Name: intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
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We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

모든 실험은 베일러 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다. 1. 배양 비 typeable 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)과 접종 준비 <ol><li> 초콜릿 한천 플레이트 접시 NTHi를 37 ° C, 5 % CO 2에서 하룻밤 가습 CO 2 배양기에서 거꾸로 판을 유지한다. 다음 날, 문화 뇌 심장 주입 국물에 박테리아. 그런 다음, 멸균 1.5 ML 튜브로 국물 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 4000 × g으로 원심 분리기. 그 다음, 상층 액을 제거하고 멸균 1X PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 분광 광도계로 파장 600nm에서의 희석 배양 흡광도 1X PBS 900 μL에 재현 탁 용액 100 μl를 전송하고 측정한다. </li><li> 생존 및 집락 형성 단위를 결정초콜렛 아가 플레이트에 1시 10분 연속 희석을 배양 CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양하고 5 % 접종 S (CFUs). </li><li> 이전 단계에서 결정된 가능성에 기초하고 CFUs, 20 × 106 CFU / ml의 최종 농도로 접종을 조정한다. </li></ol> 2. 인트라 기관 (IT) 점적 <ol><li> 150 ㎎ / ㎖ + 케타민 20 ㎎ / ㎖ 용액과 자일 라진 마우스 0.1 ml / 10 g 체중으로 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. 절차는 동물을 따뜻하게 유지하는 광원과 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하기 위해 마우스의 인터 공간을 꼬집어. </li><li> 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 목 복부 영역을 면도 클로르헥시딘, 70 % 에틸 알코올로 소독. </li><li> 쥐 치아 집게를 사용 넥 부의 상부 복부 피부를 리프트. 메스를 이용하여 흉선 상기 작은 절개 (0.5-1.0 cm)를 만들기조심스럽게 기관을 노출 근육을 해부하다. <ol><li> 27 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여 서서히 다른 0.05 ㎖의 공기 다음 컨트롤과 같은 제 1 염에서 얻어진 용액 0.05 NTHi 다음 0.05 ml의 공기를, 주사. 약 1 분 동안 수직 동물을 유지합니다. </li></ol></li><li> 수술 접착제와 절개를 닫습니다. 약 10 분 동안 옆으로 누운 따뜻한 마우스를 유지합니다. </li></ol> 3. BALF 컬렉션 <ol><li> 감염 후 자궁 전위 24 시간으로 마우스를 희생. </li><li> 해부 가위와 마우스의 복강을 열고 출혈 복부 대동맥을 잘라. 폐의 복부 부분을 노출. </li><li> 기관을 노출하고 20 게이지 카테터를 삽관. BALF 버퍼의 0.8 ㎖ (1X PBS, 0.1 % 덱 스트로스, 10 U / ㎖ 헤파린)를 주입하고 부드러운 흡입에 의한 세척를 수집합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. </li><li> hemocyto BALF를 사용하여 현탁액 100 ㎕의 세포의 총 수를 카운트트리 판 블루 염색으로 10 배 배율 아래 미터. </li><li> 수정 김사 염색 슬라이드를 준비합니다. 5 분 500 XG에 cytospin 원심 분리기의 적절한 우물에 폐포 세척액의 나누어지는 100 μL. 10 분 동안 슬라이드를 건조 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 수정 김사 염색을 사용하여 세포를 얼룩. </li><li> 이러한 개화 (FACS) 정렬 활성화 세포, 공 초점 현미경, 유전자 발현 및 웨스턴 블롯 11-13 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 사용합니다. </li></ol> 4. 조직 병리학 준비 <ol><li> 단계 2.4에 설명 된대로 조직 병리학 분석을 위해, NTHi와 마우스를 감염. 감염 24 시간 후 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 폐와 앞서 언급 한 바와 같이 기관을 노출 해부 가위로 흉강을 열고 잘라. 그리고, 기관에 20 게이지 카테터를 삽입합니다. </li><li> 4 % 포르말린에서 제조 된 2 % 따뜻한 아가로 오스 용액으로 폐를 입력합니다. 일단폐는 완전히 아가로 오스 솔루션을 응고 폐의 상단에 장소 얼음, 팽창된다. </li><li> 그런 다음, 조심스럽게 흉부 플러그를 제거하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 부분에 대한 처리 될 때까지 1X PBS에서 4 % 포르말린 50 ㎖ 용액에 넣어. </li></ol> BALF에서 세포를 염색 5. FACS <ol><li> 96 웰 V 바닥 마이크로 타이 터 플레이트에 BALF 유체 1 × 10 5 세포를 넣습니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 300 차가운 1X PBS의 μL 및 스핀 세포를 씻으십시오. </li><li> (1 : 1000 희석) 1X PBS 100 ㎕를 세포 염색 용액으로 세포를 염색하고 15 분 동안 실온에서 유지한다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 차가운 1X PBS 300 μL와 세포를 씻으십시오. </li><li> 하나를 포함 FACS 세척 완충액 [세척 완충액 (1X PBS, 2 % FBS, 1 mM의 EDTA, 0.1 % 나트륨 아 지드] 100 ㎕에 세포를 유지 : 100 희석 된 Fc 블록을 4 ℃에서 15 분 동안. </li><li> 4,000 XG에 원심 분리기 세포 3 분 및 저녁을 먹다 폐기ernatant. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 FACS 세척 버퍼 (100 희석 1) 100 ㎕의 표면 얼룩 칵테일 얼룩 세포. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 FACS 세척 버퍼 300 μL로 세 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕에 세포를 고정한다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 400 XG에서 PBS 1 배 300 μL로 두 번 세포를 씻고 FACS 세척 버퍼 300 μL에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 비드 유동 세포 계측법을 사용하여 단색 오염 제어를 만든다. <ol><li> 96 웰 V 바닥 마이크로 리터 판에 구슬 한 방울을 추가하고 PBS 1 배 200 μL 세척. </li><li> PBS와 구슬 1 배 100 μL에 염색 항체의 1 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. </li><li> PBS 1 배 300 μL로 두 번 구슬을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 14 유동 세포 계측법에 의해 단일 염색 컨트롤과 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> RNA를 분리하기 위해 폐 조직의 균질화 6. <ol><li> 감염 후 폐 (20 ~ 40 mg)의 작은 조각을 수집하고 밤새 4 ° C에서 시약을 안정화 RNA에 보관합니다. 그리고, 다음 단계까지 -80 ℃에서 보관. </li><li> RNA 안정화 시약 없애 차가운 1X PBS의 폐 조직을 씻으십시오. </li><li> 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브 포함 용해 버퍼 (1 ml의 용해 버퍼 + 10 μL의 β-머 캅토 에탄올)로 조직을 놓습니다. </li><li> 뾰족한 가위를 사용하여 작은 조각으로 조직을 잘라 및 20 ~ 40 초 동안 무선 모터 펠렛 유봉을 사용하여 균질화. </li><li> 5 분 동안 얼음에 해물을 유지하고 단계 7.1를 진행합니다. </li></ol> 폐 7. RNA 분리 <ol><li> 3 분 동안 18,000 XG에 해물을 원심 분리기. 피펫으로 상층 액을 제거하고 조심스럽게 새로운 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 해물을 70 % 에탄올 1 볼륨을 추가합니다. 피펫 즉시 혼합하고 2-4 분 동안 기다립니다. </li><li> 배치 스핀 컬럼에 해물의 700 μL까지 이동2 ml의 포집 관에서. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 원심 분리기와 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 350 μL에게 엄격한 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> I 직접 스핀 컬럼 막에 80 μL의 DNase를 추가하고 실온에서 15 분 동안 유지. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl의 엄격한 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 2 분 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 스핀을 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 9,600 XG에 새로운 2 ㎖의 수집 튜브와 원심 분리기에 스핀 열을 놓습니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기에 직접 30 ~ 50 μL의 RNase없는 물을 추가합니다. -80 ° C에서 보관 RNA. </li><li> RNAseq 분석 (14)을 수행합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서, 우리는 박테리아 폐 병원체와 마우스의 폐를 접종 독특하고 최소 침습 절차를 설명합니다. 우리는이 절차 염증성 신호 전달 경로의 유전자 결핍 마우스를 이용하여 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 바이러스 및 진균 감염에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 이러한 비내 에어로졸 또는 흡입 같은 다른 방법을 통해이 절차의 이점 (1)이 절차에서 병원성 접종 직접 하부 호흡기 점적되며 (2) 균액의 크기를 제어 할 수있는 기능; (3) 박테리아 핸들러 노출 위험을 감소시켰다. 수술 박테리아 주입 용 기관의 노출 치료가 주위 조직, 특히 혈관 손상을주지 않도록주의해야 중요한 단계이다. 기관 쉬에 박테리아의 점안에 의한 질식으로 마우스의 사망 가능성을 방지하기 위해주의 깊게 수행 할 수 울드. 접종 (50 μL)을 천천히 출시 및 공기 전과 접종 후 주입하는 것이 좋습니다. 잠시 동안 점안 다음 마우스가 수직 유지하고는 옆으로 누운 유지하는 빠른 복구를 용이하게한다. 이 방법의 주요 단점은 짧은 시간 내에 다수의 노출로 인해 수술의 필요에 불가능하다는 것이다. 잠재적 인 문제는 카테터 기관지 너무 깊게 배치하면, BALF 세포 수가 낮은 것 때문이다. 이 문제는 약간 위쪽으로 튜브를 당겨 해결 될 수있다. 기도 염증 질환의 발병률이 질환의 병태 생리에 대한 이해 전세계 3,16 증가되므로 가장 중요하다. 이 연구에 기술 된 기술은 조절 키 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있고, 개발을 촉진 할 수새로운 치료 방법의.

염증은 감염 인자에 대한 방어의 기본 면역 메커니즘입니다. 그것은 병원균 퇴치 및 손상된 조직의 복구를 촉진한다. 또한, 일반 건강 상태 1로 회복을 용이하게한다. 그러나, 조절 이상 염증은 종종 만성 염증성 질환이 리드. 기도 염증은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 및 폐 섬유증과 같은 3 가지 폐 질환의 초기 트리거이다. 비 typeable (봉입) 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)의 상부 및 하부 만성 폐 염증성 질환 4,5-와 연관된다. 그것은 만성 폐쇄성 폐 질환 4,6,7 어린이와 성인의 하부기도에서 분리 지배적 인 종이다. NTHi 감염 후 염증 반응은 (예컨대 TNF 및 IL-1β와 같은) 염증성 사이토킨의 상향 조절이 특징이며, B를 매개y를 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 수신자와 같은 수용체를 통해 핵 인자 κB (NF-κB) (TLR에) 8. 마우스 모델 때문에 서로 다른 유전자가 결핍 된 라인의 가용성의 폐 염증성 질환의 기본 병리학을 분석하는 매우 유용한 도구입니다. 여러 방법은 비내 점적 및 에어로졸 흡입 9,10- 포함한 실시간 / 감쇠 박테리아와 세균 제품을 접종하는데 사용되었다. 여기, 우리는 내 기관 점안을 보여줍니다. 덜 빈번하게 사용되지만,이 방법은 더욱 효율적이고 때문에 하부 호흡기 접종원 직접 전달 재현성이다.

<table><tbody><tr><td>Chocolate agar plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft quick solution</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 20/26G&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>(REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml syringe</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 20GA</td><td>BD</td><td>REF 381433</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, straight, 10 cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, serrated, 10cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600095</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&amp;nbsp; kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestile motor (Tissue homoginizer)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 well microtiter plates V bottom</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes polystyrene round bottom tube</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation

여기, 우리는 효율적으로 자세한 절차를 설명하고 직접 헤모필루스 인플루엔자를 제공 마우스의 하부 호흡기로. 우리는 H. 제조 과정을 보여 인플루엔자 접종, H.의 내부 기관 점안 폐에 인플루엔자, 차동 유전자 발현 분석을위한 기관지 폐포 세척액 (BALF), 폐포 세척액에서 면역 세포의 분석 및 RNA 분리의 컬렉션입니다. 이 절차는 임의의 박테리아, 바이러스 또는 진균에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 적은 모호성으로보다 효율적으로 하부 호흡기로 세균 접종을 제공하기 때문에 직접 기관 점안은 주로 비강 내 또는 에어로졸 흡입 절차를 통해 바람직하다.

내 기관 점안은 식염수 설치보다 폐포 세척액 (그림 1A, 왼쪽 패널)에서 백혈구의 현저하게 증가 된 수의 결과. 백혈구의 미분 계수 분석 분명히 증가 호중구 침윤 (도 1, 오른쪽 패널)을 보였다. BALF에서 세포의 FACS 분석은 상기 호중구 수의 증가 (도 1b)를 확인했다. 폐 조직을 H &amp; E 염색 섹션의 조직 학적 분석은기도 염증 (도 1C)을 증가 하였다. 이러한 데이터 집합 내 기관 점안은 생쥐의기도 염증을 유도하는 것이 좋습니다. 기도 기전을 조절하는 신호 전달 경로를 연구를 위해이 방법의 사용을 지원하기 위해, 우리는 E3 유비퀴틴 리가 가려움에 대한 결핍 마우스를 사용 하였다. 가려움은 15 염증성 신호 전달 경로를 조절에 관여하는 것으로 알려져있다. 우리는 접종나이와 성별을 일치 야생형 C57BL / 6 제어 및 가려움는 - / - NTHi와 마우스. - / - 우리는 제어 WT과 가려움의 폐 조직에서 RNA를 격리 마우스와 차별적으로 발현되는 염증 유전자를 식별하기 위해 전체 전 사체 서열 분석을 수행 하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 가려움 결핍 여러 유전자의 차등 발현 결과. 이것은 인트라 기관 점적은 폐 염증, 유전자 발현 프로필 및 신호 전달 경로를 조사하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53964/53964fig1.jpg" /> 그림 1 : NTHi의 인트라 기관 접종 쥐에서 폐 염증을 유도 마우스가 NTHi (106 CFU / 마우스) 또는 식염수 제어 접종 하였다.. 접종 24 시간 후, 마우스 (A) BALF 수집 한 희생시켰다. 총 백혈구, 단핵구 및 호중구 수를 측정 하였다. 데이터 제시으로는 ± SEM을 의미한다. N = / 그룹 4 쥐. * 식염수 처리 된 마우스에 비해 P &lt;0.05를 나타냅니다. (B)의 BALF 세포는 안티 GR1 항체로 염색하고, FACS로 분석 하였다. (C) H &amp; 백혈구 침윤과 염증을 보여주는 폐 섹션을 E-스테인드. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53964/53964fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53964/53964fig2.jpg" /> 도 2 : WT 가려움의 폐 차등 유전자 발현 - / - 인트라 기관 NTHi 접종 NTHi 접종 후 24 시간이 RNA 두 WT의 폐에서 분리 된 다음 마우스 (1, 2) 및 두 개의 가려움 - / -. (1, 2) 마우스. (A) RNA의 품질 bioanalyzer를 사용하여 분석 하였다. (B) 열 맵에서 멀리 SD의 척도로 해석 (Z-점수를 표시백만 분의 로그 2 수의 평균)을 (가려움에 에저를 사용하여 식별 172 차등 발현 유전자의 2 CPM)을 로그 - / -. WT 마우스에 비해 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53964/53964fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

10.1K 조회수.  Baylor Research Institute. We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models. 

비디오: Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

연구

면역학 및 감염병학

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

비 침습적 기관 내 삽관 마우스 폐의 병리학 및 생리학을 연구하는

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

의학

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

의 내부 기관 관리

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