Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
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이 작품 신경과 연구는 프로그램 NS061039 01A2 건강 보조금 K08의 국가 학회에 의해 지원 되었다 &#38; 발견, 그리고 미시간 대학에서 A. Alfred Taubman 의료 연구 연구소. 이 작품은 형태학 및 이미지 분석 핵심 미시간 당뇨병 연구 센터, 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신 장병에서 5 P 90 DK-20572 건강 그랜트의 국가 학회에 의해 투자의 사용. 저자는 인간의 피부 샘플의 그들의 관대 한 기부에 대 한 제이 로빈슨 싱글톤과 A. 고 든 스미스 (유타 대학) 감사 하 고 싶습니다.

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.
 1. 형광 Immunohistochemistry <ol><li>intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검: <ol><li>수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 &#39; s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.</li>
		<li>16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.</li>
		<li>최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.</li>
		<li>잘라 50 µ m 두께 cryostat를 사용 하 여 횡단면 고 180 µ L 부동 액 스토리지 솔루션을 사용 하 여 잘 (30% 에틸렌 글리콜, PBS에서 30% 글리세롤) 당 96 잘 접시의 개별 우물에 저장 합니다. 다음 방향 96 잘 접시의 8 우물입니다. 서로 떨어져 200-300 µ m에서 각 생 사이트 섹션 얼룩.</li>
	</ol></li></ol> 1 일: <ol start="2"> <li>지층 corneum의 일반적인 라벨 끄다: <ol><li>레이블 96 잘 접시 그림 1에서 보듯이.</li>
		<li>피펫으로 150 µ L 줄이기 위해 각 우물에 이차 항 체 34 , 35의 일반적인 바인딩 재고 신호 증강 솔루션의. 전송 섹션 inoculating 루프를 사용 하 여 신호 증강 솔루션으로. 
		참고: 조직 손상 또는 찢 어 조직 섹션을 피하기 위해 함께 작업 하는 동안 주의. 플랫 로커에 실 온에서 30 분 동안 신호 증강 솔루션에서 유지.</li>
		<li>준비 린스 각 우물에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 150 µ L을 추가 하 여 행 2와 3 96 잘 접시의 우물.</li>
		<li>신중 하 게 행 2와 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 린스 섹션 전송.</li>
		<li>린스 (3 행) 실 온에서 10 분에 대 한 1 x PBS에 두 번째 시간.</li>
	</ol></li> <li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 솔루션 준비: <ol><li>준비 5 %BSA 포함 하는 솔루션을 차단 하는 5%와 0.3% 트리톤 X 100 (TX-100) 0.1 M PBS (표 1 참조) 섹션 동안에 잠복기는 신호 증강 해결책입니다. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>각 우물에 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 4 행에 차단 우물 준비.</li>
		<li>솔루션을 차단 하는 5 %BSA 개별 우물으로 섹션을 전송 하 고 섹션 평면 로커에 실 온에서 1-2 h에 대 한 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 품 어.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션 및 주요 항 체의 희석을 rinsing 준비: <ol><li>TX-100 0.1 M PBS (표 2 참조) 동안 섹션 준비 1 %rinsing 솔루션 1 %BSA 0.3%를 포함 하는 5 %BSA 차단 솔루션에서 잠복기. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>섹션 5 %BSA 차단 솔루션에 잠복기는 하는 동안 1% BSA rinsing 솔루션에서 기본 항 체 희석.
		<ol><li>1500 µ L의 1 차적인 항 체 솔루션을 만들고 각 추가 행 5에서 잘.</li>
			<li>희석 주 항 체: 신경 관련 레이블, 토끼 polyclonal 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5)를 사용 하 여 1:1, 000에. 미토 콘 드리 아-특정 라벨을 사용 하 여, 단일 클로 널 항 pyruvate 효소 E2/E3bp 항 체 (PDH) 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 1: 100에서 마우스.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>준비 1 차 항 체: <ol><li>피펫으로 150 µ L 각 1 차적인 항 체의 잘에 96 잘 접시의 5 행.</li>
		<li>루프 도구를 사용 하 여 1 차적인 항 체를 포함 하는 5 행에 차단 솔루션 (4 행)에서 전송 섹션.</li>
		<li>단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 parafilm으로 접시 포장.</li>
		<li>1 시간 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 º C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 주 2: <ol start="6"> <li>린스 샘플: <ol><li>행 6, 7, 8 각 우물에 솔루션을 rinsing 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 준비 린스 우물.</li>
		<li>첫 1% BSA rinsing 솔루션 (6 행)에 섹션을 전송 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 린스 섹션 1 %BSA 실 온에서 7과 1 시간에 8 행에 솔루션을 rinsing에 잠복기에 의해 두 번 더 반복.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션을 rinsing에 이차 항 체 희석: <ol><li>이차 항 체 솔루션 섹션 1 %BSA 솔루션 (8 행)을 rinsing의 마지막 린스에 잠복기는 하는 동안 만들 1500 µ L.</li>
		<li>이차 항 체 희석: PGP9.5 (녹색 형광 활용된 염소 안티 토끼 항 체, 1:1000), 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 PDH (레드 형광 활용된 염소 반대로 마우스, 1:1, 000)에 대 한 대 한.</li>
	</ol></li> <li>준비 이차 항 체: <ol><li>96 잘 접시의 9 행으로 이차 항 체의 피펫으로 150 µ L.</li>
		<li>부드럽게 이차 항 체 웰 스 (행 9)에 해결책 (8 행)을 rinsing 1 %BSA 섹션을 전송.</li>
		<li>사용 parafilm 랩 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 접시. 커버 알루미늄 호 일. 1 시간에 대 한 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 ˚C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 제 3 일: <ol start="9"> <li>준비는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 1 x PBS 청소: <ol><li>피펫으로 150 µ L의 행 10, 11 및 12에 1 x PBS를 필터링.</li>
		<li>행 10 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 h 1 x PBS에 씻어. 커버 알루미늄 호 일로 96 잘 접시 고 린스 동안 플랫 로커에 놓습니다. 반복 필터링 PBS 린스 2 x 1 번 더 각 행 11 및 12에에서 실 온에서 1 h.</li>
	</ol></li> <li>현미경 슬라이드 조직 단면도 장착을 위한 준비: <ol><li>장소 50 µ L의 필터링 슬라이드 1 x PBS.</li>
		<li>50으로 1 x PBS (행 12)에서 전송 섹션 µ L 드롭. 신중 하 게 조직 전개 하 고 부드럽게 유리 슬라이드에 병합 하 여 PBS의 드롭에 섹션을 배치 합니다. 유리 피 펫을 장착 시 약 희석을 피하기 위해 초과 PBS를 제거 합니다. 섹션 유리 전구를 만지지 마십시오.</li>
		<li>피펫으로 1-2 방울 DAPI를 포함 하는 사용 하 여 현미경 슬라이드 섹션 위에 직접 장착 시 약의 관리 섹션의 방향을 방해 하지. 부드럽게 섹션 50 mm x 24 mm #1.5 현미경 유리 coverslip 장소.</li>
		<li>고는 coverslip 배치 하면서 형성 된 기포는 coverslip 가장자리에서 과잉 액체를 닦아. 새 슬라이드를 준비 하 고 장착 홍보를 반복각 섹션에 대 한 ocess.</li>
		<li>치료/건조 실 온에서 어두운 하룻밤에 슬라이드를 삽입 하 여 설치 미디어. 슬라이드 4 ° C 또는-20 ° C (2 주 이상) 장기 저장을 위한 단기 (1-2 주)에 대 한 전송. 
		주: 부정적인 컨트롤 단계 1.4.2.2에서에서 PGP9.5 또는 PDH에 대 한 1 차 항 체를 생략 하 고 신경이 나 표 피에서 미토 콘 드리 아의 구별할 수 없는 라벨 표시. 컨트롤이 수행한 긍정적인는 PDH에 대 한 항 체 그것을 증명 하기 위해 레이블이 모든 미토 콘 드리 아 (데이터 표시 되지 않음). 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호 레이블 미토 콘 드리 아를 잠재로 불리고 그리고 다음 고정 되었고 PDH 항 체와 붉은 형광 스테인드 교양된 기본 마우스 지 루트 ganglion 신경에 긍정적인 컨트롤 수행 이차 항 체입니다. GFP를 표현 했다 모든 미토 콘 드리 아 공동 PDH immunohistochemistry (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 레드 라벨으로 분류 했다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 영상 <ol><li>confocal 영상 수행: <ol><li>수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
		<ol><li>각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득: 핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420-480 nm 신경 섬유: 여기 λ = 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505-560 nm Mitoch ondria: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>현미경 소프트웨어에 다음과 같은 검색 매개 변수를 입력: 2 프레임 평균 및 2.2;의 확대와 함께 600 Hz의 스캔 속도 12 비트 강도 해상도 (4096 회색 수준)입니다.
		<ol><li>설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm). 
			참고: 결과 XYZ 해상도 172.2 x 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 이미지 크기와 172.2 nm x 210 nm nm.</li>
		</ol></li> <li>신경 신호 (그린 형광)에 대 한 실시간 검색을 활성화 하 고 찾아서 설정 상단 z-초점 조정 조직 섹션 내에서 신경 신호를 포함 하는 현미경 소프트웨어에 초점 비행기를 내립니다. 총 z 범위는 일반적으로 30-50 µ m 50 µ m 조직 섹션.</li>
		<li>표 피는 가로 또는 세로로 위치에 이미지 라이브 검색 중 현미경 소프트웨어 검색 필드를 회전.</li>
		<li>별도로 각 신호를 스캔 하 고 검출기 (광 전 증폭 관 관, PMT) 조정 전압 및 오프셋 어떤 이상과 포화 픽셀에서 최소화/제거. 
		참고: 위의 매개 변수 검사 시간이 걸릴 z 조각 수에 따라 약 20-40 분.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D 시각화 및 분석의 미토 콘 드리 아 내에서 인간 Intraepidermal 신경 섬유 <ol><li>3D 표 피 분리: <ol><li>원본 이미지를 복제 하 고 최대 강도 사용 하 여 식별 하 고 표 피를 분리 하는 이미지의 (초점 보기 확장) 프로젝션.</li>
		<li>결 석 지층 corneum 피부 등의 원치 않는 영역을 제거 하려면 표 피의 위쪽과 아래쪽 가장자리를 따라 추적 도구 관심의 영역을 사용 intraepidermal 신경 섬유의. 이 선택 영역을 자르기.</li>
	</ol></li> <li>신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호에 사용 deconvolution: 참고: Deconvolution 형광 신호 무결성을 복원 하는 데 도움이. 이미지에 그들의 원래 소스에서 신호를 확산 하는 얼마나 많은 결정 하는 형광 신호를 사용 하기 때문에이 프로토콜에서 사용 하는 복원 장 님 deconvolution 이라고 (지점 확산 기능). 프로세스는 그것의 원래 위치에 다시 확산 신호를 재할당 함으로써 신호 해상도를 향상 시킵니다.
	<ol><li>계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수: <ol><li>설정 계산된 PSF confocal. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기 1 공기 단위 (거리)를 설정 합니다. 설정된 레이저 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>PSF 빨간 형광 미토 콘 드리 아 신호 (레드 형광)에 대 한 다음 매개 변수 계산: <ol><li>세트 confocal PSF 계산. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기를 1로 설정 AU. 617 543 nm 및 방출 파장을 설정된 레이저 여기 파장 nm.</li>
		</ol></li> <li>Deconvolution 해당 PSFs를 사용 하 여 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호는 위에 나열 된 최적화와 반복 복원 기능 설정 100% 자신감 10 사이클의 반복 제한.</li>
	</ol></li> <li>신경 특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구 deconvolved 녹색 형광 보조 라벨에 PGP9.5의에서 신경의 단단한 표면을 식별 신경.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능을 사용 하 여 절대 강도 기능 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 상당히 밝은 배경 형광 보다.</li>
		<li>절대 강도 기능 사용 하 여 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 크게 배경 형광 보다 밝은. 정확 하 게 식별 하는 신경을 충분히 낮은 임계값 설정.</li>
		<li>필터 작은, 비 신경 표면 밖으로 크기에 따라. 
		참고: 필요한 경우 수동으로 편집 내 추가 비 신경 서피스는 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 강조 하기 위해 제어 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.</li>
	</ol></li> <li>격리 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호: <ol><li>볼 신경 표면의 편집 탭을 선택 하는 &#34; 마스크 속성 &#34; 기능. 단계 3.3에서에서 만든 신경 표면은 keratinocytes와 관련 된 미토 콘 드리 아 신호에서 그 신경 내의 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 됩니다.</li>
		<li>로 &#34; 마스크 모든 &#39; 엽니다 단추는 &#34; 마스크 채널 &#34; 창, 풀 다운 메뉴 아래에서 deconvolved 레드-형광 신호를 선택 &#34; 채널 선택 &#34; 미토 콘 드리 아 신호.</li>
		<li>확인 표시를 넣어 하 고 상자에 클릭 합니다 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 중복 채널 &#34; 옵션.</li>
		<li>클릭 라디오 버튼의 앞에 &#34; 일정 내부/외부 &#34; 확인 표시를 넣어 하 고 마스크 설정 상자에서 클릭 옵션은 &#34; 설정에 외면 복 &#34; 옵션 및 입력 값에 대 한 0.00. 확인을 클릭 버튼을 만들 신경 표면 내 미토 콘 드리 아 신호를 나타내는 새로운 채널.</li>
	</ol></li> <li>미토 콘 드리 아-특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호를의 새로 만든된 형광 채널에서는 미토 콘 드리 아의 단단한 표면 3.4 단계.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능 및 선택은 &#34; 배경 빼기 &#34; 임계값을 설정 하는 기능. 이 기능은 미토 콘 드리 아 신호 주변 지역 대비를 사용 하 여 배경에서 미토 콘 드리 아를 식별.</li>
		<li>세트 미토 콘 드리 아를 정확 하 게 식별 하 게 충분히 낮은 임계값 값입니다. 이 예제에서 더 낮은 임계값 2000 16 비트 (65536) 규모에 대 한 설정 했다.</li>
		<li>필터 크기에 따라 미토 콘 드리 아 표면. 이 예제에서는 1.0 복 복 제한 설정, 최저는 제한 가능 합니다. 필요한 경우 수동으로 내 미토 콘 드리 아 비 표면에 밖으로 편집 된 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 선택 하려면 CONTROL 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭. 
		참고: 때때로, 소프트웨어가 만들어집니다 구별할 수 형광 미토 콘 드리 아 신호 연결 되지 않은 표면. 이러한 경우에, 그것은 그들을 제거할 수 있는 &#34; 편집 &#34; 탭</li>
	</ol></li> <li>수출 분석에 대 한 형태학 값 계산: <ol><li>신경 및에서 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 값을 내보내기는 &#34; 통계 &#34; 전자 스프레드시트 소프트웨어와 추가 분석을 위해 탭.</li>
		<li>신경 및 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 값을 내보낼.</li>
		<li>개별 신경 섬유에 각 이미지의 수를 세 고 전자 스프레드시트에 값을 기록.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 전자 스프레드시트에서 분석에 대 한 다음 잠재적인 값 계산: <ol><li>모든 신경 표면 위한 볼륨 합계.</li>
			<li>필터 보다 0.02 µ m 3와 빈의 볼륨 아래 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 밖으로 표면 크기. 예를 들어 0.02-같은 저장소를 사용 하 여 0.04 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28 1.28-2.56, 2.56 µ m 3 보다 큰. 
			참고: 0.02 µ m 3 mitonchodria 36 , , 37 38의 이전 게시 된 볼륨에 따라 미토 콘 드리 아 볼륨의 하한값 설정.</li>
			<li>쓰레기통 (0.02-2.56 µ m 3 이상)를 통해 각 빈 내 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 수와 표면의 총 수를 계산.</li>
			<li>신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 각 빈에서의 비율을 계산합니다. 수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 표면의 총 수로 나눈 빈 당.</li>
			<li>모든 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 합계.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 볼륨의 합으로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 미토 콘 드리 아 신호 신경의 비율을 계산.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 수로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 신경 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수를 계산.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

아니 충돌의 관심 선언.

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및 3D 분석에 필요한 50 µ m 섹션에 걸쳐 이미지 수집을 극대화 하기 위해 조직에 항 체의 침투에 대 한 수 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 이미지 수집 매개 변수를 측정 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 해상도 유지 하면서 이미지 당 충분 한 신경을 캡처 사이 균형 이다. 조직 섹션에 사용 하 고 표준 피부 생 검 프로토콜은 약 3 m m 긴45,,4647,48. 인수 매개 변수가 프로토콜 캡처 이미지 당 4-6 신경 섬유의 평균을 포함 하는 표 피의 충분히 설명 합니다. 더 높은 해상도에서 샘플링 크게 나이 키스 트 샘플링에서 특히 각 이미지에 신경의 수를 줄일 것 이다. 세 번째 중요 한 단계는 신호, 특히 미토 콘 드리 아의 명암과 해상도 개선 하기 위해 deconvolution 알고리즘을 사용 하는. Deconvolution 이미지의 높은 해상도에서 샘플링 하지에 대 한 보상 도움이. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 표 피 세포와 관련 된 미토 콘 드리 아에서 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하는 마지막 중요 한 단계가입니다. 이것은 신경 내에서 지역화 미토 콘 드리 아 신호 자르려면 신경 표면 마스킹 도구 사용 하 여 수행 됩니다.
고려 하는 것이 기술의 일부 잠재적인 수정 있다. 한 가지 가능한 수정 형광 immunohistochemistry의 기간을 단축 하는 것입니다. 4 ° C에서 1 차 및 이차 항 체 솔루션에 하룻밤 외피는 실 온에서 3-4 시간 단축 될 수 있습니다. 그러나, 실내 온도에 짧은 외피 종종 배경 형광, 그래서 증가 주의 가난한 신호 잡음을 피하기 위하여 취해야 한다. 또 다른 가능한 수정 이미지 수집 매개 변수를 조정 하는 것입니다. 위에서 설명 했 듯이, 여기에 설명 된 이미지 수집 이미지 당 신경의 적당 한 수 높은 이미지 해상도 통해 캡처 향해 편견 했다. 1.3 숫자 조리개와 63 x 기름 침수 목표 등 높은 배율 목표를 사용 하 여 가능 하다. 모든 매개 변수는 동일한 유지 63 X 목표 사용 되었다 XY 이미지 필드 112 µ m x 112 µ m 줄어들 것이 고 따라서 당 이미지 신경의 평균 수를 감소. 주요 포인트 획득 및 후속 분석을 통해 일관 된 매개 변수를 사용 하는 것입니다.
이 기술의 주요 제한은 시간이 소모 되는 것입니다. immunohistochemistry 조직 처리 3 일 소요, 이미지 수집 얼마나 많은 광학 z 단계 찍힌다, 따라 하는 이미지 당 약 30-50 분 걸리며 영상 처리/분석 약 20 분 소요. 이것은 중요 한 시간 투입 이다 하지만 결국에서 중요 한 형태학 측정을 생성. 이 기술의 또 다른 한계는 표 피 이미지 당 샘플의 제한 된 영역입니다. 그러나,이 의심할 여 지 없이 빠른 컴퓨터 프로세서 및 분석 소프트웨어와 결합 하는 향상 된 해상도와 이미지 수집 속도에 만들어진 발전을 향상 됩니다.
다른 방법을 통해이 프로토콜의 중요성 confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 분석 형광 immunohistochemistry 결합의 힘은. 전통적으로, intraepidermal 신경 섬유 분석 기반 chromogen immunohistochemistry와 밝은 분야 현미경 검사 법, 특히 신경45,,4749의 임상 진단을 위해 이루어집니다. 형광 immunohistochemistry 사용 얼룩 하 고 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석할 수 있습니다. 이 기법은 관심,이 경우 신경 특정 미토 콘 드리 아, 복잡 한 신호에서 미토 콘 드리 아 표 피 세포와 관련 된 특정 신호를 분리 하는 전략을 제공 합니다.
이 기술은 파워 미래의 응용 프로그램에서 그것의 유용성입니다. 격리 하 고 측정 신경 특정 미토 콘 드리 아 기능 질병 유발 변경 크기와 미토 콘 드리 아의 분포를 평가 가능 하 게. 여러 신경 합병증은 질병의 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애를 연루 있다. 특히,이 기술은의 수정된 된 버전 당뇨병과 당뇨병 주변 신경 병을 가진 환자는 크기와 일치 하는 나이에 비해 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 측정 가능 변화를 설명 하는 데 사용 되었습니다. 50을 제어합니다. 이 기술을 개선 하거나 감각 neuropathies를 치료 하도록 설계 된 치료의 효과 평가 하는 데 유용할 것 이다. 마지막으로, 기술의 다양성은 다양 한 형광 신호 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 사용 하 여 분석에 적용 합니다.

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸4 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP5,6시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.
정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 , 10. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.
미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 17. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격19-21을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.
함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축15,,2425,26,27. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni&#039;s Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&amp;nbsp;</td><td>1459A</td><td>2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>To make up 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td><td>enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td></tr><tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td></tr><tr><td>Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>abbreviated as PDH</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td></tr><tr><td>Albumin, from Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>abbreviated as BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>abbreviated as TX-100</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Filter</td><td>EMD Millipore, Billerica&lt;br/&gt; MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 &amp;micro;m Millipore filter</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Non-calibrated Loop</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>96-well Assay Plate</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>96-well flat bottom plate</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>DAPI staining of nuclei</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Coverslips</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15</td><td>Microscope Slides</td></tr><tr><td>Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Volocity x64 Software&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Waltham , MA</td><td>version 4.4.0</td><td>Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td></tr><tr><td>Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>version 7.7.1</td><td>Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>version Office 2013</td><td>Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature Compound</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>abbreviated as OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat for cutting 50 &amp;micro;m sections</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td></tr></tbody></table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화
형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루션의 12 단계를 통해 처리 될 8 섹션까지 보여준다. 무료-부동 메서드 플랫 로커와 부드러운 동요와 결합 항 체 양쪽에서 섹션 침투에 대 한 충분 한 액세스는 보장 합니다. 프로토콜 기본 및 보조는 항 체 4 ° C에서 지속적으로 신경 및 미토 콘 드리 아를 라벨에 하룻밤 외피 때문에 크게는 완료, 3 일이 걸린다.
절차의 나머지 통합 이미징, 처리 및 형광 신호 분석. Confocal 현미경 검사 법은 형광 신호 광학 섹션 이산 신호 초점면에서 밖의 초점 신호를 제거 하 여 합니다. 조직 섹션을 통해 z 시리즈의 수집의 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵에 대 한 형광 신호 3D 표현을 제공합니다. 매개 변수 5 신경의 평균을 포함 하는 표 피의 길이 따라 이미지 172 µ m에 최적화 되어 있다. 그림 2 에서는 표 피에서 수집 된 3 개의 형광 신호의 전형적인 3D 이미지를 보여 줍니다. PGP9.5 얼룩 (그림 2B) 조직의 배경 자동 형광 보다 더 높은 강도 표 피 및 진 신경의 풍부한 신호를 제공 합니다. 핵 얼룩 (그림 2C) 표 피 intraepidermal 신경 섬유 자극의 경계를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 표 피 때문일 수 지층 corneum 구성 하는 corneocytes에 잔여 DNA 확산 신호를 외부 층에 대 한 일반적입니다. Mitochondria는 PDH 얼룩 (그림 2D) 신호의 대부분은 주로 keratinocytes는 표 피 세포와 관련 하 여 명확 하 게 표시 되어 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 인수 매개 1.25 숫자 조리개와 2.2의 확대/축소 비율 기름 침수 목표 X 40을 사용 합니다. 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 XYZ 이미지 크기에이 결과. 이러한 설정은 충분히 이미지 (그림 3A) 당 4-6 신경 섬유의 평균을 포함 하는 표 피를 캡처합니다. 더 높은 해상도에서 샘플링 각 이미지에 신경의 수를 줄일 것 이다. 그림 3B 이미지 당 적은 신경 인 114.8 µ m x 114.8 µ m XY 영역 감소, 3.3, 확대/축소 비율을 보여 줍니다. 이상적인 샘플링 밀도 x 1.25 숫자 조리개와 기름 침수 목표 40에 대 한 퀴 (http://www.svi.nl/NyquistCalculator)에 의해 정의 된 대로 54 nm x 54 nm x 205 nm의 XYZ 스캔 해상도 제안 합니다. 이 6.6 배 1024 x 1024 해상도에서 확대/축소 비율을 필요 것 57.4 µ m x 57.4 µ m XY 보기를 감소 하 고 캡처할 이미지 (그림 3C) 당 1-2 신경의 평균.
다음 단계는 이미지의 원치 않는 영역을 제거 하 고 신호를 향상 시키기 위해 이미지 처리를 수행 하는. 이 프로토콜에서 진 피와 지층 corneum는 IENFs 자극 하는 표 피 지역에 분석을 집중 하기 위해 제거 됩니다. 3 차원 소프트웨어 분리, 강화 하 고 형광 신호를 분석할 수 있습니다. 소프트웨어 도구 영역 위와 아래 (그림 4A-C) 표 피 밖으로 자르기에 의해 표 피 신경 및 미토 콘 드리 아를 격리 하기 위해 필요 합니다. 이 프로세스는 확장된 보기에 신호를 축소 하 고 다음 표 피 주위의 자유 영역을 추적 하 여 간단 합니다. 자른된 이미지 추가 이미지 복원 알고리즘에 의해 처리 됩니다. Deconvolution 신경 및 미토 콘 드리 아 신호 (그림 4D)의 해상도 최적화 하는 데 사용 됩니다.
마지막 단계를 감지 하 여 신호에서 형태학 기능 추출입니다. 이 프로토콜의 중요 한 부분 신경 특정 미토 콘 드리 아의 기능을 측정 하는 것입니다. 이미지 분석 소프트웨어는 그 표면에 내에서 (이 경우 미토 콘 드리 아)에서 다른 형광 신호를 분리 하는 마스킹 도구로 만든 표면 (이 경우 신경 표면)에서 하나의 신호에 대 한 사용 하는 기능이 있습니다. 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분석의 첫 번째 단계는 3D 표면 주위 신경 (그림 5A-B)를 만드는 것입니다. 신경 표면 다음 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호 (그림 5C, 5D, 5E, 5 G)을 수확 하는 데 사용 됩니다. 마지막으로, 3D 표면 체적 측정 (그림 5 층, 5H)를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호 주위 만들어집니다. 표 3 은 형태학 측정 이미지 분석 소프트웨어 및 요약 데이터에서 수출을 보여준다. 수출을 주요 값은 신경 및 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호에 대 한 볼륨 값입니다. 미토 콘 드리 아에서 볼륨 데이터 크기 주파수 히스토그램 (그림 6)를 생성 하는 데 사용 되는 미토 콘 드리 아 크기 주파수 데이터를 생성 하 범주화 됩니다. 볼륨 데이터 또한 IENF 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수와 IENF 볼륨 내에서 미토 콘 드리 아 볼륨의 비율에 대 한 요약 조치를 확인 하는 데 사용 됩니다.
표 3, 그림 6 에 표시 데이터가이 기술은 피부 생 검에서 인간의 IENFs 내 미토 콘 드리 아를 계량 하는 수단을 제공 합니다 입증. 이 샘플에서 신경 있다 미토 콘 드리 아를 통해 배포 하 고 미토 콘 드리 아의 대다수 0.02-사이 0.32 µ m3. 이 크기는 정상적인 미토 콘 드리 아36,37,,3839와 관련 된 범위에 있습니다. 작은 미토 콘 드리 아 큰 미토 콘 드리 아39 이 신경에 미토 콘 드리 아 더 운동 될 수도 있습니다 제안 보다 더 많은 운동 되도록 표시 되었습니다. 실제로, 연구는 더 큰, 부 미토 콘 드리 아 작은 미토 콘 드리 아 뿐만 아니라 수송 하지 않습니다 및 axonal 변성39,,4041로 이어질 수 있습니다 연루 있다. 따라서, 신경 특정 미토 콘 드리 아의 특성은 어디 미토 콘 드 리아 형태 및 전송에 변화가 axonal 변성 와 연결 하는 신경 퇴행 성 질환의 연구에 적용할 수 있을 것 이라고 하는 귀중 한 기술 15,25,26,27,,4243.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">5 %BSA 차단 솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 %BSA 차단 솔루션의 구성 요소</td>
			<td>필요한 금액</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소 혈 청 알 부 민 (BSA) [최종 농도: 5%]</td>
			<td>0.625 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0% 트라이 톤 X-100 (TX-100) [최종 농도: 0.3%]</td>
</tr></tbody></table>			<td>3.75 mL</td>
		
		<tr>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>~8.125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 (12.5 ml 전체 볼륨을가지고 1 X PBS를 사용)</td>
			<td>12.5 mL</td>
		</tr>
	

표 1: 솔루션을 차단 하는 5 %BSA. 5 %BSA 차단 솔루션 차단 항 체의 비 특정 바인딩 immunohistochemistry 프로토콜의 초기 단계에서 사용 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">1% BSA Rinsing 솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% BSA Rinsing 솔루션의 구성 요소</td>
			<td>필요한 금액</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소 혈 청 알 부 민 (BSA) [최종 농도: 1%]</td>
			<td>0.125 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 %TX-100 [최종 농도: 0.3%]</td>
			<td>3.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>~8.125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 (12.5 ml 전체 볼륨을가지고 1 X PBS를 사용)</td>
			<td>12.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 1 %BSA 솔루션을 Rinsing. 1 %BSA 솔루션을 rinsing immunohistochemistry 프로토콜에서 사용 하는 차단 항 체의 비 특정 바인딩 및 차 및 2 차 항 체를 diluting에 대 한 사용.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="9">IENFs 및 신경 특정 미토 콘 드리 아에 대 한 형태학 측정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="9">이미지 분석 소프트웨어에서 내보낸 및 요약 데이터</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마운트 크기 주파수 방식</td>
			<td>Mt 크기 주파수 빈에서의 수</td>
			<td>빈에서 산의 비율</td>
			<td>Mt의 총 수</td>
			<td>마운트 볼륨 (µ m3)</td>
			<td>IENF 볼륨 (µ m3)</td>
			<td>IENF 볼륨 (수/100 µ m3) 당 산 수</td>
			<td>IENF 볼륨에서 마운트 볼륨의 비율</td>
			<td>IENFs의 수</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .04.02 µ m3</td>
			<td>20</td>
			<td>24.4%</td>
			<td>82</td>
			<td>13.41</td>
			<td>518.88</td>
			<td>15.8</td>
			<td>2.58%</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .04.08 µ m3</td>
			<td>28</td>
			<td>34.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .08.16 µ m3</td>
			<td>14</td>
			<td>17.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .16.32 µ m3</td>
			<td>12</td>
			<td>14.6%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .32-.64 µ m3</td>
			<td>4</td>
			<td>4.9%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 .64 1.28 µ m3</td>
			<td>3</td>
			<td>3.7%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 1.28-2.56 µ m3</td>
			<td>1</td>
			<td>1.2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이 2.56 + µ m3</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: IENFs 및 신경 특정 미토 콘 드리 아에 대 한 형태학 측정. 테이블을 측정 이미지 분석 소프트웨어 및 요약 데이터에서 내보낸 형태학 값을 나타냅니다. 약어: IENF, intraepidermal 신경 섬유; Mt, 미토 콘 드리 아
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig1.jpg"> 
그림 1 : 피부 생 검 Immunohistochemistry 96 잘 접시에 대 한 설치 프로그램을 대표 하는 회로도. 접시에 행 블록, 세척 및 부 화 솔루션에 대 한 프로토콜의 단계와 열 (1 접시 당 8 섹션)에서 개별 조직 단면도 대표 합니다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig2.jpg"> 
그림 2 : 대표 3D 형광 Immunohistochemistry 인간의 표 피 생 검에서 조직 단면도의 Confocal 현미경 이미지 처리. 처리 되지 않은 3D 프로젝션 이미지 병합 (A) 형광 신호 및 개별 신호 (B) 신경 (신경, 녹색), (C) 핵 (Nuc, 블루) 및 (D) 미토 콘 드리 아 (Mt, 레드)는 표 피에 대 한 설명 및 진 피입니다. 표 피의 지층 corneum 계층에 신호의 부족 note 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig3.jpg"> 
그림 3 : 이미지 해상도 결과 적은 신경에 후속 분석을 위해 개선. 모든 이미지는 1.25 숫자 조리개와 40 X 오일 목적으로 캡처하고 3D 프로젝션 신경 (녹색), 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색) 및 핵 (Nuc, 블루)에 대 한 형광 신호를 설명 합니다. 2.2 (A) 의 확대/축소 비율에서 찍은 이미지 뷰 내에서 여러 가지 신경을 포함 되어 있습니다. 3.3 (B) 또는 6.6 (C)확대/축소 비율 증가, 이상적인 나이 키스 트 샘플링, 크게 각 이미지 내에서 신경의 수가 줄어듭니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig4.jpg"> 
그림 4 : 이미지 처리. 대표 인간의 표 피 생 검에서 조직 단면도의 confocal 현미경 검사 법에서 이미지의 초점 (최대 강도 투영) 보기를 확장합니다. 처리 되지 않은 프로젝션 이미지 (A) (녹색), 신경 핵 (Nuc, 파란색)과 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색)에 대 한 병합 된 형광 신호를 보여 줍니다. 진 피와 지층 corneum는 inte의 영역이 잘릴 (B)나머지 (ROI) 자유 선택 도구 (강조 표시 된 영역을 블루, ROI를 자르기)는 표 피에만 신호를 분리. (C) 자른 표 피는 계산 된 포인트 (D) deconvolution 확산 신경 (녹색)의 해상도 개선 하는 기능에 대 한 처리 및 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색) 신호. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig5.jpg"> 
그림 5 : 이미지 분석. 대표적인 3D confocal 현미경 이미지 (A)에서는 신경 관련 녹색 형광 신호. (B) 3 차원 표면 (녹청) 신경 신호에 대 한 만들어집니다. 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호 (D) 신경 표면 마스킹 도구를 사용 하 여 (C) 상피 미토 콘 드리 아 신호 (Mt, 빨간색)의 나머지 부분에서 격리 됩니다. 신경-특정 미토 콘 드 리아 빨간색 형광 신호는 결과 (E, G) (F, H) 신경 표면 (녹청) 내의 미토 콘 드리 아 주위 표면 (Mt 표면, 마젠타색). G와 H는 E에서 흰색 상자의 확대 보기 및 F. 규모 바 = 20 µ m (A-F), 5 µ m (G-H). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig6.jpg"> 
그림 6 : 미토 콘 드리 아의 크기 주파수 히스토그램. Mitochondrialsurface 데이터는 그들의 볼륨 (µ m3)에 따라 다양 한 쓰레기통의 각각에 존재 하는 미토 콘 드리 아의 비율을 시각화 하는 크기 주파수 히스토그램으로 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K 조회수.  University of Michigan Medical School. 이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

비디오: Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

연구

의학

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

신경과학

췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 시각화하는 3D 기술

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

저자 스포트라이트: 췌장암 세포의 미토콘드리아 초구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법  

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

암 연구학

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

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