Name: development of a quantitative recombinase polymerase amplification assay with an internal positive control
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
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이 연구는 세계 보건 이니셔티브에있는 그랜드 도전을 통해 빌 &amp; 멜린다 게이츠 재단의 연구비 지원을 받았다.

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The authors declare they have no competing financial interests.

프롬프트되면 MATLAB 알고리즘을 사용하여 의미있는 정량화 된 데이터를 획득하기 위해, 사용자는 해당 입력 값을 선택한다. 제 5,6의 각 스크립트를 개시 한 후, 모든 입력 변수는 자동 명령 창에서 요청 된 것으로 출력이 자동으로 생성된다. 5.7 절에서는 사용자가 기울기 임계 값을 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 경사의 문턱 값은 착용감 상관 계수 (R 2)의 제곱에 영향을 미친다. 열 사이 클러에서 반출 형광 원시 데이터를 사용하는 경우, 2.0와 5.0 사이의 값은 높은 계수 R 2를 수득하는 경향이있다. 5.8 절에 사용자가 긍정적 인 임계 값을 설정하는 배경 위로 표준 편차의 수를 지정해야한다. 양 또는 음으로 샘플을 점수로 스크립트가 자동으로 화력에서 내 보낸 원시 형광 데이터를 사용하여 각 샘플에 대한 최대 및 최소 형광 사이의 차이 Δ 샘플을 결정한다L 자전거 타는 사람. 그것은 모든없는 목표 제어 샘플의 평균 차이 Δ 배경 및 표준 편차 σ 배경을 계산합니다. Δ 샘플 Δ 배경 위에 σ 배경 × Z보다 더 많은 경우 샘플은 긍정적 인 것으로 간주됩니다. 5.10 절에서 사용자는 디폴트 임계 값을 사용하거나 새로운 임계 값을 설정할지 여부를 결정한다. 사용자가 새로운 임계 값을 설정하기를 원하는 경우, 어떤 실험 HIV-1 DNA를 본 실험없이 3 각 함유 12 RPA 반응을 수행하여 새로운 임계 값을 결정한다. 이 실험 플러스 3 표준 편차에서 형광 강도의 평균 증가 임계 값을 설정합니다. 6 절을 완료 한 후, 스크립트 JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m 자동 (LOG10 사본에) 각 qRPA 반응에 대한 예상 DNA 농도를 반환합니다. 스크립트가 더 HIV-1 DNA 샘플에 존재하지 않는 것으로 판정 한 경우, 상기 추정 된 농도 중 &quot;네으로 나열내부 양성 대조군의 형광 신호 여부에 따라 잘못된 HIV에 대한 gative &quot;또는&quot;, &quot;(σ 배경 + Δ 배경 × Z) 임계 값을 초과했습니다. 사용자는 공지 된 샘플 농도는 표준 곡선을 검증하는 경우, 스크립트는 또한 표 1과 유사한 표를 추가로 리턴한다. 정확한 정량을 제공 실시간 RPA 분석을 개발하기 위해, 실험적인 일관성은 중요하다. 예를 들어, 표준 곡선 및 검증 실험 모두에 대해 동일한 프라이머 및 프로브를 사용하여 분취 액. 또한 실험 사이에 4 ° C에서 프라이머 및 프로브 분량을 저장하는 것이 아니라 -20 ° C에 의해 동결 해동 사이클을 피하십시오. 표준 곡선 및 검증 실험에 사용 템플릿 분액 동일한 방식으로 저장된다. 동일 로트 RPA 효소 펠릿 및 시약은 제조 업체의 권장 사항에 따라 사용됩니다. 마지막으로, 베카RPA 정확하게 증폭 율을 제어하는​​ 진정한 &#39;주기&#39;를 사용 부족, 사용자의 표준화 단계는 절대적으로 필수적이다. 반응을 조립할 때, 사용자는 항상 각 단계에 대략 동일한 양의 시간을 보내고, 같은 순서로 같은 단계를 수행한다. 반응은 항상 새로운 피펫 팁으로 부드럽게 혼합되어야하며, 거품은 항상 제거해야합니다. 증폭 전에 반응은 일관된 온도를 유지해야하며, 서열 증폭기 또는 현미경 소프트웨어는 항상 정량에 영향을 줄 수있는 준 최적 온도에서 임의의 증폭을 방지하기 위해 반응을 넣기 전에 준비되어야한다. 초기 반응 조건의 모든 변화는 실험 결과의 불일치가 발생할 수 있습니다. 데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 추가 변수는 형광 강도의 변화를 최소화하도록 제어되어야한다. 모든 반응은 스테이지에 따뜻한 같은 영역에 배치하고, microsco해야체육은 모든 샘플에 대해 잘 같은 지역에 집중해야합니다. 이러한 방법을 따르는 경우에도 현미경 상에 수집 형광 데이터 인해 자연스럽게 여기 광에 반복 노출에 기인 RPA 반응, 반응 챔버 내의 기포 형성 또는 광표백 중에 형성 로컬 휘점에 가변성을 나타낼 수있다. 이러한 변수들의 영향은 기저선 변동, 최고점과 최저점을 보여 현미경 (도 4a 및도 4b)에 수집 된 형광 데이터에서 분명하다. 이러한 기능은 서멀 사이 클러 (도 3a 및 3b) 상에 수집 된 데이터로부터 형광 존재하지 않는다. 궁극적으로, 현미경에 데이터 수집은 원칙의 증명 목적되고 최종 분석은보다 정확한 형상과 이들 변수를 최소화 소프트웨어 제어와 계자 동작 가능한 형광 판독기상에서 구현 될 것이다. 또 다른 중요한qRPA 분석법 개발 프로세스의 측면은 데이터 처리의 일관성이다. 방법 절에 설명 된 프로토콜은 서열 증폭기 또는 현미경에서 수집 (스프레드 시트 파일에 저장된) 형광 원시 데이터를 처리하는 스크립트를 사용한다. 표준 곡선을 작성하는 데 사용되는 모든 실험은 동일 포맷해야합니다. 데이터를 수집하기 위해 써멀 사이 클러를 사용하는 경우, 동일한 플레이트 레이아웃이 사용되어야하며, RPA 반응에 포함되지 않은 웰로부터의 데이터를 내보낼 수 안된다. 데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 데이터의 형태를 자동 유전자 증폭기에서 반출 된 데이터의 포맷과 일치한다. D61, E2 : 세포에서 D2 있어야 주형의 농도를 증가 C61, 데이터 예를 들어, 노 타겟 제어 데이터는 셀 C2에 있어야 실험의 각 농도의 다중 복제물이 있으면 E61 등 2 차 복제 희석 시리즈는 높은 농도에 어떤 목표 제어 (NTC) 왼쪽에서 오른쪽으로 주문해야하고1 일의 바로 오른쪽에있는 컬럼에 저장 희석 시리즈를 복제합니다. 예를 들어, 2와 1.2 절에 사용되는 판 레이아웃에 희석 시리즈의 각 샘플의 첫 번째 복제에 대 한 형광 데이터 셀 (C2)에 저장해야합니다, 각 샘플에 대해 복제 : H61 및 형광 데이터를 각 샘플의 2 차 복제에 대한 희석 시리즈는 세포 I2에 저장해야합니다 : N61. 1.2 절에 사용되는 플레이트 레이아웃의 경우,이 스프레드 시트에 열 자전거 타는 소프트웨어에서 데이터를 내보낼 때 기본 서식입니다. HIV-1 qRPA 실험으로부터 제공 RPA는 대표 데이터가 미지 시료의 핵산 농도의 정량 분석​​을 위해 사용될 수있다 개념 증명 지원을 보여준다. 임상 적으로 유용한 HIV-1 바이러스 부하 테스트는 크기의 최소 4 주문의 임상 범위, 0.5 LOG10 사본의 정밀도, 적어도 200 사본 (19, 20)의 한계-의 검출이있다. 기재된 HIV-1 DNA 분석이 CR을 충족iteria 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 저농도 가장 정확하게된다. 따라서, 역전사 단계의 포함으로, 이러한 결과는 HIV-1 RT-RPA 분석은에서 HIV-1 바이러스 양을 측정 할 수있는 잠재력을 가질 수 있음을 시사 임상 샘플. 알고리즘 파라미터를 조정 qRPA 분석법을 개발하는 경우 조정 임상 필요에 따라 감도 및 선형 동적 범위를 할 수있다. (6) (양의 샘플에 대한 임계 값을 결정하는 파라미터) (Z)를 조정하는 하위 및 상위의 감도 및 정확도에 영향을 미칠 수 있음을 보여주고 목표 농도. 또한, 이에 의해 증폭 율을 감소, 낮은 온도에서 반응을 배양 이하 아세트산 마그네슘을 사용하여 정량의 해상도와 정확도를 증가시킬 수있다. qRPA 개념 분석이 증명은 HIV-1 DNA를 함유하는 샘플의 농도를 정량화하는데 사용될 수있다. 이 MA에서 설명 qRPA 분석법nuscript는 실시간 RPA 반응 조립 개발 IPC 화면 및 미지 시료를 정량화하는데 사용될 수있는 표준 곡선을 구축 형광 원시 데이터를 처리하는 방법에 대한 자세한 설명을 포함한다. 자세한 설명을 포함하여,이 프로토콜은 샘플의 다양한 DNA 농도를 정량화하는 데에 적합 할 수있다.

정량적 핵산 증폭 환경, 인성 및 인성 병원균의 검출뿐만 아니라, 임상 적 진단을위한 중요한 기술이다. 실시간 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)는 HIV-1 바이러스 성 부하 테스트 세균성 병원체의 검출 및 다른 많은 생물 한 스크리닝 예를 들면 핵산의 민감하고 특이 및 정량적 검출 금 표준 방법 - 3. 실시간 qPCR의 동안 프라이머 사이클 병원체 DNA를 증폭 및 형광 신호는 각주기에서 증폭 된 DNA 시료의 양에 비례한다고 생성된다. 병원체 DNA의 미지 농도를 함유하는 샘플은 표준 시료의 초기 DNA 농도와 형광 신호가 특정 임계 값에 도달하는 시간 (즉, 사이클 임계치 또는 C의 T)에 관한 표준 곡선을 사용하여 정량화 될 수있다. 4, 개발되어왔다. 이러한 플랫폼은 일반적으로 더 빠른 결과를 제공하고 덜 비싼, 간단한 장치로 달성 될 수있는 저급 단일 온도에서 핵산을 증폭. , 현장 진료 응용 프로그램에 특히 매력적인 분 안에 DNA를 증폭 RPA는 낮은 증폭 온도 (37 ° C)를 필요로하고, 불순물 5,6의 존재에 활성 상태로 유지됩니다. 12 - RPA 분석법은 biothreat 제 7의 식품 분석, 병원균 검출, 항암제 스크리닝 및 검출을 포함한 다양한 애플리케이션을 위해 개발되었다. 그러나, 핵산의 정량 RPA를 사용 13,14 한정되었다. 이전의 연구에서는 웃음이었다WN 그 실시간 정량적 RPA (qRPA)는 15 가능하다. 여기서, 상세한 프로토콜은 표준 곡선을 사용하여 정량화 qPCR에 유사 방법을 사용하여 미지 시료를 정량화 실시간 정량적 RPA를 사용하기 위해 제공된다. 이 프로토콜은 제대로 작동하는 시스템을 보장하기 위해 내부 양성 대조군 (IPC)를 개발하는 방법뿐만 아니라, 개념 증명으로 HIV-1 DNA를 검출하기 위해 열 자전거 타는 사람에 RPA 반응을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 트레이닝 데이터를 이용하여 표준 곡선을 구성하기위한 서열 증폭기 또는 현미경과 데이터 분석에 의한 데이터 수집은 또한 상술된다. 마지막으로, 커스텀 스크립트 표준 곡선을 사용하여 미지 시료 정량법이 설명된다. 이 qRPA 기술은 미지 농도와 시료의 정량 분석​​을 가능하게하고 기존의 실시간 qPCR에 비해 많은 장점이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 probe</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IPC probe</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR flat cap tube strips</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Micro-seal adhesive</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFP&amp;Delta;Env&amp;Delta;Vif&amp;Delta;Vpr)</td><td></td><td></td><td>custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. &amp;amp; Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118&amp;ndash;129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>Human male genomic DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 well cold-block</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Development</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC template</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR long forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR long reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5&amp;rsquo;- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X buffer</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Stage heater</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-Channel Precision High Stability Temperature Controller</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP filter cube</td><td>Zeiss</td><td>filter set 38 (000000-1031-346)</td><td>excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX filter cube</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Laser cutter</td><td>Engraver&#039;s Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8&quot; black acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm clear acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Office Depot</td><td>Duro super glue&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR grade mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_qRPA_standard_curve.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: &quot;JoVE_real_time_intensity_to_excel.m&amp;rdquo;</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Included in SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a quantitative recombinase polymerase amplification assay with an internal positive control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

목표 qRPA 실험에서 IPC 역할을하는 시퀀스를 선택하기 전에 (HIV-1) DNA, 내부 양성 대조군 (IPC) 후보가 생성되어 HIV-1 DNA가없는 상태 qRPA 반응으로 증폭 할 수있는 능력에 대한 검사. IPC 후보 타겟 (HIV-1)의 아웃 - 경쟁 HIV-1 앰플 리콘 형성에서 IPC 형성되지 않도록 DNA보다 길다. 도 2a, C.의 두 세대에 도시 된 바와 같이 IPC 포자충 후보들 겔 전기 영동을 사용하여 415 및 435 bp의 밴드의 존재에 의해 확인되었다. 104 및 105 복제본의 합계 (도 2C) 존재시 이상 후보 증폭 동안 지속적 qRPA 반응에서, IPC 짧은 후보 작은 증폭 (도 2B)를 나타냈다. 따라서, 더 이상 후보는 HIV-1 qRPA 실험에 대한 IPC로 선정되었다. 실시간 qRPA 단독 관심 타겟을 사용하거나 사용하여 수행 될 수있다타겟 모두와 IPC.도 3은 HIV-1 DNA와 C. 모두 사용하여 열 사이 클러에 실험을 도시 포자충 IPC. 이 실험에서, IPC DNA의 2.6 × 104 카피 HIV-1 표적 DNA의 검출 한계에 영향을 피하기 위하여, 각각의 반응, 검출 IPC 한계에 가까운 농도로 첨가 하였다. 실시간 HIV-1 DNA 생성에 대응 HEX 형광 데이터를 표시하는도 3a에서 알 수 있듯이, 검출 가능한 증폭이 시작되는 시간은 최초 목표 농도에 반비례한다. 따라서, 증폭은 HIV-1 DNA의 낮은 농도에 대해 이전에 HIV-1 DNA의 높은 농도에 대한 이상 알 수있다. 출발 IPC 농도는 모든 샘플에서 동일하므로 t 동안 IPC DNA 생성에 대응 FAM 형광 데이터를 표시하는도 3b에 나타낸 바와 같이 반대로, IPC DNA의 검출 가능한 증폭은, 거의 동시에 시작같은 실험을 그가. IPC에서 형광 생성 속도 인해 증폭 동안 경쟁 HIV-1 DNA의 농도에 반비례한다. qRPA 반응 용 전계 동작 가능한 형광 판독기의 개발을 목적으로, qRPA 실험은 스테이지 히터 1 채널 정밀 높은 안정성 온도 컨트롤러와 직립 형광 현미경상에서 수행 될 수있다.도 4a 및도 4b에 표시 HEX 및 FAM 형광 데이터를 수집 현미경에. 레이저 컷 칩을 사용하여 현미경에 수집 된 데이터는베이스 라인 형광 photobleaching에 때문일 수 있습니다 볏과 최저점에 약간의 변화를 보여줍니다. 그러나, 스크립트는 초기 증폭이 발생한 후에 기준선 형광 혹은 형광 변동에 의해 영향을받지 않는 초기 증폭 기간 동안 형광의 변화율을 이용하여주기 임계 값을 결정한다. 인터넷에서 보듯gure 4C,이 실험에서 내장 된 표준 곡선은 0.990의 R 2 계수를 가지고있다. 특히, IPC는 HIV-1 DNA 저농도 위해 증폭된다. 이 동작은 열 자전거 타는 사람에 대한 실험을 수행 다르지만, 모든 샘플은 여전히​​이 방법을 사용하여 유효로 분류됩니다. 공지 목표 농도를 사용하여 여러 실험으로부터의 데이터는 분석 성능을 평가하거나 미지 농도의 시료를 정량화하는데 사용될 수있는 표준 곡선을 구성하기 위해 컴파일 될 수있다. (5)는 스크립트를 사용하여 생성 된 다섯 실험 지수 표준 곡선으로부터 데이터를 보여준다 감지 증폭이 시작되는 시간에 초기 HIV-1 목표 농도를 관련 &quot;JoVE_qRPA_standard_curve.m&quot;. 그림 5는 표준 곡선을 구축 5 별도 실험, 각 템플릿 농도에서 각각 함유하는 2 qRPA 반응을 사용했다. 지수합니다착용감은 0.959의 높은 R 2 계수를 가지고있다. 표준 곡선은 스크립트 &quot;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&quot;스크립트. 표 1은도 5에 표준 곡선을 사용하여 5 추가 실험 정량 결과를 도시하여 분석 유효성 알려진 농도의 추가 샘플의 농도를 예측하는 데 사용 하였다. 또, 알고리즘이 제대로 부정적인없는 대상 제어 샘플의 10 명 중 긍정적 9 HIV-1 DNA를 포함하는 모든 샘플을 분류. 또한, 예측 된 평균 농도는 정확한 크기 및 농도의 예측 된 농도의 표준 편차의 1 자리수 0.5 미만 LOG10 (반응 당 부) 하였다 이내였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. 양적 RPA의 DNA 대상의 블록 다이어그램 QRP분석은 ( &quot;RPA 앞으로&quot;및 &quot;RPA는 역&quot;) 바인드를 프라이머와 동일한 순서에 의해 측면에 두 개의 DNA 염기 서열을 증폭한다. 증폭 된 서열은 &quot;HIV-1 프로브&quot;2) 내부 포지티브 대조군 서열 ( &quot;IPC (C. 포자충)&quot;)의 검출 1) HIV-1 게놈 ( &quot;HIV-1&quot;내의 시퀀스) 아르 &quot;. IPC 프로브&quot;으로 감지 될 때마다 반응에 포함 된 IPC는 C.에 상보적인 영역을 포함하는 템플릿과 프라이머 ( &quot;앞으로 PCR&quot;와 &quot;PCR은 역&quot;)로 작은와 포자충의 유전체를 사용하여 PCR을 통해 생성 된 포자충 (보라색)과 HIV-1 (파란색)에 상보적인 지역. 원래 분석 화학 2014 년에 출판 그림은, 허락 9 여기에 재판. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig2.jpg" /> 그림 2 : <strong&gt; IPC 후보들의 스크리닝. (A)는 두 개의 IPC 후보 ( &#39;앞으로 짧은&#39;및 &#39;앞으로 긴&#39;) 및 공지 된 PCR 양성 대조군 서열은 PCR을 이용하여 생성하고 415 bp의 435 bp의 밴드를 볼 수 있었다 아가 로스 젤에서 가시화되었다 . 104 및 105 복제본의 총 존재시 (C) 이상 IPC 후보 증폭 동안 지속적으로 (B) IPC 짧은 후보는, 실시간 RPA 동안 작은 증폭을 나타내었다. 원래 여기에 허가 9 재판 분석 화학 2014 년에 출판 그림. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52620/52620fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 공동 A 중에 발생하는 일반적인 원시 형광 데이터열 사이 클러에 HIV-1 DNA와 IPC의 lification. HIV-1의 감지 증폭 발병 (A), HEX 형광의 증가로 명백 도시는 HIV-1 DNA 고농도 앞부분 일어난다. IPC, FAM 형광의 증가로 명백 도시 검출 증폭의 발병 (B)에 관계없이 HIV-1 DNA 농도가 거의 동시에 발생한다. 그러나, FAM 형광 생성 속도 인해 경쟁 HIV-1 DNA의 양은 반비례한다. 원래 분석 화학 2014 년에 출판 그림은, 허락 9 여기에 재판. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig4highres.jpg" /> 그림 4 : 현미경에 HIV-1 DNA와 IPC의 공동 증폭 중에 발생하는 일반적인 원시 형광 데이터 (A) t에 생성 된 데이터 유사합니다.그 서열 증폭기, HEX 형광의 증가로 명백 도시 검출 HIV-1의 발현의 증폭은, HIV-1 DNA 고농도 앞부분 일어난다. FAM 형광으로 나타낸 현미경 (B) IPC 증폭은, 높은 HIV-1 DNA 농도가 낮은 시료에서 HIV-1 DNA 농도 피상 항상은 아님은 자명하다. (C) 표준 곡선은 높은 R 2 계수를 산출 JoVE_standard_curve.m 스크립트를 사용하여 구축 할 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig5highres.jpg" /> 도 5 :. HIV-1의 전형적인 표준 곡선 JoVE_standard_curve.m 스크립트 사용은, 원시 HEX 형광 데이터가 HIV-1의 증폭 중에 생성 불명의 HIV-1 DNA 농도를 예측하는데 사용될 수있는 표준 곡선을 작성하는 처리 샘플. 이 표준 곡선 (Z = 1) experim 5의 데이터를 사용하여 생성 된엔트, 여기서 6 농도는 각각의 농도에서 2 회 반복하여 시험을 하였다. 모든 농도는 LOG10 사본에 제시되어있다. 원래 분석 화학 2014 년에 출판 그림은, 허락 9 여기에 재판. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig6highres.jpg" /> 도 6 :. 알고리즘 튜너 빌리티 알고리즘 파라미터를 조정하여 미지 시료의 농도를 예측하기 위해 사용되는 표준 곡선을 변경한다. JoVE_validation_and_quantification.m 스크립트는 Z = 1 (적색) 및 Z = 5 (청)를 사용하여 미지 시료의 농도를 예측하는 데 사용되었다. 모든 농도는 LOG10 사본에 제시되어있다. 예측은 낮은 DNA 농도보다 정확한 경우 Z = 1; 예측 알고리즘 파라미터를 조정함으로써, Z는 = 5. qRPA 표준 곡선 임상 필요에 따라 조정될 수있다 높은 DNA 농도가 더 정확하다. 그림원래, 분석 화학 2014 년에 출판 허가 9 여기에 재판. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시료 농도 </td><td> 평균 예측 농도 </td><td> 표준 편차 </td><td> 긍정적으로 확인 된 샘플의 비율 </td></tr><tr><td> 어떤 대상을 제어하지 </td><td> 0.1 </td><td> 0.3 </td><td> 10 % </td></tr><tr><td> (1) </td><td> 0.9 </td><td> 0.1 </td><td> 100 % </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 2.2 </td><td> 0.5 </td><td> 100 % </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 0.1 </td><td> 100 % </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3.7 </td><td> 0.1 </td><td> 100 % </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 4.2 </td><td> 0.2 </td><td> 100 % </td></tr></tbody></table> 표 1 : HIV-1 qRPA 분석 검증 standa 사용.도 4의 RD 커브는 JoVE_validation_and_quantification.m 스크립트는 5 추가 실험을 위해 샘플 (LOG10 복사본)에 농도를 예측하는 데 사용되었다. 원래 분석 화학 2014 년에 출판 된 표는, 허가 9 여기에 재판.

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Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

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Universidad San Sebastian

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13.5K 조회수.  Rice University. Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

연구

유전학

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

면역학 및 감염병학

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The use of environmental DNA (eDNA) samples for detecting macrobiota is one such group of methods that is rapidly becoming popular and being implemented in national management programs. Here we focus on the development of species-specific targeted assays for probe-based quantitative PCR (qPCR) applications. Using probe-based qPCR offers greater specificity than is possible with primers alone. Furthermore, the ability to quantify the amount of DNA in a sample can be useful in our understanding of the ecology of eDNA and the interpretation of eDNA detection patterns in the field. Careful consideration is needed in the development and testing of these assays to ensure the sensitivity and specificity of detecting the target species from an environmental sample. In this protocol we will delineate the steps needed to design and test probe-based assays for the detection of a target species; including creation of sequence databases, assay design, assay selection and optimization, testing assay performance, and field validation. Following these steps will help achieve an efficient, sensitive, and specific assay that can be used with confidence. We demonstrate this process with our assay designed for populations of the mucket (Actinonaias ligamentina), a freshwater mussel species found in the Clinch River, USA.

Environmental DNA assays require rigorous design, testing, optimization and validation before the collection of field data can begin. Here, we present a protocol to take users through each step of designing a species-specific, probe-based qPCR assay for the detection and quantification of a target species DNA from environmental samples.

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

환경과학

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction followed by probe hybridization on a nylon membrane, which is re-usable. Probes are 5' amine modified to allow fixation to the membrane. Primers are 5' biotin modified which allows detection of hybridized PCR products using streptavidin-peroxidase and a chemiluminescent substrate via photosensitive film. With low setup and consumable costs, this technique is inexpensive (approximately US$2 per sample), high throughput (multiple membranes can be processed simultaneously) and has a short turnaround time (approximately 10 hours). 
The technique can be utilized in a number of ways. Multiple probes can be designed to detect sequence variation within a single amplified product, or multiple products can be amplified
simultaneously, with one (or more) probes used for subsequent detection. A combination of both approaches can also be used within a single assay. The ability to include multiple probes for a single target sequence makes the assay highly specific.
Published applications of mPCR/RLB include detection of antibiotic resistance genes1,2, typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus3-5 and Salmonella sp6, molecular serotyping of Streptococcus pneumoniae7,8, Streptococcus agalactiae9 and enteroviruses10,11, identification of Mycobacterium sp12, detection of genital13-15 and respiratory tract16 and other17 pathogens and detection and identification of mollicutes18. However, the versatility of the technique means the applications are virtually limitless and not restricted to molecular analysis of micro-organisms.
The five steps in mPCR/RLB are a) Primer and Probe design, b) DNA extraction and PCR amplification c) Preparation of the membrane, d) Hybridization and detection, and e) Regeneration of the Membrane.

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

An inexpensive, high throughput method for simultaneous detection of up to 43 molecular targets is described. Applications of mPCR/RLB include microbial typing and detection of multiple pathogens from clinical samples.

멀티 플렉스 PCR 및 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석 (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

생물학

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

의학

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with integrated fluorescence detection of amplicons. Isothermal nucleic acid amplification technologies eliminate the need for thermal cycling; however, fluorescence-based detection of products is still required for real-time, quantitative results. Several portable isothermal heaters with integrated fluorescence detection are now commercially available; however, the cost of these devices remains a significant barrier to widespread adoption in resource-limited settings. Described here is a protocol for the design and assembly of a modular, low-cost fluorimeter constructed from off-the-shelf components. Enclosed in a compact 3D printed housing, the fluorimeter is designed to be placed atop a commercially available heat block holding a PCR tube. The fluorimeter described here was optimized to detect fluorescein isothiocyanate (FITC) dye, but the system can be modified for use with dyes commonly used as reporters in real-time nucleic acid amplification reactions. Clinical applicability of the system is demonstrated by performing real-time nucleic acid detection with two isothermal amplification technologies: recombinase polymerase amplification (RPA) for detection of positive control DNA provided in a commercial kit and reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for detection of clinically meaningful levels of SARS-CoV-2 RNA.

Detailed instructions are provided to build an open-source, modular fluorimeter that is compatible with many low-cost heaters to perform real-time, quantitative isothermal nucleic acid amplification.

자원 제한 환경에서 실시간 이소레말 핵산 증폭 반응을 모니터링하는 오픈 소스 소형 플루오리미터

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

생체공학

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...