This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

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The authors have nothing to disclose.

여기서 우리는 살아있는 세포에서 담즙산 수송 시공간 역학을 모니터링 할 수있는 새로운 유전자 부호화 담즙산 센서의 사용을 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 바이오 센서함으로써 FRET 기반 담즙산 센서 (BAS)을 형성 FXR-LBD 융합되어 하늘색 및 황 형광 단백질로 구성되어있다. 세포 배양 및 FACS 또는 (공 초점) 현미경 기본적인 경험을 가지고 할 때 담즙 산성 센서는 사용이 비교적 간단하고 편리합니다. 그러나 일부 측면은 몇 가지 문제가 촬영이 필요할 수 있습니다. 담즙산 수송 체와 조합 담즙산 센서를 이용하면, 숯 여과 혈청 배지에서 배양 된 세포에 권장된다. 목탄은 추가 혈청에서 흡착 담즙산 농도를 감소시킨다. 이 둔감 센서의 가장 흔한 원인이기 때문에 특히 NTCP 수입 등의 존재하에,이 배양 동안 센서의 포화를 방지하는 것이 중요실험 중. 따라서, 다른 센서는 더 큰 동적 범위 (8)을 생성, 담즙산의 감도를 변경 돌연변이를 포함 (NucleoBAS N354K / I372V)를 만들었습니다. 이들 세포는 저 세포 내 담즙산 농도를 갖는 것으로 가정되기 때문에, 센서가 이미 포화되어 있는지 여부를 정의하기 위해, 황 / 하늘색 비는하지 않음 담즙산 수송 체를 발현하는 대조군 세포의 비율과 비교 될 수있다. 대안 적으로, 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 측정 강도에 독립적 인 방식으로 12 FRET을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 이 기술은이 문서의 범위를 넘어,보다 전문적인 장비를 필요로한다. 둔감 센서에 대한 다른 이유는 자동 - 형광 및 / 또는 발현을 NucleoBAS 잃은 세포의 사용을 포함한다. 참고로, 실험 기간 동안 (예를 들어 의한 초점의 변화에​​) 하늘색과 황수정의 강도의 변동은 있지만, 이미징 동안 FRET 변화의 직접 시각화를 모호 할 수 있습니다센서의 비율 적 성질은 여전히​​ 담즙산 역학의 모니터링을 허용한다. 비율의 증가가 분명 동안 종종 절대 강도 변화는, FXR 리간드의 첨가시 개별 형광체 완만하다. BAS 센서로 형질 세포 FRET 분석을 위해 적절한 레이저 광 필터가 선택되어야한다. FRET 동안 황수정 강도의 증가는 450-520 (하늘색)와 520-580 (황수정)를 통해 모니터링 배출량 바이올렛 다이오드 (405 ㎚) 레이저로 측정 할 수있다. 고려해야 할 중요한 점은 광표백에 대한 센서의 감도이다. 하나 또는 둘의 형광 강도가 서서히 리간드의 첨가없이 시간에 감소 할 때, 종종 광표백을 나타낸다. 레이저 파워가 너무 높은 경우에는 이러한 현상이 주로 발생한다. 이러한 원치 않는 효과를 방지하기 위해, 레이저 전력은 전체 전력의 5 %를 초과하지 않아야하고 세포를 최대한 어두운 유지되어야한다. 제한시간은 바로 세포를 검색합니다. 형광 강도의 변동은, Z 축에 초점 드리프트에 의해 발생 될 수있다. 이에 대응하기 위해 핀홀 크기는 증가 될 수 있으며, 셀 경계에 매우 근접하지 로아를 그리는 것이 바람직하다. 담즙산의 FRET 센서는 형질 전환과 안정적인 표현형이 될 수있는 여러 세포 유형 (U2OS, Huh7, 인 HepG2, H69, MDCK 및 HEK293T 세포)에서 테스트되었습니다. 그러나, 1 차 간세포와 분화 된 세포는 형질과 특성의 관점에서 안정한 유지하기 어렵다. 바이러스 성 전달이 어려운 트랜 세포 (요청 구성)에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 현재 급속하게 분리시 탈분화 갓 절연 일차 전지에 센서의 사용을 허용하기 위해 마우스 선을 생성한다. 설명 촛점 실험을 수행하기 위해, 선택된 세포주 배양 접시에 부착하는 것이 필수적이다이고 SI에서 자란다ngle 세포 층. 그러나, 현탁액, 또는 오히려 쉽게 트립신 접착 세포 수의 세포 성장은 또한 FACS를 이용하여 측정 할 수있다. 마지막으로,이 특정 전송 경로를 분석 할 때, 내인성 담즙산 수송 또는 합성없는 세포주를 선택하도록 의뢰한다. 즉, 특정 형질 (돌연변이) 수송 단백질의 활성을 측정 할 때. 제시된 유전자 인코딩 형광 바이오 센서는 단일 BAS 생균 담즙산 수송 모니터링 유용한 도구이다. BAS는 담즙산 (8)의 세포 내 역학의 이미징을 허용, 담즙산의 큰 다양성에 의해 활성화되는 FXR-LBD가 포함되어 있습니다. 이것은 다른 기술의 이용과 관련하여 큰 이점을 제공한다. 예를 들어, 프로모터 구동 루시페라아제 리포터 분석법에, 루시 페라 제는 세포 내 신호 정보를 지원하지 않는, 세포 내의 리포터의 안정성에 의존하고, 시료의 파괴​​를 필요 <s&gt; 13까지. 담즙산 수송을 측정하는 또 다른 방법은 형광 또는 방사성 표지 된 리간드를 사용하는 것이다. 그러나, 담즙산의 형광 표식은 담즙산 수송 속도론을 변경할 수 있으며, 방사성 표지 담즙산의 유용성이 제한된다. 또한, 담즙산 수송 체, 및 특정 셀룰러​​ 유입 담즙산 유출의 식을 조합 한 센서는 해결 될 수있다. TCDCA 운송 활동에 대한 통찰력을 제공과 같은 예를 들어, 복합 담즙산의 세포 내 수준을 증가했다. 이것은 또한 가능 분자 또는 화합물 억제제 스크린을 사용하여, 또는 다른 FXR 리간드의 효과를 검토하여 예를 들면 특정 경로, 간섭 후의 담즙산 수송에 미치는 영향을 조사하기 BAS를 사용하는 것을 가능하게한다. 마지막으로, 센서의 또 다른 애플리케이션은 세포막 컨베이어 식 FXR 및 활성화의 예 이미징, 정량 분석​​ 또는 단백질의 위치 파악을위한 다른 형광 단백질과 결합되고동일한 셀.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 2 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 3 생활에 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 4를 대상으로한다. 세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히​​ 저조한 이​​해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된 담즙산 또는 형광 담즙산 유사체의 사용을 모니터링한다. 후자는 아마도 자신의 특성에 영향을 미치는 담즙산의 수정을 필요로한다. 루시 페라 기반 기자는 가난한 시간 해상도를 가지고있다. 또한,이 기술은 시료의 손실이 발생할 및 단일 세포 이미징을위한 적용되지 않습니다. 따라서,이 비율 적 검출 5, 6의 장점을 포함하고, 특히 이후 FRET 바이오 센서를 이용하여 전송 활동의 실시간 단일 세포 이미징을 허용 방법을 사용하는 것이 유익 할 것이다. 반면 CF의 변형P / YFP 형태는 가장 자주 FRET 쌍, 적색 편이 담즙산 센서 (7)을 포함한 새로운 센서와 FRET 도구 상자의 확장을 주도 자기 협회 유발 돌연변이를 들고 mOrange 및 mCherry를 사용하여 새로운 전략을 사용했다. 우리는 이전에 farnesoid X 수용체 (FXR) 리간드 결합 도메인과 융합 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정)로 구성된 유전자 인코딩 FRET 담즙산 센서 (BAS)을 생성 (FXR-LBD) 및 펩티드 LXXLL 모티브 (8)를 포함. 담즙산 의존적으로 FXR-LBD이 펩티드 어소. FXR 활성화되면, 황수정과 하늘색 사이의 거리가 구조적 변화로 인해 변경됩니다. 포유 동물 세포주에서, 황 / 세룰 리안 비율 명확히 검출 가능한 증가 FXR 활성화 결과, 정제 된 센서는 반대 방향으로 작동하고 FXR 활성화시 FRET 비율 감소에 이르게한다. 이 센서 (CytoBAS)세포질 담즙산 역학의 모니터링을 할 수 있습니다. 세포 내 표적 모티프의 카복실 말단을 첨가하여, BAS 구조체는 다른 세포 구획에서 담즙산 농도의 측정을 허용하는, 핵 (NucleoBAS) 및 퍼 옥시 솜 (PeroxiBAS)을 타겟으로 할 수있다. 퍼 옥시 솜 타겟팅 모티브의 추가가 담즙산에의 대응 성을 손상하지 않지만, 세포 투과성 FXR - 리간드는이 퍼 옥시 솜 (8) 내부 PeroxiBAS의 변화를 FRET 유도하지 않았다. 이 차이의 특성을 알 수있는 바와 같이, 프로토콜은 다음과 CytoBAS NucleoBAS에 집중된다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서의 사용은 최근 간 담즙산 수송 + / 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (NTCP) 나 유기 용질 수송 알파 / 베타 (OSTαβ)를 8 함유 세포에서 증명되었다. NTCP는 주 간 담즙산 수입하고 OSTαβ는 기저 장 담즙입니다전기 담즙산 농도 구배 (9), (10)에 따라 수입과 수출 모두 작동 할 수 있습니다 산 수송. 최근의 데이터는 NTCP 및 / 또는 OSTαβ 의한 담즙산 수송시 리간드 FXR-LBD 상호 작용의 결과로서 FRET 비율 견고하고 빠른 응답이 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 여기, 우리는 이러한 공 초점 현미경 분석 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)와 같은 FRET을 측정하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명하는 중요한 단계를 강조, 잠재적 인 문제를 해결하고 다른 방법에 대해 설명합니다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서를 이용하여, FXR-LBD와 담즙산 상호 작용은 정량 및 살아있는 세포에 직접 모니터링하고 실시간으로 담즙산 수송 및 역학을 가시화 신속하고 간단한 방법을 제공 할 수있다. CytoBAS NucleoBAS를 인코딩 및 포유류 발현 플라스미드는 시판되고있다. 따라서,이 바이오 센서는, 상기에 기여담즙산 수송 또는 FXR을 활성화하고 담즙산 생물학 및 시그널링에 대한 깊은 통찰력을 제공하는 화합물의 이해.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>High glucose without L-glutamine</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (pen/strep)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td>Laminin coated</td></tr><tr><td>T-175 cell culture flask</td><td>VWR international</td><td>392-0238</td><td>Laminin coated</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>Poly-L-lysine and Laminin coated</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Laminin coated</td></tr><tr><td>Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)&amp;nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticin) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>No phenol red</td></tr><tr><td>Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>No cap, non-sterile</td></tr><tr><td>Falcon 2,063 tubes (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Snap cap, sterile</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 well coverglass</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Charcoal-filtered FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Other chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

real time monitoring of intracellular bile acid dynamics using a genetically encoded fret-based bile acid sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

제시된 FRET-BAS 센서는 두 형광 황수정과 하늘색)과 LXXLL 모티브에 부착 FXR (LBD-FXR)의 도메인을 결합 리간드를 기반으로합니다. 이 센서는 높은 공간 및 시간 해상도 (도 1)와 살아있는 세포에서 담즙산 수송으로 조사 할 수있다. 하늘색 및 황에서 돌연변이는 분자 복합체 (도 1 B)의 형성을 촉진하기 위해 적용 하였다. 담즙산과 다른 FXR FXR 리간드에 결합함으로써, 형태 변화에 의해 황 및 하늘색 사이의 거리를 변경. 포유 동물 세포를 살아있는, 이는 증가 된 FRET 효율성 (황 증가, 감소 하늘색) (도 1 C, D (1))을 초래한다. 공 초점 현미경으로 살아있는 세포 양적 강도 기반의 FRET 실험 동안, 나는T는 평균 황수정 / 하늘색 비율이 GW4064 (5 μm의) (그림 치료 후 현저하게 증가 하였다 taurochenodeoxycholic 산 (TCDCA가), FRET의 모든 변경 사항을 표시하지 않습니다 담즙산 수송 부족한 NucleoBAS을 표현 (30 μM) U2OS 세포를 처리 한 것으로 관찰되었다 1 C). 반면, 공동 발현 NucleoBAS을 NTCP와 OSTαβ이 TCDCA의 추가시 황수정 / 하늘색 비율 명확한 증가 및 GW4064의 추가 (그림 1 D) 후 비율에 더 큰 증가를 보여 주 었는가 세포를 U2OS. 이것은 TCDCA는 세포막을 통과 할 수없는 셀을 입력 특정 수송차 필요함 보여준다. 센서의 셀룰러 지역화 특정 위치 파악 신호들의 존재에 의해 결정된다. NucleoBAS 그림 (핵 지역화 신호에 의해 핵를 대상으로 &lt;강한&gt; 2 B), CytoBAS 어떤 지역화 신호를 포함하기 때문에 세포질 (그림 2)에 남아 있지 않지만. 바이오 센서는 또한 동일한 셀에서 단백질 발현 / 지역화 FXR 및 활성화의 측정을 가능하게 다른 형광 단백질의 이미징과 결합 될 수있다. 예를 들어, 그림 2 C는 U2OS 세포가 NucleoBAS과 NTCP-mKate2와 공동 형질 전환을 보여줍니다. 또한, 센서는 동시에 하나 이상의 매개 변수의 세포 내 이미징을위한 센서와 결합 될 수있다. 예를 들어,이 NucleoBAS TGR5 (EST 클론 IMAGE 번호 5,221,127)과 동시에 동일한 셀 TGR5 FXR 및 활성화를 측정 된 cAMP의 세포질 센서 (T EPAC VV) (11)와 함께 나타내었다. 핵에 FXR의 활성화가 마주 동안 TGR5 결합시, 캠프 수준, 캠프 센서에 의해 감지 된 세포질 증가동시에 ualized.도 2D-F &#160; GW4064 (5 μM) (도 2 D)로 처리 한 후 NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 셀 6 공 촛점 이미지 이루어지는 시계열을 보여 TCDCA (10 μM) (도 2 E) 또는 체노 콜린 산 (CDCA) (10 μM) t = 0으로 그린 색 (cAMP를 상승을 나타내는) 450분의 525 nm의 발광 비율이 감소되는 영역을 나타내고, 핑크 색상에서 (도 2 F)를 비교하여, 발광 비율 (FXR 활성화)의 증가를 나타낸다 실험의 시작에서 비. 또한, 유동 세포 계측법 단일 세포 수준 또는 전체 모집단 같은 고 처리량 스크리닝에 세포의 풀을 선별하는데 사용될 수있다. NucleoBAS 표현 U2OS 세포 excit 있었다보라색 ​​405 nm의 레이저 형광와 ED는 황수정에 대한 하늘색과 20분의 525 범위에 대한 40분의 450 범위에서 수집 하였다. FACS 기반 FRET 실험의 효율성을 개선하기 위해, 적절한 게이트들은 (도 3)를 설정해야한다. P1 게이트는 세포 파편을 제외하고 P2 게이트는 분석에서 duplets을 제거합니다. 다음으로, 분석 (488 레이저 여기) 및 하늘색 (405 레이저에 의해 여기) 마지막으로 게이트 (3)에 의해 양성 세포 시트린 제한되어, 게이트 P4가 높은 황 / 세룰 리안 발광 비율 세포의 비율을 나타낸다 (하늘색의 음원을 이용하여 ) 405 nm의 레이저와. 각 샘플에 대해, 게이트 (3) 내의 떨어 적어도 10,000 세포를 측정 하였다. 이어서, FACS 기반 FRET 유동 세포 계측법은 TCDCA GW4064과 함께 30 분간 배양 한 후 살아있는 세포의 FRET의 증가를 계산 하였다. NucleoBAS를 발현하는 비 처리 U2OS 세포 보였다 &lt;게이트 P4 5 % 세포 (시트린 / Cerulean 높은 세포). 모든 담즙산 수송 체의 부재에서 유사한 비율은 30 μM TCDCA 처리 된 세포 (도 4)에서 관찰되었다. 반면, 세포 NucleoBAS 공동 발현, NTCP와 OSTαβ은 약 38 %의 황수정 / 하늘색 높은 세포의 증가 된 양을 표시했다. GW4064 10 μM을 첨가 한 후, 세포의 거의 90 % 또는 OSTαβ NTCP (도 4 B)의 발현 시트린 / 하늘색 오름차순 무관 하였다. 데이터는 황수정 - 하늘색 비율 (그림 4 E, F)의 인구 히스토그램이나 (그림 4 C, D) (게이트 4, 인구 4 % 세포) 막대 그래프에 표시 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig1.jpg" /> 에프담즙 산성 센서 (BAS)의 igure 1. 디자인. (A) 유전자 인코딩 된 담즙 산 센서의 작용 모드의 구조 표현입니다. 그것은 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정) FXR-LBD를 통해 연결되어 FXR - 보조 인자 펩타이드 (LXXLL 모티브)에 융합으로 구성되어 있습니다. (B) BAS의 도식 도메인 아키텍처. Q204F / V224L의 형광 돌연변이는 하늘색과 황수정 사이의 분자 내 상호 작용의 형성을 촉진. NucleoBAS 구조는 C- 말단 핵 지역화 신​​호 (NLS)을 포함하고 CytoBAS 구조가 세포질 지역화를 보여줍니다 따라서 어떤 대상 시퀀스를 결여하고있는 반면, 따라서 핵에 축적. (C)의 공액 담즙산 수송을 감시하는 도구로서 BAS 주제와 촛점 기반 FRET 실험. 황수정 / 하늘색 비율의 변화는 세포에서 30 μM의 TCDCA 추가 만 특급 후 관찰되지ressing NucleoBAS. 5 μM GW4064 첨가하면 강하게 증가 시트린 / 세룰 리안 비율이 관찰되었다. TCDCA의 (D) 가져 오기 (30 μM) NTCP와 OSTαβ 공동 형질 감염된 세포에서 센서의 상당한 활성화에 결과. 이후 GW4064 (5 μM) 처리 황수정 / 하늘색 비율이 더 증가로 이어집니다. 평균 ± 표준 편차, N = 6 각 셀. 같은 결과는 표현 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/53659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig2.jpg" /> 그림 2. 현지화 FRET은-BAS는 살아있는 세포에서 구축합니다. CytoBAS (A) 또는 NucleoBAS (B)로 형질 U2OS 세포의 공 초점 현미경 이미지. (C) U2OS 세포 공동 트란NucleoBAS 및 NTCP-mKate2와 sfected. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (D - F) NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 형질 감염된 세포의 시계열. (D) GW4064는 FXR (증가 450분의 525 nm의 비율),하지만 TGR5이 활성화됩니다. (E)는 TCDCA TGR5가 세포막에 활성화 (450분의 525 nm의 비율이 감소)하지만, 핵 FXR을 활성화 세포에 들어갈 수 없다. (F) CDCA는 핵의 세포막에 TGR5뿐만 아니라 FXR을 활성화 (세포질 감소, 핵에 450분의 525 nm의 비율을 증가). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/53659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig3.jpg" /> 그림 3. 게이팅 paramete 유동 세포 계측법RS. (A) SSC-A / FSC-창에서 P 1 게이트는 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다. FSC-H / FSC-창에서 (B)는, P2 게이트는 분석에서 이중 이벤트를 제거하기 위해 그려집니다. (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, NucleoBAS (그리고 CytoBAS) 양성 세포가 선택 황수정 (게이트 P3)에서 (C). (D) 마지막으로, 황수정에 (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, P4 게이트 FACS 실험의 황수정 / 하늘색 높은 세포가 포함되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/53659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig4.jpg" /> 그림 4. NucleoBAS를 사용 담즙산 수송 측정 주제 FACS 실험. (A </strong<html> &gt; B)의 양을 보여주는 FACS-플롯 시트린 / 세룰 리안 높은 리빙 NucleoBAS 발현 U2OS 세포 (A) 및 U2OS 세포 공동 발현 NucleoBAS을 OSTαβ와 NTCP (B) 왼쪽 제어 버퍼 (), 30 μM으로 처리 한 후 TCDCA (가운데) 또는 10 μm의 GW4064 (오른쪽). (C, D) NucleoBAS 및 표현 U2OS 세포에서 TCDCA 또는 GW4064 30 분 배양 후 황수정 / 하늘색 높은 세포의 막대 그래프를 보여주는 비율 (D) 또는 (C) OSTαβ 및 NTCP없이 공동 형질. (E, F) TCDCA (노란색)과 30 분 배양 후 OSTαβ 및 NTCP 유무에 관계없이 NucleoBAS을 표현 U2OS 세포, GW4064 (빨간색) 또는 제어 버퍼 (파란색)의 인구 황수정 / 하늘색 비율의 분포를 보여주는 히스토그램. 모든 조건은 세번 측정 하였다. 바 평균값 + 표준 편차 (SD)를 나타냅니다 (N = 3).ttps : //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1 :. 템플릿 BAS 총장 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_1._template_BAS_general.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 2 :. 템플릿 BAS 자이스 라이카 데이터를 가져 오기 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_2._template_BAS_Zeiss_Leica_imported_data.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K 조회수.  Academic Medical Center. We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types. 

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Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

연구

생체공학

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

BRET 기반 접근법을 사용한 살아있는 세포의 CRAF-14-3-3 상호 작용 분석

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

저자 스포트라이트: 살아있는 세포에서 RAF 키나아제 조절을 해독하기 위한 BRET 기반 분석 및 희귀 돌연변이 분석 통합

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

생화학

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

생물학

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

멀티 플루오르 담즙 산 및 사용<em&gt; 생체</em&gt; 자기 공명 영상은 측정하는 담즙 산 전송

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

의학

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

요약

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생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

멀티 플루오르 담즙 산 및 사용

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달