Name: microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
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이 작품은 NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH Predoctoral 교육 그랜트 5T32GM007127 (PAE) 및 NSF 대학원 연구 활동 (NAE)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 주입 프로토콜에 대한 유용한 피드백을 CRISPR 생거 시퀀싱 데이터를 생성 BAC의 recombineering 및 주사, 닉 Donde을 수행하는 케빈 Schwalbach에 감사하고, 캐서린 리 파리.

저자는 공개 아무것도 없어.

형질 전환 또는 게놈 편집 주입 한 세포 큰가시 고기의 배아는 세 가지 주요 과제를 제시한다. 첫째, 제브라 피쉬 배아를 기준으로는 큰가시 고기 배아 융모막은 힘든 종종 바늘을 깰 것입니다. 이 문제는 부분적으로 두껍고 강한 유리 마이크로 피펫을 사용하여 융모막에 수직 주입함으로써 극복 될 수있다 (프로토콜,도 2 참조). 가능한 것과 약간의 물을 확보하는 것은 배아에 추가됩?...

생물 다양성은 자연에서 진화 된 표현형 변화의 유전 개발 기지를 결정하는 발생 방법을 이해하는 하나의 기본 구성 요소입니다. 큰가시 고기 생선, Gasterosteus aculeatus는 진화의 유전 적 기초를 공부하는 우수한 모델로 떠오르고있다. 큰가시 고기과 해양 물고기가 북반구의 주위에 수많은 민물 환경을 식민지 것처럼 극적인 형태 학적, 생리 학적 결과, 많은 적응 진화 적 변화를 겪고, 그리고 한 행동 변화 1. 스물 한 큰가 집단에서 개인의 게놈 서열 조립 및 고밀도 링크 맵은 상기 조립체 2,3-을 개선하기 위해 생성되어왔다. 유전자 맵핑 실험은 진화 표현형 4 기본 게놈 영역을 식별 한 6 -, 몇 가지 경우에, 특정 후보 유전자의 기능적 역할 7,8 테스트 한. 형태 학적 변화를 기본 게놈 영역의 숫자는 유망한 후보 유전자로 확인되었다, 그러나이 후보는 아직 기능적으로 9 테스트되지 않은 - 12. 또한, 큰가시 고기과 인구 유전학 / 유전체학 (13, 14), 분화 (15), 행동 (1), 내분비학 (16), 생태 독성학 (17), 면역학 (18)와 기생충학 (19)의 연구를위한 일반적인 모델입니다. 각 필드에서의 앞으로의 연구는 큰가시 고기과의 기능 유전자 조작을 수행하는 능력에서 이익을한다. 이들 코딩 서열의 조작에 더하여, 후보 유전자의 역할은 시스 - 규정 시퀀스를 연구함으로써 기능적 증가 감소 또는 후보 유전자의 발현을 제거함으로써 평가 될 수있다. 큰가시 고기과에 미세 주입 및 형질 전환 방법은 잘 7,8,20를 설립하고 처음 사용하여 개발 하였다 meganuclease 매개방법 (21)는 첫 번째 송사리 (22)에 설명. 여기에 제시된 개질 미세 주입 방법은 모두 TOL2 매개 된 형질 전환에 최적화 최근 TALENs 및 CRISPRs 포함한 게놈 편집 시약을 개발되었다. 시스 규정하는 요소에 대한 변경 사항은 시스 규정하는 변화는 돌연변이 (23)를 코딩의 부정적인다면 발현 결과를 피할 수로, 형태 학적 진화에 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 추정 시스 규정하는 순서를 테스트하고 비교하는 진화 연구의 증가의 중심 목표되고있다. 또한, 대부분의 인간 질병 변형 심하게 시스 규정하는 기능 소자 및 로직을 연구하는데 필요한 규제 변이체 24, 25 및 모델 척추 시스템이다. 많은 수의 외부에 자신의 배아를 비옥 물고기 시스 -regulation을 연구하는 강력한 척추 시스템을 제공합니다. 외국 ì되는 TOL2 트랜스포존 시스템게놈에 통합 할 GN DNA가 TOL2의 트랜스가 사이트와 바인딩에 의해 형벌되고, TOL2의 트랜스 mRNA의와 공동 주입 성공적으로 플라스미드 물고기 유전체 (26)에 구축 통합하는 높은 효율로 작동 - 28. 일반적으로 잠재적 인 증강은 TOL2 백본에서 (예 : hsp70l 29)를 기초 프로모터 및 형광 리포터 유전자 등 EGFP로 (강화 된 녹색 형광 단백질) 또는 mCherry의 상류 복제 및 트랜스의 mRNA (26) 주입된다. 형광 기자의 어느 주입 배아 또는 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 가진 자손의 표현의 관측은 추정 증강에 의해 구동 유전자 발현의 시공간 규제에 대한 정보를 제공합니다. 상기 실험에서 검증 증강은 관심 유전자의 조직 - 특이 과발현을 유도하는데 사용될 수있다. 큰 시스 규정하는 지역의 분석, 고품질의 대형 삽입 genom에 대한세균 인공 염색체 (BAC에)를 사용하여 IC 라이브러리는 모두 해양 및 담수 큰가시 고기과 (30)로 구성되어있다. 이들의 BAC는 큰 (1백50-2백킬로바이트)의 맥락에서 형광 리포터 유전자의 게놈 영역 (31)을 가진 유전자를 대체 recombineered 수있다. 는 BAC 내의 조절 서열에 의해 결정되는 형광 리포터이어서 시공간 패턴으로 표현된다. 물고기 연구 내용 TOL2 사이트 게놈 통합 (32,33)를 용이하게하기 BAC에 첨가 될 수있다. 개발의 후기 단계 계내 혼성화에 기술적 도전에서 BAC 형광 판독 큰가 뼈 형태 형성 단백질 6 (Bmp6) (20)에 대해 도시 된 바와 같이, 유전자 발현의 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. 또한, 각각의 형광 발현 패턴 계내 혼성화에 달성 될 수없는 시간에 걸쳐 추적 될 수있다. BAC에 또한 additiona을 추가하는데 사용될 수있다게놈 영역의 L 사본은 관심의 유전자의 복용량을 증가시킵니다. 유전자 기능 연구를 위해, 게놈 편집 유기체 (34)의 다양한 게놈 서열을 타겟팅하는 변화를 생성하는 데 사용될 수 폭발적으로 확장 필드이다. 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)는 원래 정확하게 선택의 게놈 시퀀스에 직접 결합하여 이중 가닥이 35, 36을 깰 생성하도록 설계 될 수있다 식물 병원균으로부터 분리 모듈, 순서 특정 뉴 클레아 있습니다. 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR)은 / CAS 시스템은 원래 세균에서 찾을 수 있으며, 상기 가이드 (37)에 상보적인 표적 DNA 서열의 틈을 발생하도록하는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 사용 하였다. 종종 TALENs 및 CRISPRs 모두에 의해 생성 된 이중 가닥 나누기 후속 보수는 표적 서열의 기능을 방해 할 수있는 작은 삽입 또는 결실을 남겨35-37. 큰가시 고기과에서 TALENs는 인핸서 (20)를 대상으로 유전자 발현을 방해하는 데 사용되었으며, TALENs 및 CRISPRs 모두 성공적 서열 (미공개 데이터)를 코딩 돌연변이를 생산 하였다. 제브라에 사용 CRISPRs의 생성에 대한 상세한 프로토콜은 큰가시 고기과 38 CRISPRs을 개발하는 지침으로 이용 될 수있다. 형질 전환 및 게놈 편집 실험 새로 수정 된 하나의 배아 세포 내로의 핵산의 도입을 필요로한다. 초기 발달에서 유전자 또는 게놈 편집 툴을 도입함으로써, 배아 유 전적으로 조작 딸 세포의 수를 최대화한다. 주입 된 배아는 시각적으로 형광에 대한 검사 또는 분자 게놈 수정에 대한 상영된다. 항체 2.12.1fx에 기여하는 세포를 타겟으로하는 경우, 형질 전환 또는 돌연변이 포스트 분사 치사율이 높은 경우에도, 자식들의 서브 세트로 전달 될 수있다. 모자이크 물고기 outcrossed 할 수 있습니다 또는교차하고 그들의 자손은 돌연변이 대립 유전자 또는 관심의 안정적 통합 된 형질 전환 유전자를 복구하는 상영. 이 프로토콜은 하나의 셀 큰가시 고기의 배아에 유전자와 게놈 편집 시약을 도입하고 성공적으로 게놈 수정에 대한 모니터링하기위한 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with transillumination</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Micromanipulator</td></tr><tr><td>Pressure Injecion system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Iron plate (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% phenol red in DPBS</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P0290</td><td>injection tracer</td></tr><tr><td>#5 forceps, biologie dumoxel&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>for needle breaking</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>holds needles</td></tr><tr><td>6&quot;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>hold eggs for injection</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm glass plate</td><td>any hardware store</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*harder glass than zebrafish injection capillaries</td></tr><tr><td>150 x 15mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>raise stickleback embryos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>store eggs pre-injection</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>fish anaesthesia/euthanasia</td></tr><tr><td>Sp6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>For transcription of TALENs and transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purify transposase or TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>clean up plasmids for injection</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>for BAC DNA preparation</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contains endotoxin rinse buffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel Extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704&amp;nbsp;</td><td>for sequencing induced mutations</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetate-EDTA buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&amp;nbsp; Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-strip PCR tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

큰가시 고기 생선은 형태 학적, 생리의 다양한 유전 적 기초를 공부하는 강력한 시스템, 행동 표현형로 ​​떠오르고있다. 해양 및 민물 형태를 교차 할 수있는 능력과 결합 해양 인구 수많은 담수 환경에 적응로 진화 현저 다양한 표현형은 유전자가 형질 발전 제어하는​​ 게놈 영역을 매핑하는데 사용될 수있는 드문 척추 시스템을 제공한다. 우수 게놈 자원 진화 변화의 분자 유전 학적 해부을 용이하게 사용할 수 있습니다. 맵핑 실험 흥미 후보 유전자의리스트를 생성하지만, 기능적 유전자 조작은 유전자의 역할을 테스트하도록 요구된다. 유전자 조절은 TOL2 트랜스의 시스템을 이용하여 게놈에 통합 된 트랜스 제닉 리포터 플라스미드와 함께 BAC에 조사 할 수있다. 특정 후보 유전자 및 시스 - 규정 요소의 기능은 타겟 유도함으로써 평가할 수있다TALEN 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시약 돌연변이. 모든 방법은 수정 된 하나의 셀 큰가시 고기의 배아로 핵산을 도입 필요, 작업이 큰가시 고기 배아의 두께 융모막과 상대적으로 작고 얇은 할구로 도전했다. 여기서, 큰가 배아 내로 핵산 마이크로 인젝션에 대한 상세한 프로토콜은 트랜스 제닉 게놈 편집 유전자의 발현 및 기능을 연구하는 응용뿐 아니라 형질 전환의 성공 여부를 평가하고 안정한 선을 복구하는 방법에 대해 설명한다.

인핸서 활성을 갖는 리포터 유전자 형질 전환 유전자를 들어, 성공적으로 주입 트랜스 (도 4A, 4C)의 특정 세포 발현을 초래할 것이다. 주입 후 물고기 안정 라인 (도 4b에 도시 된 BAC 안정 선의 예)를 제조하는 outcrossed 수있다. 큰가시 고기의 배아에 DNA를 주입하는 것은 일반적으로 혼자 RNA보다 훨씬 높은 치사율을 초래한다. 그것은 50 %?...

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Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.9K 조회수.  University of California, Berkeley.  트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다. 

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

연구

유전학

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

발생학

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

생물학

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

신경과학

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

의 게놈 편집

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골