Name: analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.

P. 1. 준비 chrysogenum 기아 실험에 대한 <ol><li> P. 경우 관심 chrysogenum 변형이 쌀 ( &#39;녹색 쌀&#39;)에 보관되어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균사체를 포자 덮여 2-3 쌀 곡물을 배치합니다. 500 μL의 YGG (10g / L의 KCl, 20g / ℓ의 포도당 10g / L 효모 질소베이스, 5g / ℓ K 2 HPO 4, 20g / ℓ 효모 추출물)로 채 웁니다. <ol><li> 포자 효율적 벼에서 분리 할 수​​ 있도록 30 초 동안 와동 튜브. </li><li> 실온에서 1 날 (예를 들어, 20 내지 25 °의 C)에 대해 튜브를 부화. </li><li> 멸균 수돗물이 포자 현탁액의 1/50 희석을 준비, 잘 섞는다. </li></ol></li><li> P. 경우 관심 chrysogenum 균주 한천 플레이트 (예 YGG 한천 플레이트)에 보관하고, 400 μL 무균 수돗물 약 100 mg을 GL을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 균사체의 작은 조각을 전송할멸균 된 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 엉덩이 구슬. <ol><li> 소용돌이는 2 분 동안 튜브되도록 균사체 단편화된다. 즉시 튜브의 내용을 사용합니다. </li></ol></li></ol> P.의 재배 2. 준비 단계 기아 패드에 chrysogenum <ol><li> 가열 접시에 전환하고 약 60 ° C로 설정합니다. </li><li> 전자 레인지 용액을 요리 수돗물 100 ㎖의 아가 2g을 녹인. 이 솔루션은 가열 후 완전히 명확주의하십시오. 그렇지 않은 경우, 아가 로스가 완전히 용해 될 때까지, 다시 조리. 아가로 오스 솔루션은 사용하기 전에 약 60 ° C로 냉각 보자. </li><li> 400 μL 멸균 탭 각 (추가 화합물이 첨가되지) 물이나와 (샘플의 수에 따라 2-4)를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 채우기 400-X μL (단계 2.5 화합물 용액 ㎕의 x를 추가)하고이를 배치 적어도 1 분 동안 가열 플레이트 상으로되도록 와트어 내부에 따뜻한 가져옵니다. </li><li> 적어도 1 분 동안 가열 접시에 중앙 캐비티를 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브와 소용돌이 짧게에서 솔루션에 아가로 오스 400 μL 2 %를 추가합니다. 원하는 경우이 단계 후에, 추가 화합물 (즉, 1 μM 라파 마이신)를 추가합니다. 이 작업을 수행 할 경우, 소용돌이 각각의 추가 물질은 튜브에 피펫되어 잠시 후. 조기 고화를 방지하기 위해, 가열 테이블에 다시 넣어 튜브. 주 : microcentrifuge 관의 총 부피는 800 ㎕를해야한다. </li></ol> 기아 패드를 포함하는 현미경 슬라이드 3. 준비 <ol><li> (정지 가열판에 위치) 현미경 슬라이드의 공동 내로 아가 용액 140 μL 피펫. 가능하면 거품을 피하기 위해보십시오. </li><li> 즉시 아가로 오스 솔루션 상에 커버 슬립을 배치합니다. 참고 :이 평평한 표면에 발생합니다. </li><li> 마이크로 넣어약 4 분의 실험실 벤치 위에 범위 슬라이드 아가로 오스 패드를 응고시킬 것입니다. </li><li> 조심스럽게 엄지 또는 검지의 도움으로 그것을 떨어져 밀어 아가로 오스 패드에서 커버 슬립을 제거 (오염을 방지하기 위해 장갑을 착용!). </li><li> 탈수를 방지하기 위해 젖은 챔버로 패드 현미경 슬라이드를 놓습니다. 권장 사항 : 여전히 피펫 팁을 유지하기위한 삽입을 가진 빈 팁 상자를 사용합니다. 바닥이 적용되도록 상자에 멸균 물을 추가합니다. 삽입에 현미경 슬라이드를 놓고 상자를 닫습니다. </li></ol> 4. P.와 기아 패드를 접종 chrysogenum 및 배양 <ol><li> 1/50 포자 (문화 쌀 재배 된 경우) 희석 또는 기아 패드의 중심에 (문화 agar 접시에 성장 된 경우) 균사체 단편을 포함하는 원액의 5 μL의 피펫 5 μL. </li><li> 이 역할 (습식 챔버를 닫고 비닐 봉지에 포장기아 패드의 탈수에 대한 추가 보호). 너무 많은 그렇지 않으면 접종 방울을 방해하기 때문에 상자를 이동하지 않도록주의하십시오. </li><li> 샘플을 분석하기 전에 적어도 20 시간 동안 실온에서 포장 상자를 보관하십시오. </li></ol> 샘플 5. 현미경 분석 <ol><li> 배양 20 시간 후 샘플을 현미경 분석을위한 준비; 드라이 티슈에 현미경 슬라이드를 넣어 (바닥에 물기가 경향). </li><li> 기아 패드 위에 물을 소량 (약 50 μL)를 피펫. 패드에 커버 슬립을 넣고 여분의 물을 짜 낸다. 티슈로 여분의 물을 제거합니다. </li><li> 형광 현미경의 관찰 테이블에 현미경 슬라이드를 넣습니다. 균사체 성장의 개요를 얻으려면, 20 배 목표를 사용합니다. 균사에서 GFP의 지역화 연구를위한 사용 63X 또는 100X 목표. 샘플에 대한 분석을하지 않는 샘플의 점진적인 탈수를 방지하기 위해,15 분 이상 습식 챔버에 다시 놓기 전에. </li><li> (40 시간과 성장의 60 시간 후, 예를 들면) 일정한 간격으로 5.3를 반복합니다. 참고 : 샘플은 습식 챔버에 다시 넣을 수 있습니다. 그것은 균사체 생장에 영향을주지 않는 커버 슬립을 제거 할 필요가 없다. </li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control:+an+integrated+network+of+pathways.">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li><li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+filamentous+fungi.">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li><li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina:+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing.">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Iraqui, I., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina+target+of+rapamycin.">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li><li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae.">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Balguerie, A., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants.">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li><li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus.">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li><li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum.">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li><li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum.">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li><li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+improving+and+using+green+fluorescent+proteins.">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li><li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+regulation+of+autophagy.">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li><li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro.">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

여기에 제시된 방법은 P.에서 자식 작용의 편리하고 재현성 연구를 할 수 있습니다 chrysogenum. 예를 들면, 곰팡이는이 아닌지의 자식 작용 반응을 조절할 수있는 여부를 다양한 화합물의 효능의 스크리닝에 사용될 수있다. 라파 마이신과 결과는 TOR 신호 전달의 억제는 P.에서 자식 작용의 뚜렷한 유도에 이르게 입증 chrysogenum 다른 생물 (11)에 대한 입증 된. 그것은 더 정교한 현미경 (예, 공 초점 레이저 주사 현미경) 분석에 대한 고갈 균사 성장 패드를 사용하는 것이 가능하다. 이 샘플은 목적 (반전 현미경) 위의 목적 아래에 배치되어 있는지 여부를 중요하지 않습니다. 특정 구획을 대상으로 다양한 형광 단백질은 자식 작용하는 동안 다른 세포 소기관의 운명 (예를 들어, 미토콘드리아 모니터링하는 데 사용할 수있는 -&gt; mitophagy를, 세포질 Reticulum -&gt; ER-phagy 등).. 요약하면, 여기에 기재된 기술은, 현미경 (12) 진균을 연구하기위한 방법의 스펙트럼을 확장한다. 이 프로토콜은 일반적으로 간단하고 사용하기 쉽습니다. 그러나, 기아 패드 유물 및 세포 사망을 초래할 것이로 건조하는 결코 것이 매우 중요합니다. 따라서 강력하게 (ⅰ) 여전히 액체 아가 용액을 함유 현미경 슬라이드를 가열판으로부터 즉시 제거된다 (단계 3.3), (II) 평평한 표면을 제조하기위한 커버 슬립이 후 기아 패드로부터 제거되는 것을 제안 분석하지 않을 경우 5 분 (3.3 및 3.4 단계)의 최대가, (ⅲ) 현미경 슬라이드는 항상 젖은 실에 보관되어 있는지 (3.5 단계 5.4) 및 (IV) 현미경 분석이 15 분 이상 소요되지 않도록한다 (단계 5.3). 또 다른 중요한 측면은 기아 패드에 피펫 포자 또는 균사 조각의 시작 양이 너무 높지해야한다는 또는너무 낮습니다. 이것은 쉽게 살균 수돗물을 사용하여 콘텐츠의 희석에 의해 제어 될 수있다. 1.1.3에 설명 1/50 희석 P. 잘 작동 포자 현탁액 chrysogenum. 그것은 우리의 곰팡이와 함께 사용하기위한 권장 희석하지만 일부 조정이 필요할 수 있습니다. 방법의 한계는 이상에서 15 분 동안 저속 촬상 실험 바람직하지 않기 때문이다. 이 습식 챔버로부터 제거되면이 기아 패드의 점진적인 탈수 때문이다. 긴 관찰 시간이 필요한 경우는이 패드의 중앙 영역에서 약간의 탈수를 방지하지 않더라도 기아 패드의 프린지 멸균 수돗물을 소량 첨가 할 수있다. 또 다른 방법은 제한이 엄격 정량적 없다는 것이다. 단세포 생물에서는 세포 당 이벤트를 득점 할 수있다 (예를 들어, 공포에 GFP를 포함하는 세포의 양). 한편, P. chrysogenum 사상균은 characte 그대로다세포 구조에 의해 정리 된. 세포 세포질 소기관의 전달을 허용하는 중앙 구멍을 포함 격막에 의해 분할된다. 따라서 샘플은 &#39;정량적 반&#39;분석 할 수 있습니다 (예를 들어, 공포에 지역화 된 GFP 포함 균사의 수). 의미를 달성하기 위해 그 (결정적 시점과하지만 더 테스트 조건 당 적어도 80 바람직 함) 분석 균사의 수가 충분히 높은 것이 매우 중요하다. 자식 작용을 연구하기위한 기아 패드의 이용을 용이하게 다른 사상균에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 그러므로 여기에 제시된 프로토콜은 P. 한정되지 않는다 chrysogenum. 또한, 즉 효모 단세포 곰팡이와 그것을 적용 할 수 있어야한다. 고등 생물 (예를 들어, 선충)에 프로토콜의 전송은 아마보다 전문적인 적응이 필요합니다. 그것은이 작품에서 설명하는 방법도 발견 여부를 확인하기 위해 흥미로운 일이 될 것이다다른 분야에서의 사용.

사상균은 발달 과정의 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 싼 재배, 자손 유전 적 접근성의 높은 번호와 같은 몇 가지 실험적인 혜택을 제공합니다. 마지막 포인트는 다양한 세포 메커니즘에 대한 이제까지의지지 않은 유전자의 중요성을 조사 허용 형질 전환 체의 건설을위한 특별한 관련이있다. 사상 균류는 잉여 및 / 또는 장애 세포 구성 요소의 제거를 위해 미토콘드리아 무결성과 자식 작용을 유지하고 유지하기위한 몇 가지 요소와 비정상적인 단백질, 미토콘드리아 역학의 분해 단백질 분해 효소 활동 등 셀룰러 품질 관리 경로의 메커니즘의 해명을위한 수단이되었습니다 기아 1,2,3 번에서 세포 생존 능력. 사상 균류 2 자식 작용의 연구에 사용할 수있는 여러 가지 실험 기법이있다 : 공포의 (ⅰ) 조사 전프로테아제는 투과 전자 현미경 (4)에 의해 억제 될 때 F 이들은 치밀 포식 체를 포함하는, (II)의 형광 염료 monodansyl의 카다를 이용하여 형광 현미경 5,6- 산성화 autophagosomal 구조 (III) 검출을 통해 GFP-Atg8 병소 모니터링함으로써 autophagosomes 가시화 7. 여기에, 자식 작용의 연구에 페니 chrysogenum 성장의 새로운 방법을 제시한다. 주요 요소는 단순히 아가 살균 수돗물에 용해 된 1 %로 구성 &#39;기아 패드&#39;이다. 추가 화합물 (예, 스트레스는, 스 캐빈 저는, 자식 작용 변조기)만큼 그들은 자동 형광 표시되지 않는 패드에 첨가 될 수있다. 패드는 얕은 중앙 캐비티를 포함 현미경 슬라이드에 있습니다. 포자 현탁액 또는 작은 균사체 파편 중 하나 접종에이 패드. 관심의 변형이 sporulat하지 않았을 경우에는, 후자는 것이 좋습니다효율적 전자 (예를 들어, Δ의 atg1 균주 8). 슬라이드는 샘플의 탈수를 방지하기 위해 (이들 용이 빈 피펫 팁 박스를 사용하여 구성 될 수있다)하고, 실온에서 배양 습윤 챔버에 위치된다. P. chrysogenum 이러한 조건 하에서 몇일 성장할 수있다. 자식 작용은 곰팡이 자식 작용에 대한 긍정적 인 마커 액포 확대하여 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 기여, P.에서 chrysogenum 변형 (위스콘신 54-1255)는 자사의 C 말단 &#39;SKL&#39;순서 9 퍼 옥시 솜를 대상으로 녹색 형광 단백질을 형성하는 데 사용됩니다. 그러므로 페 록시의 열화를 모니터링하는 것이 가능하다. 이는 적절한 위치 파악 신호를 이용하여도 셀 (예를 들면, 미토콘드리아)의 다른 구획에 라벨 그들의 열화를 분석 가능하다. P. 데이터 있지만 chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL)는 확실히 가능하고, 여기에 제시다른 진균에 대해서도 &#39;기아 패드&#39;방법을 사용하려면 (예를 들어, 뉴로 crassa의, Sordaria의 macrospora, 아스 페르 길 루스 종 등).

<table><tbody><tr><td>Microscope slides with central cavity</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>H884.1</td><td>These can be used multiple times after cleaning.</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>A553.1</td><td>Diameter: 0.25 - 0.50 mm</td></tr></tbody></table>

analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

P.에 퍼 옥시 저하 위에 설명 된 프로토콜의 유틸리티를 설명하기 위해 chrysogenum 변형 Ws54-1255 (GFP-SKL)을 분석 하였다. 이 변형에서 GFP-SKL은 일반적으로 퍼 옥시 솜 (9)로 가져옵니다. 시료를 형광 현미경을 통해 분석 될 때 여러 구형의 모양을 초래한다. 자식 작용이 발생하는 경우, 액포는 확대. GFP-SKL은 자식 작용 (pexophagy)에 의해 공포에 통합된다. 인해 GFP는 액포 프로테아제 분해에 대한 저항성이 있다는 사실 이들 소기관 열 라벨. 따라서 액포이 변형, 공포의 확대 및 GFP-SKL의 현지화 자식 작용 (pexophagy)를 관찰하기위한 두 개의 매개 변수가 편리 형광 현미경으로 모니터링됩니다. 배양 20 시간에서, GFP가 액포 (도 1)에서 관찰되지 않는다. 또한, 공포의 확대가 이루어지고 있지 않습니다. 그러나, 성장 GFP 표지 된 액포 40 시간을 연속적활성 (그림 1)이 될 자식 작용 (pexophagy)을 나타내는, 균사의 일부에 표시됩니다. 성장의 60 시간을 연속적으로 GFP 표지 된 액포의 양은 더 증가하고있다. 음성 대조군 P.의 Δ의 atg1 돌연변이로 chrysogenum은 (Δ의 atg1 (GFP-SKL)) (그림 2)를 사용 하였다. 어느 쪽도 확대도 GFP 표지 공포는이 균주에서 관찰 할 수 없습니다. 양성 대조군으로, 자식 작용 자극 약물 라파 마이신 (그림 3)를 사용한다. 성장의 40 시간 후 GFP 표지 공포가 표시됩니다. 60 시간에서, 균사가 완전히 거대한 GFP 함유 액포 (그림 3)으로 가득 차 있습니다. 이 발견은, 예상대로 대규모 자식 작용 여기에 발생하는 것을 나타냅니다. 종합적으로, 이러한 결과는 실험 장치의 유효성을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig1highres.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 1 :. 기아 패드에 재배시 Ws54-1255 (GFP-SKL)에서 GFP-SKL의 현지화 지정된 시간에, 기아 패드에 성장 문화는 형광 현미경을 사용하여 분석 하였다. 대표적인 이미지는 각 시점에 대해 도시된다. 대응하는 시야 영역은 형광 각 채널 영상 이하에 나타낸다. 화이트 &quot;V&quot;GFP-SKL는 퍼 옥시 저하를 나타내는 공포에 지역화. 스케일 바 : 10 μm의. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 기아 패드에 재배하는 동안 Δ의 atg1에서 GFP-SKL (GFP-SKL)의 현지화 지정된 시간에, 기아 패드에 성장 문화는 형광 현미경을 사용하여 분석 하였다. 대표적인 이미지는 각 시점에 대해 도시된다. 시야 영역을 대응하는 각각의 형광 아래와 같다채널 이미지. 스케일 바 : 10 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. 자식 작용의 유도를 위해 라파 마이신으로 치료 Ws54-1255 (GFP-SKL)에서 GFP-SKL의 현지화 1 μM 라파 마이신 보충 기아 패드에서 재배 지정된 시간 배양에서 형광 현미경을 사용하여 분석 하였다. 대표적인 이미지는 각 시점에 대해 도시된다. 대응하는 시야 영역은 형광 각 채널 영상 이하에 나타낸다. 화이트 &quot;V&quot;GFP-SKL는 퍼 옥시 저하를 나타내는 공포에 지역화. 스케일 바 : 10 μm의.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

8.5K 조회수.  Senckenberg Research Institute. A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

비디오: Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

연구

면역학 및 감염병학

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

생물학

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

신경과학

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

자식 작용의 분석에

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터