Name: laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis at JoVE.com

We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

이 실험에 사용 된 모든 인체 조직은 시카고 일리노이 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜 및 / 또는 면제를 통해 인수했다. 1. 제 냉동 전립선 PEN-슬라이드에와 충전 유리 슬라이드에 <ol><li> 하루 전 또는 몇 시간 샘플을 절편하기 전에, 청소 도구 (즉, 브러쉬, 집게, coplins, 블레이드, PEN-프레임 슬라이드 (그렇지 않으면 이미 된 RNase 무료), ETOH 안전 마커와 연필)과의 내부 스프레이 병 및 실험실 와이프를 사용하여 솔루션을-오염 제거의 RNase와 RT의 저온 유지 장치. <ol><li> 의 RNase-오염 제거 솔루션, 멀리 닦아 전에 5 분 동안 앉아 솔루션 (depcH 2 0 준비) 70 % EtOH로 최종 헹굼의 RNase가-오염 제거를 통해 왼쪽 제거하려면 depcH 2 0 씻어하도록 허용합니다. 참고 :이 된 RNase없는 작업 공간을 유지하기 위해 필수적이다. 모든 coplins, 도구, 냉동 장착 매체, 블레이드 및 사용 슬라이드의 RNase 무료 작업에만 사용되어야한다및 표준 비의 RNase없는 환경에서 사용되지 않습니다. 모든 악기는 각 실험 이전의 RNase의 오염 제거 용액으로 처리해야합니다. </li></ol></li><li> -24 ℃로 냉각 저온 유지 장치. </li><li> 이전 절편에 적어도 30 분을 냉각 저온 유지 장치 내부에 다음과 같은 청소의 RNase 무료로 악기를 배치 : 슬라이드 코 플린 충전 100 % 에탄올, 도구, 작은 냉동 조직 카세트 및 장착 척. </li><li> 전송을 위해 드라이 아이스로 채워진 거품 양동이에 cryostorage과 장소에서 냉동 된 전립선 조직을 검색합니다. 적어도 30 분 동안 온도를 저온 유지하는 평형 저온 유지로 조직을 놓습니다. 참고 : 레이저 캡처 마이크로 해부에 대한 인간의 전립선 조직이 신선한 냉동 또는 일 수있다 파라핀 (FFPE)를 포르말린 고정. 시간 제약 및 슬라이드 준비는 조직 소스간에 약간 다릅니다. 여기에서 우리는 냉동 섹션의 단계를 설명합니다. </li><li> 한 번에 하나의 조직과 협력하고 BOTTO에 고정 설치 매체를 분출카세트의 M 빠르게는 냉장 집게를 사용하여 냉동 설치 매체에 고정 된 전립선 조직을 탑재합니다. </li><li> 냉동 설치 매체를 설정하는 데 5 분 동안 저온 유지 장치에 냉각기에 조직과 카세트를 놓습니다. </li><li> 척에 고정 장착 매체의 작은 금액을 분출 조심스럽게 냉동 설치 매체에 최대 장착 조직 아래쪽을 누르십시오. 5 분은 냉동 장착 매체가 완전히 응고 할 수 있도록하기위한 저온 유지 장치에 설정할 수 있습니다. </li><li> 홀더에 척을 배치하고 조입니다. </li><li> 잠금 위치에 손잡이를 잠금 및 저온 유지 장치에 새로운 블레이드를 배치합니다. 증폭 단계를 포함 하류 분자 엔드 포인트의 경우 (즉, qPCR에)는 오염을 방지 (또는 다음 샘플을 위해 블레이드의 영역을 사용하는 동안 블레이드를 이동) 각 환자에 대한 새로운 블레이드를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 핸들의 잠금을 해제하고 조심스럽게 균일 손 또는 발 페달과 조직을 발전 50 μ와 조직을 노출원하는 조직 m까지 노출 부에 도달한다. </li><li> 5 μm의 저온 유지 장치를 조정 하나 또는 두 개의 섹션을 절감하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 부과 유리 슬라이드에 그들을 배치 (2 단계 참조). </li><li> 즉시 2 분 동안 차가운 100 % 에탄올로 슬라이드를 배치합니다. </li><li> 에탄올에서 충전 된 유리 슬라이드를 제거하고 H &amp; E 염색 (2 단계)로 진행하기 전에 실온에서이 건조 할 수 있습니다. </li><li> 프레임 지지자에 RT PEN 프레임 슬라이드를 놓습니다. </li><li> RT PEN 프레임 슬라이드에 10 μm의 장소 섹션에 저온 유지 장치를 조정합니다. 1 ~ 4 절은 조직의 크기에 따라 각각의 슬라이드에 장소가 될 수 있습니다. </li><li> 즉시 2 분 동안 100 % 냉 에탄올로 슬라이드 급락. </li><li> 에탄올 펜 프레임 슬라이드를 제거하고 LCM에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C 냉장고에 데시 케이 상자에 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장합니다. 사흘 최적 RNA 회수의 최대 축적 시간이다. </li><li> 충전 된 유리 슬라이드에 대해서만 2 단계를 진행합니다이자형. PEN 프레임 슬라이드의 3 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. 헤 마톡 실린 및 에오신-Y (H &amp; E) 조직 학적 마크 업에 대한 얼룩 참고 :이 충전 된 유리 슬라이드에 조직과하지 LCM의 PEN 프레임 슬라이드의 경우. <ol><li> 다음과 같이 등급 에탄올 통해 슬라이드 침지 청구 유리 슬라이드 섹션 수화물 : 3 분, 두 동안 70 % 에탄올로 한 번, 3 분간, 3 분간 슬라이드를 95 % 에탄올에 두 번 100 % 에탄올에 두 번 찍어 3 분 동안 증류수 H 2 O의 시간. <ol><li> 99 ml의 70 % 에탄올 + 1 ml의 1 % HCl 및 0.1 % 중탄산 나트륨 용액 : 100 ㎖의 0.1 g 중탄산 나트륨 증류 H 2 O 산 알코올 용액을 조제 </li></ol></li><li> 5 분 동안 헤 마톡 실린 길 II (0.4 %)에서 슬라이드를 찍어. </li><li> 3 분 동안 지속적으로 실행 탭 H 2 O에 여분의 얼룩을 씻어 내십시오. </li><li> 슬라이드를 산 알코올의 10 배를 찍어 </li><li> 3 분 동안 탭 H 2 O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 찍어0.1 % 탄산 수​​소 나트륨 용액에 30 ~ 60 초 파란색 보라색 색상을 설정하려면하십시오. </li><li> 3 분 동안 탭 H 2 O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 딥 95 % 에탄올에 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 초 총 에오신-Y 2 ~ 3 시간에 슬라이드를 찍어. </li><li> 다음과 같이 등급 에탄올을 통해 슬라이드를 탈수 : 크실렌에 슬라이드 95 % 에탄올에 두 번, 100 % 에탄올에 두 번, 두 번 찍어 (조직이 철저한 탈수를 나타내는 명확한 표시해야합니다). </li><li> 비 수성 영구적으로 하드 장착 매체 커버 슬립과 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 30 분 동안 슬라이드 건조하자. </li><li> 어떤 전체 슬라이드 스캐너 스캔 슬라이드와 8 &quot;X 11&quot;용지에 대형, 고해상도 이미지를 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 관심의 개요 영역은 마커 (일반적으로 보드 인증 병리학 자에 의해 수행). 이 태그는 LCM 절차에 대한 가이드입니다. </li></ol> PEN 프레임 슬라이드 3. 톨루이딘 블루 염색 참고 : 목을LCM과 같은 날을 수행한다. 모든 솔루션을 depcH 2 O 물을 사용합니다. 의 RNase가없는 지역의 모든 단계를 완료합니다. 모든 coplins이 된 RNase-오염 제거 용액으로 세척해야합니다. <ol><li> LCM의 날은 2 분 후 2 분 동안 90 %의 EtOH에 부드럽게 찍기 슬라이드에 의해 75 %의 EtOH를 -80 ° C의 냉동고 및 수화물에서 펜 프레임 슬라이드를 제거합니다. <ol><li> 다음 실온에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 살균 필터 분자 생물학 수준의 물에 용해하여 0.5 % 톨루이딘 블루를 준비합니다. 이 용액은 최대 6 개월 동안 재사용 될 수있다. 참고 : 그것은 매우 전에 여과 몇 시간이 걸릴 수 있습니다로 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 5-30 초 동안 0.5 % 톨루이딘 블루로 슬라이드를 침지하여 전립선 조직을 염색. 세탁에 의한 조직은 3 분 30 초 동안 75 % EtOH로 다음 15 초 동안 depcH 2 O 2 번 슬라이드 Destain. 주 : 얼룩과 destain 시간은 양호한 염색을 위해 조정될 수있다. 전립선은 얼룩 위에 경향이있다. </li><l난&gt; 얼음에 RNAase없는 건조한 용기에 펜 프레임 슬라이드를 전송합니다. </li></ol> 4. 레이저 캡처 마이크로 해부 (LCM) <ol><li> LCM, 15 분 동안 42 ° C에서 따뜻한 슬라이드에 건조 슬라이드 직전. 처리하고 준비가 될 때까지 얼음에 나머지를 저장한다 드라이 만 슬라이드. </li><li> LCM과 컴퓨터의 순서로, 현미경 전력, 레이저 키, 레이저 스위치 다음 컴퓨터를 켭니다. 레이저 이외에 Microdissection 소프트웨어를 실행합니다. </li><li> 슬라이드 및 수집 튜브를로드하기 위해 현미경을 제어하는​​ 소프트웨어를 사용합니다. 다음 &quot;계속&quot;을 클릭, &quot;언로드 샘플 홀더&quot;를 클릭하면 아래로 향하게 조직과 현미경 슬라이드 홀더에 섹션 슬라이드를로드하고 현미경의 해당 슬롯에 슬라이드 홀더를 삽입합니다. <ol><li> &quot;언로드 수집 관&quot;, 레이블을 클릭하고 튜브 홀더에 0.5 ml의 튜브를로드 및 기기의 해당 슬롯에 삽입합니다. 일단캡 컬렉션 캡에 용해 버퍼의 35 μl를 추가하고 거품을 피하려고, 고정된다. 그런 다음 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 참고 : 25 ㎕의 용해 완충액을 10 μL로 depcH2O : 증발이 문제가되어있는 경우에는 다음과 같이, 희석 완충액. </li></ol></li><li> 소프트웨어에서 슬라이드가 슬라이드 홀더에 배치 된 위치를 선택합니다. LCM 표본을 수집하는 수집 캡을 선택합니다. </li><li> 시각화 및 10X에서 컴퓨터를 통해 슬라이드를 초점을 맞 춥니 다. 다음 &quot;보정&quot;, &quot;레이저&quot;를 선택하여 레이저를 보정 소프트웨어를 사용합니다. 레이저 빔이 완전하고 효율적으로 선택된 영역을 절감 할 수 있도록, 레이저의 파워, 개구 수 및 속도 선택 &quot;레이저&quot;다음 &quot;제어&quot;를 조정한다. 완전히 조직을 통해 레이저 절단 될 때까지 조정을 반복합니다. </li><li> 가이드로 8 &quot;X 11&quot;병리학 마크 업 사용 epithe의 원하는 영역을 에워하기 위해 &quot;모양을 그립니다&quot;도구를 사용하여보기 lium과는 기질를 수집하지 마십시오. 여러 영역이 하나의보기에서 선택 될 수 있지만 &quot;모양을 잘라&quot;도구를 클릭하여 제 1 절단하지 않고 다른보기로 이동하지 않습니다 있습니다. <ol><li> 영역이 완전히 레이저로 절단되지 않는 경우 수동으로 그 위에 이동합니다 &quot;이동 잘라&quot;도구를 사용합니다. 새로운 뷰에 목적을 이동 계속 슬라이드가 완전히 해부 또는 조직의 원하는 양이 수집 될 때까지 레이저 절단을 반복 (일반적으로 100 양성 땀샘은 RNA의 150-500 NG를 얻을). (그림 1A의 예 참조). </li></ol></li><li> 조심스럽게 뚜껑에 용해 버퍼 및 조직 염두되고, 수집 홀더에서 튜브를 제거하고 뚜껑을 닫습니다. 간단히 튜브의 바닥에서 액체 및 조직을 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리. RNA 분리에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 30 분 및 저장을 위해 42 ° C에서 샘플을 품어. </li></ol> 필 5. 전체 RNA를 분리터 기반 키트 및 품질 분석 <ol><li> 얼음에 튜브를 해동 100 μL로 용액의 부피를 가지고. </li><li> 필터의 중심에 30 μL ofLysis 용액을 도포하여 RNA 분리 키트의 마이크로 필터를 미리 적시고 그 다음에 두 단계 (적어도 5 분) whileperforming 침지 할 수있다. </li><li> 해물에 (키트에 제공) LCM 첨가제 솔루션의 3 μl를 추가하고 5 초 동안 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 상기 튜브의 하단에있는 유체를 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리한다. </li><li> 액체를 제거하기 위해 최고 속도에서 30 초 ~에 대한 사전 젖은 필터를 원심 분리기. </li><li> 위아래로 부드럽게, 해물 혼합물에 소용돌이 또는 피펫을 100 % 에탄올 (이 경우 129 μL)에 1.25 볼륨을 추가합니다. **이 방법은 크고 작은 RNA 종을 모두 복구합니다. </li><li> 1 분 필터로 RNA를 결합하는 10,000 XG에서 사전 습윤 마이크로 필터 상에 샘플과 원심 분리기를로드합니다. 그런 다음 세척 용액 1, R &quot;의 180 μL와 마이크로 필터를 세척(21); 1 분 10,000 XG에 원심 분리기. 참고 : 모든 회 원심이 시점은 13,000 XG, 또는 최대 속도로 수행해야합니다에서. </li><li> 키트 프로토콜의 지시에 따라 세척은 각각 &quot;세척 솔루션 2, 3&quot;180 μL, 두 번 필터링 할 수 있습니다. 원심 분리 잔류 유체를 제거하고 필터를 건조 30 초 후, 플로우 스루를 폐기하고, 1 분 동안 스핀 필터. </li><li> 새 컬렉션 튜브 필터를 전송합니다. </li><li> (키트와 함께 제공) -95 ℃로 따뜻한 용출 솔루션입니다. </li><li> 필터의 센터로 예열 용출 용액 10 μL를 적용, 뚜껑을 닫고 실온에서 5 분 동안 저장한다. 이어서 RNA를 용출 한 분 동안 원심 분리 한 RNA ~ 20 μl를 수득이 단계를 한 번 반복한다. </li><li> 37 ° C에서 15 분간의 DNase I 처리를 수행한다. </li><li> 260 nm에서 흡광도와 분광 광도계에 의한 RNA를 정량화. 260 nm 내지 280 nm의 파장에서의 광학 밀도의 비의 순도를 평가하기 위해 이용된다RNA는 15 (표 1 참조). </li></ol> 6. 유전자 발현 분석 참고 : (의 mRNA와 lncRNAs 등) 긴 RNA 종의 유전자 발현하는 것은 단계 6.1과 짧은 RNA 종 (마이크로 RNA 등)에 표시됩니다 단계 6.2에 표시됩니다. 다른 키트는 RT-qPCR에 사용할 수 있습니다 필요한 RNA의 양이 (10 NG로 적게) 키트에 따라 다릅니다. RNA 서열 분석은 6.3에 기재되어있다. <ol><li> 역방향 스크립트 작성 (RT) 5 RT 마스터 믹스 μL (RT 완충액의 dNTP의 랜덤 프라이머, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제) 20 ng의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하는 cDNA에 RNA. 37 ℃에서 120 분 후, 25 ° C에서 25 분 동안 인큐베이션하고, 반응을 85 ° C에서 5 분. </li><li> 의 RNase 무료 물 RT 반응 1:10 희석과 관심의 유전자에 대한 프라이머 또는 프라이머 / 프로브 세트 10 μL qPCR에 반응 당 2.5 μL를 사용합니다. 주 : 부분적으로 저하 RNA의 분석을 용이하게하기 위해이 fo를 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다R 짧은 증폭 (이하 100 BP) 16. (표 2B) <ol><li> 마이크로 RNA 발현 분석을 위해 RT 마스터 믹스의 5 μL로 2-10 NG의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하여 RT 반응을 실행. 주 : 각 시판의 PCR 기반 마이크로 RNA 탐지 기술은 특허 특정 RT 프라이머의 사용을 필요로한다. </li></ol></li><li> 대안 적으로 또는 RT-PCR에 더하여, RNA를 상이한 종을 정량화하기 위해 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ 또는 작은 RNA-SEQ)를 사용한다. 일반적으로,이 절차 (표 3)에 대해 500 ng의 RNA를 사용하여 제조 및 검출기구에 의해 지시 된 바와 같이 방법을 수행. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

표본에서 인간 유전자 발현 프로파일 링이 가능 품질 또는 조직의 수량뿐만 아니라, 주어진 조직 표본에 존재하는 다양한 조직 학적 엔티티뿐만 아니라, 도전 일 수있다. 이것은 양성 조직은 주로 간질 조직 및 암 영역이다 기질 결여 된 전립선에 특히 도전적이다. LCM은 두 개의 서로 다른 유형의 세포 (도 1A)의 더 정확한 서명 전립선 상피와 기질 RNA의 물리적 분리를 용이하게한다. macrodissection 또는 전체 조직 처리에 비해, LCM 양성 조직에서 세포 구획을 구분하지만, 훨씬 더 많은 비용과 노동 집약적 인 할 수 있습니다. 어떤 기술에 가능한 함정이있다. 예를 들어, RNA 품질은 초기 표본 조달시 또는 LCM 및 추출 절차를 수행하는 동안 부분적으로 성능이 저하 될 수 있습니다. 첫 번째 경우, 유전자 발현이 상이한 짧은 AMPL 측정을 달성 할 수있다qPCR에 의한 아이콘. 두 번째 경우에는, 모든 도구와 재료의 RNase 꼼꼼한 프리 처리가 RNA 분해뿐만 아니라 조직 섹션의 신중한 취급 및 처리를 방지하기 위해주의해야한다. 또한, 미만 90 분에 하나의 슬라이드에 소요되는 시간을 제한하는 것은 수집 과정에서 RNA의 품질을 유지합니다. LCM 기술의 가장 큰 한계는 LCM 기기에 액세스하고 LCM을 수행하는데 필요한 노동이다. 레이저 캡처 미세 절제 현미경의 여러 종류가 있습니다. 이 프로토콜은 아래 모음 캡에 떨어지는 영역을 에워하기 위해 레이저를 사용하는 LCM의 사용에 대해 설명합니다. LCM이 유형의 분리 된 수집 영역을 포함 다세포 전립선 조직에서 상피 및 간질의 분리에 이상적이지만, LCM이 종류의 조직으로부터 분리 한 개인 세포에 적합하지 않다. 예를 들어,이 프로토콜은 상주 식세포를 수집하는 데 사용되어서는 안된다S, 신경 내분비 세포 또는 종종 하나의 세포와 같은 존재 침투 림프구. 이러한 다른 종류의 세포 분리를 용이하게하는 캡 막, 상 조직으로부터 단일 세포를 &quot;촬영&quot;으로 레이저를 이용하는 다른 LCM 악기 및 방법이있다. 철저한 품질 관리와 RNA의 특성을 간과 할 수 없습니다. 260 nm에서 흡광도를 RT-qPCR의 과정 (표 1)에 대한 RNA를 정량화하기 적합하지만, RNA 시퀀싱을보다 정확하게 염료 계 방법을위한 RNA를 정량화한다. RT-qPCR에 분석의 또 다른 중요한 문제는 잔여 DNA 오염의 잠재적 인 편견을 방지하는 것입니다. 이것은 인트론 걸쳐 프라이머를 사용하여 수행 할 수있다. 이 가정부 유전자 발현이 높은 환자 이질성 따라서 여러 가정부 유전자의 사용도 제안되고, 우리는 일반적으로 세 4,7-9 다섯에 사용 (그림 1B - C와 표 2). 4 시간을 감소 RNA 비교적 소량 필요하다. 차세대 RNA 염기 서열은 모두 짧고 긴 RNA 종에 대한 표현을 정량화 할 수있는 효과적인 기술이다. 차세대 시퀀싱은 새로운 RNA 종 (13)의 발견을 할 수 있습니다. 다행히도, 차세대 시퀀싱의 비용이 감소된다. 요약하면,이 프로토콜은 냉동 전립선 조직에서 상피 또는 간질 세포의 균일 한 집단의 RNA 분리 할 수​​ 있습니다. RNA는 양성 전립선 질환의 정확한 세포 유형 특이 적 유전자 발현을위한 도구를 제공하기 위해 다수의 다운 스트림 분석 기술에 사용될 수있다. 이러한 유형의 데이터가 지식에 기여RNA의 발현이 질병 병리학에서 다른 방법의 D 이해.

전립선은 주로 평활근 1로 구성 fibromuscular 기질에 둘러싸여 샘 꽈리에 배치 분비 상피 세포로 구성된 이종 조직이다. 기저 세포 분비 세포, 신경 내분비 세포, 중계 증폭 세포 및 줄기 세포 2 : 상피 구획 다섯 다르지만 조직 유형의 세포로 구성된다. 내강 상피 세포로부터 발생 전립선 암 (PCA)에있어서, 선암 성장 기질 구획 (3)의 점진적인 하락 분명시킨다. 이러한 이유로, 조직 표본은 PCA의 정도에 기초하여 기질과 상피 세포 유형의 비율 뚜렷한 차이가있을 것이다. 이러한 차이는 원하는 세포 유형의 미세 절제에 관계없이 전체 조직에서 얻은 유전자 발현 데이터의 바이어스 된 가정을 초래할 수있다. 따라서, 이러한 바이어스를 제거하는 것이 종래 RNA 추출 및 세포 유형을 분리하는 것이 필수적이다유전자 발현 분석. Macrodissection 미세 절제 또는 물리적 주변 기질 4 -6에서 잘 특성화 상피 영역을 분리하기 위해 사용될 수있다. Macrodissection는 일반적으로 해부 현미경 면도날으로 수행하고 큰 PCA는 기질에서 결절 분리 잘 작동하지만, 기질 주변에서 양성 상피를 제거 할 수 없습니다 (그림 1에서 양성 전립선 조직 검사의 예를 참조). 레이저 (LCM)와 미세 절제는 macrodissection보다 훨씬 더 많은 노동 집약적이지만, 매우 정확하게 양성 상피 (4)를 해부 할 수 있습니다. 우리의 실험실에서 최근 출판물은 RNA가 성공적으로 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 또는 냉동 조직 4,7-9 중 하나에서 LCM에 의해 추출 될 수 있음을 보여 주었다. LCM-RNA 추출의 주요 과제는 R 1)을 정확하게 조직의 원하는 부분을 해부하고, 2) 보존하려면LCM 및 분리 공정 4,10 동안 NA의 무결성. 순수한 세포 집단에서 분리 된 RNA는 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에) 7,8, 마이크로 어레이 (11), 및 깊은 -sequencing 12-14 포함한 여러 방법에 의해 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목적은 하류 유전자의 발현 분석을 위해 냉동 된 조직으로부터의 LCM 전립선 상피 세포에서 총 RNA를 분리하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&amp;nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrane 4.0 mm slides&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining jar)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining rack)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&amp;reg; CS</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser Microdissection System</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&amp;reg;-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Hematoxylin stain&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&amp;nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

이전 연구에서 우리는 동일한 환자 (4)로부터 냉동 FFPE 전립선 조직에서의 mRNA 및 마이크로 RNA의 RT-qPCR에 의해 발현 프로파일을 비교하는 상피 및 간질 조직을 수집하는 LCM의 사용을 설명했다. LCM은 RNA의 다량 차세대 염기 서열 분석을 위해 수집하는 경우 특히, 시간 소모적이다. 따라서, 작업 공간을 유지하는 것이 중요하며 툴 무연의 RNase. 그것은 (다음 단락에서 자세히 설명) 수집 RNA의 질 및 세포 특이성 제어를 검사하는 것을 권장합니다.도 1은 전과 레이저 캡처 양성 상피 후 현미경 PEN 프레임 슬라이드 염색 전립선 단면을 도시 . 샘플이 수집되어 RNA 신중 추출되면, 표 1에 나타낸 바와 같이 RNA의 질과 양을 평가하는 것이 중요하다. 이것은 낮은 260/280 nm의 비율을 관찰하는 것은 드문 일이 아니다. RNA를합니다 집중260/280 nm의 비율을 향상시킬뿐만 아니라 작은 RNA 종의 손실을 초래할 수있다. 품질 관리에 더하여, 그것은 조직 (- C도 1b)의 레이저 캡쳐 영역의 특이성을 확인하기 위해 세포 유형 특정 제어를 조사하는 것이 중요하다. 예를 들어,도 1b에 AMACR 유전자의 발현은 정상 상피 조직에 비해 전립선 암 상피 조직을 확인하는 측정 ,. 도 1C에 NKX3.1의 발현은 LCM 수집 된 샘플에서 기질의 유무를 확인했다. 시료에서 RNA의 품질도 알려진, 양질 RNA의 RN​​A에 compareed 수있다. RNA 추출 길고 작은 RNA (표 2)의 품질을 확인하는 일차 배양 상피 세포로부터 수집로 LCM-collected- 조직에서 분리 된 RNA를위한 RT-qPCR에 코네티컷 값이 동일한 범위에있다. 마지막으로, 표 3은 이러한 RNA 차세대 RNA의 sequenci 충분한 품질 인 것을 나타낸다NG. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53405/53405fig1.jpg" /> 그림 1 : 레이저 캡처 마이크로 해부에 의해 인간의 전립선에서 양성 상피 세포, 전립선 암 상피 세포와 기질의 컬렉션 전 및 양성 상피의 LCM 수집 후 톨루이딘 블루 염색 (A) 전립선 조직 검사.. (나 - C) 45 명에서 LCM에 의해 수집 된 조직은 세포의 정체성 (7)의 해당 유전자 마커를 표현한다. (B) AMACR 전립선 암의 마커 및 암 조직에서만 검출 가능하다. (C) NKX3.1는 상피 세포의 마커 및 간질 조직에서 검출되지 않습니다. 이 그림은 Giangreco 등., JSBMB 2015 7에서 수정됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53405/53405fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53405/53405tab1.jpg" /> 표 1 : LCM 렉트 전립선 조직으로부터 RNA의 질과 양. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53405/53405tab2.jpg" /> 표 2 : RT-qPCR에 LCM 수집 전립선 양성 상피에서. <img alt="표 3" src="/files/ftp_upload/53405/53405tab3.jpg" /> 표 3 : LCM-수집 된 전립선 조직에서 RNAseq.

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K 조회수.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

비디오: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

연구

의학

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

암 연구학

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

발생학

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

신경과학

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

생물학

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

인간 신장 조직에서 지역 전사학을 밝히기 위해 레이저 미세 절제술의 응용 프로그램

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...