해 전체 프로토콜을 설명했다. 우리는 Vermamoeba의 vermiformis, 이미 첫 번째 Faustovirus 프로토 타입 E12. 19 현재 여전히 호스트 특정되어 Faustovirus에 대한이 원생 생물의 분리에 사용되는 인간 환경에서 발견 된 가장 일반적인 자유 생활 원생 생물, 20-22을 평가 하였다. 우리는 우리의 실험실은 아메바 용해 또는 바이러스 성장을 보였다에 더 시도가 다른 거대한 바이러스를 성장하지 있기 때문에 알려진 거대한 바이러스의 것도,이 아메바에 대한 병원성 없다는 것을 알고 있었다. 이러한 이유로 생각 V. vermiformis 새로운 Faustoviruses을 분리하는 것으로 알려져 최고의 가장 독특한 세포 지원입니다.

<table><tbody><tr><td>LSR FORTESSA cytometer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Germany&amp;nbsp;</td><td>5027/11</td></tr><tr><td>Optical inverted microscope</td><td>leica&amp;nbsp;</td><td>France</td><td>72643</td></tr><tr><td>DNA extraction</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>PYG medium, PAS, Starvation medium</td><td>In house laboratory production&amp;nbsp;</td><td>Marseille URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba strain CDC-19</td><td>ATCC</td><td>France</td><td>50237</td></tr><tr><td>Plates</td><td>Cellstar</td><td>France</td><td>655180</td></tr><tr><td>PCR materials, primers.&amp;nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>France</td><td>Primers cited in manuscript</td></tr><tr><td>glasstic slide 10 with grids</td><td>Kova&amp;nbsp;</td><td>USA</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Eosin/blue Azur-Hemacolor stain</td><td>Merck milipore&amp;nbsp;</td><td>France</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Vacuum driven filters</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline</td><td>Thermo Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>DAPI stain</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 cytocentrifuge</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Single cytology tunnel</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>France</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Carbon grids&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Ammonium molibdate</td><td>VWR internationanl&amp;nbsp;</td><td>France&amp;nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Flasks&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>Germany</td><td>833911</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters&amp;nbsp;</td><td>Milex millipor&amp;nbsp;</td><td>France</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Rapid-flow filters</td><td>Nalgene</td><td>France</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

a rapid strategy for the isolation of new faustoviruses from environmental samples using vermamoeba vermiformis

거대한 바이러스의 분리는이 거대한 바이러스가 원생 ​​생물에 관한 특히 때문에, 바이러스학의이 새로운 시대에 큰 관심이다. 자이언트 바이러스는 원생 생물의 많은 종에 대한 잠재적 병원성 수 있습니다. 그들은 Megavirales의 최근 기술 된 순서에 속한다. 하수 시료에서 분리 된 새로운 계보 Faustovirus는 포유 동물의 병원체 아프리카 돼지 열병 바이러스에 먼 관련이있다. 이 바이러스는 또한 amoebal 호스트, Vermamoeba의 vermiformis, 건강 관리 물 시스템에 공통 원생 생물에 고유합니다. 그것의 유전자형 수집을 확대하고 팬 게놈을 연구하기 위해 새로운 Faustovirus 유전자형을 분리 계속 중요합니다. 우리는 아메바 공동 배양 세균 및 진균 오염물을 방지하기 위해 항생제 및 항진균제의 조합의 사용을 개선하고 바이러스 증식을 선호하여 추가 균주의 분리를위한 새로운 전략을 개발했다. 우리는 또한 새로운 starvatio를 구현N 매체 V.을 유지할 바이러스 공동 배양을위한 최적의 조건에서 vermiformis. 마지막으로, 우리는 세포 병변 효과를 검출하기 위해, 시간 소모적 인 유동 세포 계측법보다는 현미경 관찰을 사용했다. 우리는 더 나은 자신의 환경, 호스트 특이성 유전자 내용을 이해하기 위해,이 방법의 효율성을 증명함으로써 Faustoviruses의 수집을 확대, 하수 시료에서 두 균주를 획득했습니다.

이 원고에서 공부 시스템은 두 개의 새로운 Faustoviruses을 분리하여 개념의 증거를 검증. 테스트 (70) 샘플, 용해의 두 에피소드는 우리의 신뢰할 수있는 음성 대조군 대조적으로 검출되었다. 용해에 대한 음성 대조군은 86 % 아메바 인구가 포함되어 있습니다. 대조적으로, 긍정적 인 샘플 (세인트 피에르 드 Meyzoargues에 대한 ST1)와 (라 시오타 샘플 9 LC9)는 게이트 아메바의 급격한 감소를 보였다; 아메바의 60 % 이상이 파편의 가장 높은 비율로 용해시켰다. 우리의 방법의 검출 단의이 강력한 결과를 그림 1에 표시됩니다. 에오신 / 블루 아주르와 DAPI 염색도 2에 도시 된 아메바 내부 바이러스 공장의 존재를 확인했다. 전자 현미경은 정 이십 면체의 캡시드와 Megavirales의 전형적인 모습을 보여 크기가 200 나노 미터, 및 부족 원 섬유 (그림 3). 거대한 바이러스, 유제품 특정 PCRrticularly Faustovirus에 대한 우리의 이전 연구 결과를 확인했다. 그것은 모호한 결과 또는 오염 된 아이솔레이션을 제거하기 위해 PCR에 의해 확인해야합니다. 바이러스는 생산 및 전체 게놈 시퀀싱을위한 정제, 복제되었다. 새로 격리 Faustoviruses의 게놈은 다음 Bioproject에서 제출 : PRJEB11169합니다. 제 1, primo- 서브, 최종-문화는이 바이러스의 증식을 선호하는, 더 곰팡이 또는 세균 오염을 보이지 않았다. Vermamoeba의 vermiformis는 항진균 및 항생제 혼합을 허용. 이 세 가지 일 후에, 마지막 문화가 80 % 이상 살고있는 아메바를 포함 아메바의 음성 대조군에 분명했다. Vermamoeba도 용해 후 상당한 바이러스 부하를 생성, 분리를 위해 좋은 셀 호스트를 제공했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54104/54104fig1.jpg" /> 그림 1 :. 세포 계측법 자동 유량 데이터 represen에 의해 용해 검출Faustovirus을 수확 아메바 용해을 보여 주었다 두 개의 샘플을, 마에. 살아있는 아메바 인구는 음성 대조군으로 사용 하였다. 두 게이트는 잠재적으로 세포와 파편에 대응하는 FSC-SSC 플롯으로 설계되었다. 최종 공동 배양 후에 찌꺼기 많은 인구. 게이팅 집단에는 실질적인 변화 (A)를 나타내지 않았다 음성 대조군과 비교하여 시료의 잠재적 감염의 존재 (ST1 및 LC9) (B)를 보여 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54104/54104fig1large.jpg" target="_blank">주세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54104/54104fig2.jpg" /> . 그림 2 : / 블루 아주르 염색과 DAPI 염색 네거티브를 제어합니다 V.을 보여주는 에오신 일부 거대 바이러스 일반적인 바이러스 공장 에오신 / 블루 아주르 염색을 사용 vermiformis 핵(A), 및 DAPI 염색 (D) (화살표 아메바의 핵 가리). 1000 배의 배율. (B, C) ​​: V.의 1000 배 배율에서 에오신은 / 블루 아주르 염색 vermiformis Faustovirus의 LC9에 감염. 화살표가 고리 화 감염된 아메바의 핵 가리, 바이러스 공장은 별표 (*)로 표시됩니다. V. 1000 배의 배율 (E, F) DAPI 염색 vermiformis Faustovirus의 LC9에 감염. 화살표는 8 시간 후 감염 (E), 그리고 12 시간 후 감염 (F)에서 바이러스 공장을 가리 킵니다. 스케일 바 10 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54104/54104fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54104/54104fig3.jpg" /> 그림 3 : 음성 염색 MICRograph. 20 면체의 캡시드 200 nm의 전체 크기와 Megavirales의 전형적인 모습과 새로 발견 Faustovirus을 보여주는 용해 검출 후 바이러스 서스펜션의 부정적인 염색. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54104/54104fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PYG 조성 </td><td> 수량 </td></tr><tr><td> Proteose 펩톤 </td><td> 20g </td></tr><tr><td> 효모 추출물 </td><td> 2g </td></tr><tr><td> 황산. 7H 2 O </td><td> 0.980 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 0.059 g </td></tr><tr><td> 구연산 나트륨. 이수화 </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 × 6 H 2 O </td><td> 0.02 g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 18g </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> 1 L </td></tr><tr><td colspan="2"> 염산 또는 KOH와 6.8에 산도를 조정합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 121 ° C에서 압력솥 15 분. </td></tr><tr><td> 기아 매체 </td><td> 수량 </td></tr><tr><td> 효모 추출물 </td><td> 2g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 18g </td></tr><tr><td> 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O </td><td> 0.02 g </td></tr><tr><td> PAS (아래 설명) </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> 0.22 mm에 필터링 </td><td></td></tr><tr><td> PAS의 용액 A </td><td> 수량 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.136 g </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 0.142 g </td></tr><tr><td> PAS 용액 B </td><td> 수량 </td></tr><tr><td> 황산 4 · 7H 2 O </td><td> 4.0 mg의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 2 · 2H 2 O </td><td> 4.0 mg의 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 0.120 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 각 용액 A와 B의 10 ml의 증류수 1 L에 첨가된다. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 솔루션 조리법.

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A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

7.6K 조회수.  Aix Marseille University. We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba. 

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

연구

환경과학

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

면역학 및 감염병학

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

발생학

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

유전학

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The recovery of microbial fractions, including viruses, bacteria, and microeukaryotes from wastewater and environmental water samples&#160;is one of the challenging steps in these approaches. In this study, we focused on the recovery efficiency of sequential ultrafiltration and skimmed milk flocculation (SMF) methods using Armored RNA as a test virus, which is also used as a control by some other studies. Prefiltration with 0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m membrane disc filters were applied to eliminate solid particles before ultrafiltration to prevent the clogging of ultrafiltration devices. Test samples, processed with the sequential ultrafiltration method, were centrifuged at two different speeds. An increased speed resulted in lower recovery and positivity rates of Armored RNA.&#160;On the other hand, SMF resulted in relatively consistent recovery and positivity rates of Armored RNA. Additional tests conducted with environmental water samples demonstrated the utility of SMF to concentrate other microbial fractions. The partitioning of viruses into solid particles might have an impact on the overall recovery rates, considering the prefiltration step applied before the ultrafiltration of wastewater samples. SMF with prefiltration performed better when applied to environmental water samples&#160;due to lower solid concentrations in the samples and thus lower partitioning rates to solids. In the present study, the idea of using a sequential ultrafiltration method arose from the necessity to decrease the final volume of the viral concentrates during the COVID-19 pandemic, when the supply of the commonly used ultrafiltration devices was limited, and there was a need for the development of alternative viral concentration methods.

Virus concentration from environmental water and wastewater samples is a challenging task, carried out primarily for the identification and quantification of viruses. While several virus concentration methods have been developed and tested, we demonstrate here the effectiveness of ultrafiltration and skimmed milk flocculation for RNA viruses with different sample types.

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략

요약

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