Name: temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

여기에 설명 된 프로토콜은 급성 림프 모구 백혈병 세포주 NALM6를 사용하지만, 다른 유형의 세포에도 적용 할 수있다. 1. 솔루션 및 시약 <ol><li> 전체 RPMI <ol><li> 56 ml의 소 태아 혈청 (FCS) 및 RPMI-1640 배지 500㎖의 병에 200 ml의 5.5 mm의 L - 글루타민 추가. </li></ol></li><li> BrdU의 원액 <ol><li> 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 32.5 mM의 BrdU의 (10 ㎎ / ㎖)을 준비합니다. </li></ol></li><li> BrdU의 전체 RPMI <ol><li> 전체 RPMI 10 ㎖에 BrdU의 주식 솔루션의 6.2 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> DNase의 솔루션 <ol><li> 1 밀리그램의 DNase / DPBS에 mL로 준비합니다. </li></ol></li><li> 염색 버퍼 <ol><li> DPBS에서 3 % 열 - 불 활성화 FCS 및 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 준비한다. </li></ol></li><li> 고정 버퍼, 투과성으로 버퍼 및 세척 버퍼의 정의에 대한 자료 목록을 참조하십시오. </li></ol> 2. 세포 아니테 : 세포 6 개월을 초과하는 배양하지 않았다. 이 방법은 셀 밀도 및 배양 배지에 대한 조정과 비 - 부착 세포 라인에 직접 적용 할 것이다. 실험의 개시에 기하 급수적으로 증가하고 세포를 사용합니다. <ol><li> 전체 RPMI에서 T-75 배양 플라스크에 NALM6 세포를 유지한다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛을 사용하여 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 세 번 주간 문화를 분할하여 ml의 당 6 10 × 1-2 사이의 세포를 NALM6 세포를 유지한다. </li><li> 공기에서 이산화탄소 5 %에서 37 ° C에서 품어. </li></ol></li></ol> BrdU의와 세포의 3 펄스 라벨링 주의 : 잠재적 돌연변이와 기형은주의하여 BrdU의를 처리합니다. <ol><li> 5 분 150 XG에 원심 분리기 세포. 참고 : 신선한 매체에 세포를 전송하는 것은 결과의 재현성을 향상시킨다. </li><li> 2 × 106 (C)에서 완전 RPMI에서 세포 수와 세포를 재현 탁 수행ELL 학생 / ㎖. </li><li> BrdU를 완전 RPMI 1 × 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 생산하는 두 셀 1 희석. </li><li> 다음 완전한 RPMI 10 셀 1 희석, 45 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션. 조심스럽게 (150) 5 분 XG와 원심 분리기 세포 상층 액을 모두 폐기합니다. </li><li> 완전한 RPMI의 작은 부피 (~ 100 μL)에 재현 탁 된 세포는 세포 수를 수행하고 1 × 106 세포 / ml로 조정한다. </li><li> 피펫 48 웰 플레이트로 세포를 1 ㎖. 모든 빈 우물에 DPBS의 피펫 1 ml를 더 재현 가능한 결과를 얻을 수있다. </li><li> (17) 여기에서, 원하는 시점들, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 공기 중 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 부화 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24 시간. 참고 : 시간의 길이는 실험 설계 측정하는 것을 목표로 무엇에 따라 달라집니다. </li><li> 피펫을 사용하여 외과 튜브로 모든 세포를 전송합니다. 1ml의 volu로 잘 헹구고 순차적5 ㎖의 최종 총 부피의 PBS MES. </li><li> 5 분 150 XG에 원심 분리기 조심스럽게 모든 뜨는을 제거합니다. 세포를 염색 할 준비가 즉시 (4 절)을 수행합니다. </li></ol> 4. 세포 얼룩 주 : 세포 표면 염색이 필요한 경우 세포에 걸쳐 4 ℃로 유지되는 것을 보장하기 전에 고정을 수행한다. <ol><li> 염색 버퍼 100 ㎕에 재현 탁 세포 (옵션 표면 염색은 항원을 표면 및 4 ℃에서 30 분 동안 배양 항체의 권장 볼륨을 추가). </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 염색 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고 상층 액을 버린다. 참고 : 등 특정 항체 농도, 배양 시간을 특정 실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 고정과 투과성으로 <ol><li> 고정 버퍼 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 1 ml의 O 추가F 세척 버퍼, 150 XG에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 버린다. </li><li> 투과성으로 완충액 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 얼음에 10 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 세척 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다. </li><li> 튜브 당 고정 버퍼 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 세척 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다. 주 : 필요한 경우, 프로토콜은 여기에서 일시 정지 될 수있다. 염색 완충액 경우 고정 된 세포는 4 ° C에서 며칠 동안 안정하다. 진행하기 전에 원심 분리 다음 염색 버퍼를 제거합니다. </li></ol></li><li> DNase의 치료 <ol><li> DNase의 용액 100 ㎕ (30 DNase의 / 10 6 세포의 μg의), 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 배양에 재현 탁 세포. </li><li> 5 분 150 XG에 세척 버퍼, 원심 분리기 1 ML을 추가하고 상층 액을 버린다. </리&gt; </ol></li><li> 항체 염색 주 : BrdU의 이외의 세포 마커 염색 BrdU의 염색과 동시에 행할 수있다. <ol><li> 중요 : 각 하나의 형광 색소로 표지 흠없는 세포와 세포로 구성된 보상 컨트롤을 준비합니다. 이상적으로, 실험 튜브에 사용되는 것과 같은 보상 컨트롤 같은 항체를 사용합니다. 이것이 가능하지 않을 경우, 고도로 발현 항원 항체 대신 동일한 형광 색소에 접합. </li><li> 세척 완충액 50 μL에 재현 탁하고 세포를 1 μL / BrdU의 항체 10 6 세포를 추가한다. 참고 : 다른 특정 세포 내 항원에 직접 결합하는 항체도 추가 할 수 있습니다. 주 :. cdc2에 Ser10 인산화 히스톤 H3에 항체가 G2 및 M에서 세포를 구별하는 데 사용할 수있는, 히스톤 H3 유사 분열 동안 Ser10에 인산화 10 항체는 근래 세포를 검출하는데 사용될 수 Tyr15 인산화전자 유사 분열에 최선을 다하고 있습니다. (11) </li><li> 실온에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 5 분 동안 150 XG에서 1 세척 버퍼의 ml의 원심 분리기 세포를 추가하고 상층 액을 버린다. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> 세포주기 분석을위한 얼룩의 DNA <ol><li> 펠렛을 풀고 7-AAD 용액 (0.25 μg의) 20 μl를 추가합니다. 주 : 7-AAD / 셀의 일정한 양을 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 염색 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법 데이터 5. 컬렉션 참고 : 사용되는 형광 색소의 수와 특성에 따라 달라집니다 필요한 기계. <ol><li> 다음과 같은 파라미터를 수집 FSC-A, SSC-A, FSC-H 선형 스케일 7- AAD 형광 (FSC-W는 FSC-H 대신에 사용될 수있다). 로그 스케일 APC 채널 모아서. 로그 스케일을 사용하여 표면 또는 내부 라벨의 평가를 위해 필요한 추가 채널을 수집합니다. </li><li> COM을 수행시료를 분석하기 전에 다른 형광 색소 사이의 발광 스펙트럼 관찰에 신호를 중첩 보정 :. 참고 : 대부분의 유동 세포 계측기가이 작업을 자동으로 수행합니다. </li><li> 각 샘플에 대해 적어도 10,000 이벤트를 수집합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 데이터의 분석 (6) 주 : 데이터 해석되지만, 다른 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수있다 계측법 FlowJo 흐름이 연구에 사용 하였다. 게이팅 전략은도 1에 도시되어있다. <ol><li> FSC-A와 SSC-매개 변수를 사용하여 실행 가능한 세포 인구를 식별합니다. </li><li> 이 인구 내에서 이중선과 (도 여기에 사용할 수있는 FSC-W) FSC-A 및 FSC-H를 사용하여 집계를 제외합니다. </li><li> 모집단 내의 Y 축의 X 축 및 BrdU의 APC-7-AAD를 사용하여 도트 플롯을 설정한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1 : 게이팅 전략 왼쪽 PA.Nel 보낸 : ungated 세포는 SSC-도트 플롯 대 FCS-에 표시됩니다. 가능한 세포 인구가 도시 게이트로 식별됩니다. 센터 패널 : 왼쪽 패널에서 문이 세포는 FSC-H 도트 플롯 (대신 높이를 사용할 수 있습니다 FSC-W) 대 FSC-에 표시됩니다. 이중선과 집계가 확인하고 그림과 게이트에 의해 제외됩니다. 오른쪽 패널 : 중앙 패널에 이중 배제 날로부터 게이트 세포가 APC-도트 플롯 대 7-AAD에 표시됩니다. BrdU의 항체는 APC는 펄스 라벨 동안 BrdU의를 통합 한 세포의 식별을 가능하게 표시되어 있습니다. 7-AAD는 DNA 콘텐츠에 대한 정보를 제공합니다. 상단 게이트는 BrdU의 펄스, 왼쪽 하단 게이트, 세포 G 0/1 및 G에 그 오른쪽 게이트의 시간에 S 단계에 따라서 BrdU의 양성 세포를 정의 / M 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <ol start="4"><li> 세포주기<html> nalysis <ol><li> 이중 제외 게이트의 셀의 첫 번째 데이터 파일과 문을 엽니 다. </li><li> (FloJo 소프트웨어 플랫폼 아래에있는) 세포주기 분포이 인구를 분석하고 딘 - 제트 - 폭스 모델을 사용합니다. </li><li> G 0/1 및 G 게이트를 작성하여 2 / M 피크의 위치를 가져옵니다. </li><li> BrdU의 양성 세포와 주제에 게이트 같은 세포주기 분석이 인구. </li><li> 만들 게이트에서 같은 게이트를 적용하고 G 0/1 및 G 2 / M 피크의 위치에 대한 (생성 된 게이트를 사용하여) 제약 조건을 설정하여 G 0/1 및 G 2 / M 피크의 위치를 제공합니다. 이는도 2의 제 2 패널에 도시되어있다. 주의 : 다른 소프트웨어는 데이터를 분석하는데 사용될 수 있으며, 설명은 따라서 변할 것이다. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;폭 =&quot;700 &quot;/&gt; 그림 2. 세포주기 진행 첫번째 패널 (모든 셀)을 겹 배제 게이트에 의해 정의 세포군에 게이팅된다. 이 인구는 X 축에 7-AAD와 히스토그램 표시했다. G 0/1 피크의 피크 축 아래 화살표로 표시된다. 도 1에 도시 된 바와 같이 후속하는 패널에서의 BrdU 양성 세포상의 게이팅되었다. 이중선 배제 게이트의 게이팅 때 얻어지는 G 0/1 위치에 대한 값은 FlowJo 세포주기 소프트웨어 내에서의 BrdU 양성 게이팅 셀에인가된다. 도 1과 처음 두 패널에 도시 된 바와 같이 전체 모집단을 분석 할 때 얻어진 값에 기초하여 G 0/1 피크의 위치에서와 같이 이후의 각 패널은 BrdU의 양 인구에 게이팅되었다. 동일한 SAMP에서의 BrdU 양성 세포에 대해 G 0/1 인구의 위치를 식별하는 BrdU의 음 부분을 사용하여제작 샘플의 DNA를 얼룩의 강도에 어떤 약간의 차이를 제어합니다. 각각의 패널 상에 표시된 숫자는 BrdU의 펄스가 종료 된 이후의 시간을 나타낸다. 계산 된 세포주기 단계가 음영 녹색으로 표시되어있다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization.">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세포주기 분석하는 능력은 암 생물학을 이해하고 세포 증식 및 성장에 영향을 미치는 두 약물 및 유전자의 작용 메카니즘에 중요하다. 전하는 세포 증식을 측정하는 검정법 다수 존재하지만, 대부분은 단지 본 셀 번호를 나타내는 측정 값을 제공한다. 이들은 직접 시각화 및 계산, 신진 대사 활동 또는 ATP 농도로 세포 수를 측정 분석을 포함한다. 이러한 방법의 많은의 주요 장점은 조건 또는 화합물의 큰 숫자를 선별하기에 유용하고, 마이크로 포맷과 자동화에 상대적으로 수행하기 쉽고 의무가 있다는 것입니다. 이러한 방법의 많은 단점은 죽음으로 인해 세포의 손실이 잠재적으로 세포 증식의 과소 평가로 이어지는 고려되지 않는 것입니다. 또한 이러한 방법은 대량 인구를 측정 및 단일 세포의 연구 또는 세포의 교통을 통해 허용하지 않습니다세포주기. 아마도 가장 신뢰할 수 있고 정확한 일반적으로 사용되는 확산 분석, 중 DNA 합성을 측정하는 것들이다. 기존의 세포 증식 분석은 몇 시간 밤새 새로 합성 된 DNA에 통합되어 3 H-티미 딘,와. (13)는이 방법으로 명백한 문제가 방사성 물질의 사용이에 대한 세포를 배양,하지만 또 다른 제한은 결과를 측정 평균이 세포의 인구의 확산. 추가 단계가 요구되지만 BrdU의 마찬가지로, 방사 문제없이 사용될 수 있으며,이 전위 BrdU의 돌연변이이다. 그러나, BrdU의 단일 세포의 분석을 허용, 유세포와 호환되는 장점을 갖는다. 단일 세포 수준에서 세포 증식을 평가하기위한 대응 방법 계측법 14 개 흐름 (세포막 또는 세포 단백질 라벨 염료의 증가를 포함 daught 사이에 분할 예 CFSE)ER 세포 DNA의 삽입 성 염료와 항체에 의한 세포주기 특이 항원 검출. 세포 표지 염료의 베스트 셀 분할 걸쳐 세포 분열 추적을 허용한다. 15 세포주기 스테이지 또는 분포에 대한 정보가 얻어지지 않지만 그들이 증식의 직접적인 측정을 제공한다. 예컨대 요오드화 프로피 듐 또는 7- AAD 강력한 세포주기 분포 (16)를 제공하지만, 시간적 아니라 데이터로서 DNA의 삽입 성 염료를 사용하여 DNA 함량의 측정. 심지어 여러 시점의 평가로는 세포주기 또는 특정 세포주기 단계의 길이를 평가하는 것이 불가능 남아있다. 세포주기 특이 항원 비동기 세포 집단에서 세포주기의 위상을 평가하기 위해 사용될 수있다. 일반적으로 사용되는 세포주기 특이 항원 S 중에 표현 기 - (67), (17), G (2) 및 세포주기의 M 상 그러나 포함되지 G 0/1, PCNA (증식 세포 핵 항원) (18), 및 (H)의 인산화 동안istone H3. 이러한 동안 19 부족한 세포주기 역학 관련 좋은 세포주기 단계에 관한 데이터 정보를 제공한다. 세포주기 역학에 취득 된 데이터는 전통적 제제 또는 세포주기 진행을 차단하는 배양 조건을 사용하여 세포를 동기화에 의해 검사되었다. 이것은 일단 세포주기를 통해 함께 진행 셀 파 발생 제거 블록 뒤에 세포의 축적을 야기한다. 1 세포주기의 지속 시간과 다양한 세포주기 단계의 길이를 계산 한 다음이 가능하다. 세포는 혈청 결핍에 의해 G 0 입력 활성 셀 자전거를 종료하도록 유도 할 수있다. 이것은 많은 형질 세포 유형을 포함한 특정 유형의 세포, 기타,위한 신뢰할 수있는 방법이지만 혈청의 재 첨가시 세포는 세포주기를 종료하지. 후속 단계로 함께 20 이동할 수 있고, 자주로 세포 사멸을 겪는다 실제로 결과. (21) 우리의 스투이 발견 다이 것은 급성 림프 백혈병 세포의 상황이 될 수 있습니다. 또한, 세포는 종종 충분히 동기화 방식으로 세포주기를 다시 입력 할 수 없게됩니다. 화학적 방법은 세포주기의 특정 단계에서의 세포주기 정지를 유도하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 제제는 DNA 합성 (예 과량 티미 딘)을 방지 그 또는 각각 (예 nocodazole) S 및 M 단계에서 정지 세포를 유사 분열 스핀들을 형성을 방지하지만 독성과의 상당한 부분에 사망 성장 장애 및 초래할 수 세포. 모든 셀에서 22이 방법은 많은 시간을 죽이지 않고 세포의 대부분을 체포하는 데 실패했습니다. 목표는 세포주기 파라미터의 전위 항 백혈병 약제의 효과를 평가하는 것을 고려하면, 동기화로 인한 세포 사멸이 용납이었다. 방법 중 다수의 셀을 설명 동기화에도 불구하고, 모든 단점을 가지고있다. 주요 문제는 다음과 같습니다 부족세포주기의 원하는 부분에서 세포 농축, 관찰, 과량 독성 같은 정상 세포주기의 생리학에 교란. 여기에 기재된 방법은 세포가 S 단계에서 세포를 식별 BrdU의 짧은 기간 동안 인큐베이션 한 사용될 펄스 시스템의 단순한 확장이다. 우리는 우리의 시스템에서 최적이지만 충분한 라벨링 얻어지면 짧은 시간주기가 사용될 수있다 것으로 45 분 펄스 알았다. BrdU의 제거 후의 배양 세포에 계속하여 그 다음으로 세포주기 S 상, G 2, 유사 분열, G (1) 및 엔트리의 나머지 부분을 통해 자신의 진행을 추적 할 수있다. 이는 상기 세포를 수행하는 것이 가능할 수있다. 이 시스템의 장점은이 실험의 시간 프레임 내에서 세포 독성의 증거가없고, 미디어 변화 단 몇가 필요로 세포의 성장에 미치는 영향을 최소화가 있다는 것이다. 세포는 그렇지 콘티 유지된다nuous 문화. 상기 방법의 기초 자연 유동 세포 계측법은 추가적인 표면 또는 세포 내 염색 세포 개체군의 식별과 조합 될 수 있다는 것을 의미한다. 우리는 APC 공액 BrdU의 항체를 사용하지만, 다른 패널 항체 접합체의 개발을 용이하게 치환 될 수있다. 7-AAD는 여러 가지 빛깔의 염색에 대한 옵션을 극대화 단일 채널에서 형광 때문에 우리는 요오드화 프로피 듐보다는 7-AAD를 사용했다. 마찬가지로 DAPI 또는 훽스트는 DNA 얼룩으로서 사용하지만 UV 레이저를 필요로 할 수있다. DNA 염색에 대한 엄격한 CVS는 에탄올 고정을 사용하여 얻을 수 있지만이 자주 추가 표면 또는 세포질 얼룩에 대한 옵션을 제한, 항체 염색을 타협. 가장 큰 단점은 그 위상이 약 8 시간, 그래서 표지 세포가 방금 입력 또는 펄스 기간 동안 S 단계를 종료하려고했을 수 있습니다 지속 s입니다. 그 결과, 동기화는 다른 시스템과 같이 꽉 아니다. 그러나, DNA를 나타내는 염료로 BrdU의 라벨을 결합하여특정한 세포주기에 따라 단백질 함량 및 항체는 강한 데이터를 얻을 수있다. 일관성있는 데이터를 획득하기 위해 그 셀들이 정확한 농도에서 모든 조건이 비교되는 셀에 걸쳐 농도가 일관성이 있음을 보장하는 것이 중요하다. 비판적 7-AAD 염색의 밝기는 세포 농도에 매우 민감하다. 자동 셀 카운팅 시스템을 사용하는 것은 그 세포 농도가 프로세스의 각 단계에서의 모든 샘플에서 일관되도록 도울 수있다. 또 다른 중요한 점은 세포가 BrdU에 노출되는 시간의 길이이다. 작은 변화는 상당한 차이로 번역 할 수 있으므로, 모든 샘플들이 정확하게 동일한 시간 BrdU를 배양하는 것이 중요하다. 마지막으로, 최적의 착색을 얻기 위해 항체를 적정하는 것이 중요하고 배치가 변경 될 때마다 반복한다. 모든 단계는 지속적 따른다 세포 농도는 운전 방식이 다음 일정하게 유지하면D 확실 동기화 필요없이 세포주기를 통한 세포의 추적을 가능하게 할 것이다. 특정 세포 유형에 맞게 특정 문제를 해결하기 위해이 방법을 수정할 상당한 범위도 있습니다.

세포주기 진행 동안에 세포주기 및 세포 기능에서 발생하는 변화의 평가는 생물, 특히 암 생물학의 여러 측면의 이해에 기초한다. 악성 종양의 치료를 위해 개발에 많은 제제는 세포주기 진행에 지대한 영향을 미칠 또는 세포주기 - 종속 메카니즘을 통해 세포 사멸을 유도한다. 세포주기의 특정 단계에서 세포주기 역학 또는 세포를 연구하기 위해, 세포를 동기화하는 것이 일반적이다. 그러나 동기화 방법은 잠재적 결과 얻어진 교란, 검토되고 세포에 해로운 영향을 가질 수있다. 1 시간에 걸쳐 하나의 세포에서 세포주기 진행의 최근 세포주기의 특정 단계에서만 존재하는 형광 태그 된 단백질의 사용이 허용 된 분석 (2) 그러나,이 세포는 유전자가 읽을 수있는 시스템의 사용을 제한하는, 이들 태그가 단백질을 발현하도록 조작 할 필요가 공부 될ILY 달성했다. 합성 (S) 상, DNA 복제와 유사 분열 (M) 여기서 세포 분열이 발생되어 세포주기는 두 개의 활성 단계로 구성됩니다. 이 단계는 세 갭 단계, G 0, G 1 및 G 2로 구분됩니다. 셀의 크기가 종래 세포 성장은 DNA 복제의 완료 사이하지만 세포 분열 전에 계속 DNA 복제와 G이 증가 여기서 G는 0 또는 정지, 세포주기를 떠난 쉬고 위상이고, G 1이다. 세포주기를 통해 진행이 체크 포인트의 수에 의해 제어된다. 환경 조건이 DNA 합성을지지하지 않으며 S 단계 진입을 방지 할 때 G 1 체크 포인트가 활성화됩니다. 인트라 S 상 검문소 또는 지연 실속 복제 포크 초래할 수 DN​​A 손상에 의해 유발 될 수있다. 손상 후 G 2 검출되면 G 2 중 DNA의 복제 충실도를 확인되고 </서브&gt; 체크 포인트는 분열을 셀에 DNA 복구 전에 허용 활성화됩니다. 유사 분열 동안 최종 체크 포인트는 세포 분열이 성공적으로 완료 될 수 있도록 염색 분체가 제대로 유사 분열 판에 정렬되어 있는지 확인합니다.이 체크 포인트 3 활성화는 일반적으로 세포 인구를 동기화하는 데 사용됩니다. 세포주기 체크 포인트는 다수의 인자에 의해되지만 가​​장 일반적인 DNA 손상의 검출의 암 생물학에서 활성화 될 수있다. DNA 손상 응답 (ATR) 관련 PI3 키나아제 형 키나제의 실조증 모세 혈관과 Rad3 의해 개시 및 운동 실조의 모세 혈관이 (ATM) 각각 하류 효과기 키나아제 CHK1 및 Chk2를 활성화하는 돌연변이. 3 이벤트 범위가 정지 포함 CHK1를 기동 복제 포크 DNA 가교 결합 및 자외선 손상 Chk2는 주로 이중 가닥 바꿈에 의해 활성화된다. 세포주기의 전 길이에 변경된 조건의 효과를 연구하기위한 통상의 방법S는 세포주기의 특정 단계에서 세포를 동기화한다. 한 이것은 여러 가지 방법을 통해 달성 될 수있다. 세포를 물리적 크기, 밀도, 측면 스 캐터 (입상), 및 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 분리 될 수있다. 더 실제적으로, 세포는 화학적 수단에 의해 동기화 될 수있다. 예컨대 티미 딘, 히드 록시 우레아 및 시토신 아라 비노 여러 에이전트는 에이전트가 제거 된 후 순환을 계속 S 단계에서 세포의 축적으로 인한 세포주기의 S 단계에서 DNA 합성을 억제하는데 사용될 수있다. 또는 M 상 DNA 함량 - 세포는 G 2 방추사 형성 체포 방지 nocodazole으로 처리. G 0 단계에서 세포의 축적 배지 결과에서 혈청의 제거. 배양 혈청 내의 영양소의 재 첨가 세포의 정상적인 순환을 재 - 시작한다. 그러나 이러한 동기화 방법은 모든 세포의 정상적인 순환과 성장을 방해 할 수 resul중요한 세포 사멸에 T. 급성 림프 구성 백혈병 세포의 동기화는 특히 도전이며,이 세포는 유전자 조작 의무가 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 세포주기 역학 평가 전통적인 동기화 또는 유전자 조작없이 세포주기의 특정 단계에서 세포의 연구를 허용한다. 이 방법은 유전자 변형 전통적인 동기화 과정이 용이하게 달성되지 않은 다른 세포 유형에 유용 할 수있다. 방법은 세포의 단기 성장과 증식에 거의 영향을 미치지 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 혼입의 노포 사용에 기초한다. 4 설립 BrdU의 프로토콜은 S 단계에서 새로 합성 된 DNA 내로 BrdU의 혼입을 활용 . 이것은 영구적 BrdU의 노광 중에 S 단계에서 된 것으로 세포를 표시한다. 이는 인구의 BrdU의 incorpor위한 염색하여 나중 시점에서 식별 될 수있다ATION 이에 따라야하고 세포주기 교통 약물 효과의 연구를 허용하는 시간에 걸쳐 평가 될 수 동기 인구로서 작용한다. BrdU의 보통의 DNase 또는 산 처리 다음 달성 전에 항체 염색에 노출 될 필요가있다. -6,7- BrdU의 도입은 부가적인 마커의 포함을 가능하게 검출하기 위해 유세포 사용. 가장 중요한 연구의 개시시에 S 상에 있던 세포의 세포주기 위상 분포의 평가를 가능하게 DNA 함량을 측정하기 위해 염료를 사용하는 것이다. (8) 또한 추가적인 표면 또는 세포 항원은 또한 조사 할 수있다. (9) 이러한 이러한 사료된다 등의 세포주기 이벤트 관련 또는 절단 카스파 제 -3와 같은 세포 사멸 마커 등으로 관련이 없어 보이는 세포의 기능을 할 수 있습니다. 잠재적 인 응용 프로그램은 연구자의 상상력에 의해 제한됩니다.

<table><tbody><tr><td>APC BrdU Flow Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm&lt;br/&gt; Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td></tr><tr><td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>Referred to as Permeabilization buffer</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Referred to as Wash buffer</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&amp;nbsp;mm FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; vented Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 25&amp;nbsp;ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 1&amp;nbsp;ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

이 방법은 다양한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. 일부 응용 프로그램은 여기에 설명되어 있습니다. 세포주기의 지속 기간의 평가 세포주기를 통해 세포로 운송하는데 필요한 시간을 결정하기 위해, 세포를 BrdU의 펄스 아래의 다양한 시점에서 수확한다. 평가의 간격은 분석되는 특정 셀에 적용될 수있다. 조혈 세포주는 표준 배양 조건에서 세포주기 단계의 길이를 결정하는 임의의 약물 치료의 부재하에 24 시간 동안 매 시간마다 측정 하였다. (2)가 24 시간에 걸쳐 NALM6 셀 스냅 분석의 선택을 보여준다. BrdU의 피 후 10 시간을 검출 (즉,도 1에서의 BrdU의 양 게이트 이내) BrdU의 펄스시의 S 단계에서 세포 인 세포주기의 단계에있는 세포의 피크, G (2) / M으로 진행ulse. S 단계에서의 BrdU 표지 된 세포의 비율은 펄스 후에 그 최하점 14 시간에 도달하고 거의 모든 세포는 17 시간 후에 G (1)에 돌아왔다. 24 시간까지의 BrdU 표지 된 세포의 비율은 그러나 대부분 아직 36 공지 부합 복제의 두 번째 라운드를 입력하지 않은 세포는 24 시간 이내에 세포주기를 완료 할 수 있음을 나타내는 그들의 다음 세포주기의 일부로서 S 상을 재 입력했다 이들 세포에 대한 시간을 두배 HR. 세포주기 분포는 추가의 마커를 포함시킴으로써 정제 할 수있다. 예를 들어, Ser10 인산화 히스톤 H3 (분열 세포의 마커)에 대한 항체의 첨가가 G (2)에서와 유사 분열에서 세포의 차별을 허용한다 (도 3의 좌측 패널). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig3highres.jpg" width="700" /> 그림 3 : 확인세포주기 스테이지의 추가의 마커를 사용한다.도 1에 도시 된 바와 같이, 상부 패널 BrdU의 양 게이트로부터 세포의 세포주기 분석을 보여준다. 세포가 BrdU의 펄스 이후에 18 시간 동안 3 나노 빈 크리스틴의 존재 또는 부재하에 인큐베이션했다 . 그림 2에 기술 된 바와 같이 세포주기 분석을 실시 하였다. 하부 패널은 Ser10 도트 플롯에 인산화 히스톤 H3 대 7-AAD에서 동일한 세포를 보여준다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52840/52840fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 세포주기에 약물 효과의 평가 세포 독성 제는 세포주기 진행에 지대한 영향을 미칠 수 있으며, 세포 사멸을 유도 할 수있다. 세포주기 진행에 대한 약물의 효과는 BrdU의 펄스 아래의 관심의 약물을 추가하여 평가 될 수있다. 두 가지 예는 표시됩니다. 첫 번째 상황은 어디 유도 OF 세포 사멸은 세포주기 데이터의 분석 (도 3의 오른쪽 패널) 혼동. NALM6 세포는 BrdU의 펄스 이후에 18 시간 동안 3 나노 빈 크리스틴에 노출되었다. 세포는 빈 크리스틴 대상으로 미세 소관으로 유사 분열에 체포 것으로 예상했다. 그러나 세포주기 분석은 세포가 G 구속하지만 0/1 (도 3 우측 상단 패널)까지 천이 않았다고 제안했다. Ser10 인산화 히스톤 H3에 대한 항체의 첨가는 세포가 감소 된 DNA 함량에도 불구하고, 유사 분열 (도 3 하단 우측 패널)를 종료하지 않은 것으로 나타났다. 이는 DNA 함량이 세포 사멸을 겪는하고 그들의 DNA를 분해하기 시작했기 때문에 감소 된 것으로 보인다. 유사 분열 (4N 즉 DNA)와, 그들은 S 상 또는 대신 전형적인 세포 사멸 서브 G 1 피크의 G 셀 0/1로 나타날 때 세포 사멸을 개시하기 때문이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig4highres.jpg" width="700" /> 그림 4 :. 세포주기 단계 특정 살인의 검출은 도트 플롯은 BrdU의 펄스 후 배양 24 시간에 남아있는 BrdU의 양성 세포의 비율을 보여줍니다. 세포를 1.5 또는 16 μM RAD001 BrdU의 펄스의 끝부터 존재 또는 단독으로 자동차의 부재 (대조군)에서 배양되었다. 하단 패널은 24 시간 배양을 통해 BrdU의 양성했다 세포의 비율을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52840/52840fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 다른 예에서,도 4는 RAD001 (진행성는 mTOR 억제제) 세포의 낮은 농도의 존재 하에서 세포주기를 완료 할 수 있었다 그런데 G 0/1의 지연이나 구속을 시행하는 방법을 보여준다. RAD001의 높은 농도는 크게 TRA로부터 세포 막을G 0/1까지 nsiting. S 단계에서 중요한 세포 (즉, BrdU의 양) RAD001의 추가시 우선적으로 문화에서 사라질 것으로 나타났다. 이 G 2 / M을 통과하는 세포가이 에이전트에 의해 죽음을 셀에 더 취약했다 제안합니다. (12) 이는 특정 항원에 대한 항체를 이용하여 세포주기의 특정 단계에서 세포의 반응을 조사하는 것도 가능하다. 도 5 크리스틴 치료에 반응하는 단백질 및 CHK1를 제어 Chk2 세포주기 체크 포인트의 활성화에 나타낸다. CHK1과 Chk2은 각각 Ser345 및 Thr68 인산화에 의해 활성화된다. CHK1 및 Chk2의 활성화는 2N의 DNA 함량을 갖도록 나타나는 세포에서 볼 수 있지만,도 5에 도시 한 바와 같이 세포 사멸로 인해 DNA 분해 개통 유사 분열 세포 일 가능성이 높다. 이 후 다양한 시점에서 약물을 추가 할 수있다BrdU의 펄스는 세포주기의 여러 단계에서의 세포에 대한 제제의 효과를 조사한다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig5highres.jpg" width="700" /> 그림 5 :. 특정 세포주기 단계에서 세포의 변경의 탐지 상단 패널은 대 인산화 CHK1 (왼쪽) 또는 Chk2 (오른쪽) 도트 플롯 7-AAD 그림 1과 BrdU의 양성 세포에 문 세포를 보여줍니다. 셀이도 3에 관해서는 3 나노 빈 크리스틴의 존재 또는 부재 BrdU의 펄스 다음 18 시간 동안 배양 있었다. 하부 패널은 나타낸 바와 같이 2N 또는 4N 분획 하나에 게이트 된 동일한 세포의 오버레이 히스토그램을 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52840/52840fig5highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a>

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Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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19.1K 조회수.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다. 

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Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

연구

유전학

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

암 연구학

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

생물학

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

면역학 및 감염병학

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
The cell cycle is a universal process of life. During the cell cycle, a cell undergoes several modifications to divide into two daughter cells. This mechanism occurs throughout an organism&#39;s life in response to its needs. Cell divisions and embryonic development produce a full organism from a single-celled zygote. During adulthood, the cell cycle is central to many critical biological processes, such as tissue repairs.
Mechanisms of cell division are tightly controlled events where the cell undergoes stepwise modifications before final division. Cells that are not yet in the cycle are described as being in the Gap 0 (G0) phase. During this stage the cell is considered quiescent. When the cell starts to cycle, four distinct phases are recognized: Gap 1 (G1), Synthesis (S), Gap 2 (G2) and Mitosis (M). G1 phase is a checkpoint for resources needed by the cell for DNA synthesis. Then, S phase occurs, and DNA replication starts, followed by the G2 interphase, another checkpoint that controls all elements necessary to for the cell to divide. Finally, the cell enters mitosis and divides into two daughter cells.
Cell division is a highly informative parameter in many different biological systems. In the field of immunology, analysis of leukocyte proliferation can indicate the mechanism of the immune response. Other domains of investigation also rely on cell cycle analysis. For instance, analysis of the cell cycle during tumor development has improved our understanding of cancer.
Many fluorescent dyes are now available for tracking cell proliferation. These dyes differ in their chemical and spectral properties. Two different classes of dyes exist: protein dyes permanently combine with protein by forming a covalent bond, and membrane dyes stably intercalate within cell membranes via strong hydrophobic associations. In vitro and in vivo studies of immune cell proliferation by flow cytometry are among the most common applications of both classes of cell tracking dyes (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) is a fluorescent dye that marks dividing cells. Initially, all the cells receive the same amount of dye; dividing cells evenly split the dye they received between their two daughter cells. Consequently, the cell cycle can be followed by the progressive decrease of dye intensity in the cells. CFSE staining is followed by conventional multi-parametric flow cytometry, a high-throughput, fluorescence-based technology that allows phenotypic and functional characterization of cells based on their degree of CFSE staining (3).
In the following experiment, we assess the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells in-vitro, following CD3 stimulation, using CFSE staining and flow cytometry.

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

세포주기 분석: 세포주기 CFSE 염색 및 유세포 분석을 사용한 자극 후 CD4 및 CD8 T 세포 증식 평가

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

면역학

Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation

Source: Welschinger R. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/t/52840">Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video describes the stepwise pulse labeling assay of mammalian cells with bromodeoxyuridine (BrdU) for measuring cell proliferation. The BrdU uptake permits the temporal tracking of cells that were in the synthesis phase at a specific point in time, without requiring the cells to be synchronized.

Bromodeoxyuridine 펄스 라벨링 분석: 세포 증식을 측정하는 기법

Source: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)
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