Name: surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
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This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

참고 : NIH 윤리 지침과 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회, 샌프란시스코의 승인 프로토콜 요구 사항을 준수 모든 절차와 동물 취급. 1. 수술에 대한 동물 준비 <ol><li> 깨끗하고 전용 공간에서 수술을 수행하십시오. 수술 전에 유리 비드 살균기로 살균, 모든 수술 도구를 압력솥. 참고 :이 프로토콜에서 출생 후의 일을 10 ~ 12 (P10-12) FVB 마우스를 사용합니다. 다양한 연령 및 생쥐 균주는 특정 프로젝트의 요구를 충족시키기 위해 사용될 수있다. 수포 뼈 어렵게 가져 오기 때문에 P40보다 오래된 마우스는 어려울 수 있습니다. </li><li> 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / kg), 자일 라진 하이드로 클로라이드 (10 ㎎ / kg), 및 아세 프로 마진 (/ kg 2 mg)의 혼합물을 복강 내 주사로 마우스를 마취. 동물이 더 이상 이러한 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응 후에 수술 준비를 시작합니다. 만약 necessarY는 원래 평면 마취제를 복원 마취제 칵테일 접종 (1/5 원래 투여) 투여. 참고 :이 나이에 관찰 된 사망률의 대부분이 마취제 과다 복용에 의해 발생하기 때문에이 단계에서주의하십시오. </li><li> 동물의 깜빡임을 억제, 마취 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 보호 안과 연고와 동물의 눈을 감아 라. </li><li> 마우스가 완전히 깨어 때까지 마취 후 저체온증을 방지하기 위해, 절차 전반에 걸쳐 가열 패드에 확장 목 마우스를 놓습니다. </li><li> 클리퍼와 왼쪽 포스트 귀의 지역을 면도 및 수술 조작 전에 70 %의 에탄올과 포비돈 - 요오드 소독. </li></ol> 2. 수술 및 벡터 주입 <ol><li> 고막 수포를 노출 후 귀의 접근 방식을 사용합니다. 포스트 귀의 근육을 노출 작은 가위와 피하 조직을 절개. 지방 조직을 수축하는 토륨 후절개의 전자 후방 측은 측두골을 노출 수직 절개 좌우로 근육을 분리. 이 절개가 적절한 시각화 편안하게 작업 할 수있을만큼 긴 있는지 확인하십시오. </li><li> 25 G 바늘 고막 수포를 관통하고 달팽이관의 기저 차례에 액세스 할 수 있도록 다시 뼈를 박리함으로써 집게와 필요에 따라 구멍을 확장 한 다음 stapedial 동맥과 둥근 창 막을 시각화하기 위해 충분히 확대 (RWM) . </li><li> 보로 실리케이트 모세관 피펫 중앙에 부드럽게 RWM에 구멍. 이 시점에서 RWM를 통해 유체 유출을 준수; 이것은 정상입니다. 유출이 안정 될 때까지 기다립니다 (달팽이관에서 effluxed 유체는 멸균 여과지로 건조). 참고 : 잡고 RWM 천공이 가능한 한 작게되도록 유리 바늘을 전진 할 때주의하십시오. 사용되는 현미경에 따라, 피펫이 피펫을 사용하여 미세 조작기를 사용하거나 손으로 잡고홀더. </li><li> 같은 방법으로 패치 클램프 피펫을 준비 끌어 당기는 피펫을 사용하여 주입 피펫을 준비합니다. 팁 직경이 큰 (약 15 μm의 직경) 아웃 바이러스를 피펫 팅과 것은 쉽게 수행되도록 있는지 확인합니다. </li><li> 주입 피펫에 AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 또는 AAV2-GFP의 1 ~ 2 μL를 그립니다. 유출은 (5 ~ 10 분) 안정화, microinject 같은 구멍을 통해 스칼라 고실에이 고정 볼륨이 이전에 RWM에서 만든 후. </li><li> 근육의 작은 플러그 피펫을 잡아 당겨 후 신속하게 RW 틈새를 밀봉 둥근 창에서 누설을 방지하기 위해 근육에 배치 조직 접착제의 작은 방울로 고정합니다. 참고 : 아주 잘 바늘 달팽이관 -이 단계에서 어떤 외 림프 누출을 방지하기 위해 근육의 작은 플러그를 제거한 후이 구멍을 밀봉 청력을 보존하는 것이 중요합니다. 밀봉하지 않으면 완전히 RWM은 시간이 지남에 따라 청력 손실을 발생합니다. </li><li> 주입 후, 커버지방 조직과 청각 수포 구멍은, 정상 위치로 포스트 귀의 근육과 지방 조직을 반환하고 6-0 이하 흡수 크롬 봉합 층에 상처를 봉합. </li><li> 포비돈 - 요오드 상처를 소독. </li></ol> 3. 수술 후 케어 <ol><li> 따뜻한 새장에 마우스를 놓고 그들이 완전히 다시 어머니와 함께으로 이동 회복이 될 때까지 방치하지 않습니다. 이 어머니와 함께 다시 새끼를 착용하기 전에 케이지에서 남성을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> 염증과 통증을 관리하는 피하 카프로 펜 수술 후 통증, 3 일에 한 번씩 24 시간 (2 ㎎ / ㎏)을 관리합니다. 고통, 이상 체중 감소, 통증, 또는 감염의 흔적을 매일 동물을 모니터링합니다. 일반적으로 모든 마우스가 정상적으로 작동해야 수술 후 3 일째에 의해. 고통 또는 질병의 흔적은 3 차 하루 마우스에 표시하는 경우, t를 안락사 고려제도적 지침에 따라 그는 마우스. </li></ol> 청성 뇌간 반응 (ABR) 녹음을 사용하여 바이러스 성 납품 후 인공 와우 기능 4. 평가 참고 : 청성 뇌간 반응 (ABR)이 청각 두피 아래에 배치 전극을 통해 뇌에 지속적인 전기 활동에서 추출 기록 잠재력을 유발합니다. 동물 소리로 자극한다. 그 결과 기록은 청각 자극의 발병 후 첫 10 밀리의 청각 경로에서 연속 점의 전기적 활동을 반영 다섯 파도로 구성되어 있습니다. <ol><li> 아세 프로 마진이없는 것을 제외하고,이 프로토콜의 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 케타민 하이드로 클로라이드 및 자일 라진 하이드로 클로라이드의 혼합물을 복강 내 주사에 의해 생쥐를 마취. </li><li> 마우스가 완전히 깨어 때까지 마취 후 저체온증을 방지하기 위해, 청력 검사를 통해 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 참고 : 사용이 실험에서 다음과 같은 소리 자극 : (31 Hz에서 프리젠 테이션 속도 5 밀리 초 시간)을 클릭합니다. </li><li> 왼쪽 귀 (참조)의 날개 아래에 정점에 피하 주사 바늘 전극을 놓고 반대쪽 귀 아래 (접지)과 이전에 방음 실 (27, 28)에 설명 된대로 기록 ABRS를 시작합니다. 아래에서 최대 진폭 5dB 음압 레벨 간격으로 기록 ABR 파형. </li><li> ABR 임계 값 수술 후 빠르면 4 일 정도의 바이러스 배달 후 결정 참고 : 임계 값 파도에 대한 피크은 응답하는 가장 낮은 자극 수준으로 정의된다 I-V 분명히했다 및 육안 검사에 반복적으로 존재. </li><li> 나는 인공 와우 신경의 활동을 분석하는 웨이브를 측정한다. ABR 검출 파형을 산출 자극 최저 레벨은 임계 값으로 정의된다. </li></ol> 면역 형광을 사용하여 5. 달팽이 형질 전환 유전자의 단백질 발현 <ol><li> intrap의 과다 복용에 의해 생쥐를 마취케타민과 염산 자일 라진 하이드로 클로라이드의 혼합물을 주입 eritoneal는 아세 프로 마진이없는 것을 제외하고,이 프로토콜의 섹션 1.2에 기재된 바와 같이. </li><li> 동물이 더 이상 이러한 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응 후에 머리를 목을 벨. </li><li> 26 설명 된대로 전체 마운트 면역을 위해 밖으로 및 프로세스 cochleae을 해부하다. 안티 VGLUT3 및 안티 7A 미오신 항체를 사용하여 전체 인공 실장 면역 형광 상세한 프로토콜은 에이 킬 등., 2013 (29)에 기재되어있다. </li><li> 250 희석 : GFP 라벨의 경우, 1에서 토끼 방지 GFP 항체 4 ° C에서 하룻밤 인공 와우 전체 마운트를 품어. </li><li> PBS에서 4,000 : PBS와 10 분 동안 두 번 cochleae 헹구어 낸 후 CY2에 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 2 시간 동안 배양 1 희석. </li><li> 10 분 동안 두 번 PBS와 cochleae을 씻어 15 분 동안 DAPI으로 그들을 품어. </li><li> 유리 슬라이드에 cochleae을 마운트하고 싶게을 관찰공 초점 면역 형광 현미경을 어. </li></ol>

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M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

본 연구에서는 상세히 복원하거나 유전자 결함에 의해 훼손되어 정상 청각 기능을 구출하기위한 목적으로, 인공 유전자 치료에 사용될 수있는 기술을 설명한다. 그것은 전형적 외상성이므로,이 방법은 인공 유전자 전달 분자 또는 기타 잠재적 인 치료 (30)에 안전하다. 인공 와우 치료를위한 다른 접근 방법은 복부 접근 (24), 마우스와 기니 돼지 cochleostomy (31, 32) 및 림프 낭 배달 (33)를 포함하여 설명 하였다. 우리의 경험에 의하면, 후 귀의 접근 방식은 빠르고, 간단하고, 감소 된 부상과 동물의 사망률. 또한, 포스트 귀의 접근 방식은 외상의 가능성도 줄어들고 34,35,36 청각 관련 손실 RWM의 개선 된 시각화를 제공합니다. 이 보고서는 일에 AAV1-VGLUT3의 전달을 보여줌으로써 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 기술적 측면과 유틸리티를 문서화VGLUT3 및 GFP (그림 1과 그림 2와 그림 3A) 모두의 유전자 발현의 결과 선천성 난청이 마우스 모델에서 구조를 듣고 RWM를 통해 전자 내이. 유전자 전달 방법을 설명하는 이전 연구는 코르티 12,37,38,39,40,41의 기관의 중요한 영역에 제한된 유전자 발현을 보였다. 이러한 차이는 달팽이관에 바이러스 제제의 품질, 바이러스 벡터의 역가, 사용되는 혈청 형, 또는 단순히 불충분 한 바이러스 성 전달하기 때문에 발생하는 것일 수 있습니다. 대조적으로,이 후 이개 접근법을 사용하여, 우리는 달팽이관 걸쳐 AAV2-GFP 형질 전환 (도 2 및도 3a) 또는 후 내측 및 외측 모세포 및 리포터 유전자 (GFP)의 분포에 좋은 형질 전환 속도를 얻을 수 있었다. AAV1-VGLUT3 (도 3b)로 형질 IHCs의 백분율에 근거하여, 우리는 RWM 통해 형질 더 EFF가 있음을 시사바이러스 애플리케이션 (42)의 위치에 가까운 기초 차례로 높은 형질 전환 속도를보고 기니피그에 기재된 것을 포함하는 다른 방법에 비해 전체 관통 달팽이관 ective 균일. 적어도 년 반 달팽이관 내의 GFP / VGLUT3의 장기 발현은 다른 동물 모델 및 다양한 기관계 38,43로부터 얻은 데이터와 일치한다. 또한, 형질 전환 된 달팽이관의 조직 학적 분석이 자국의 vascularis과 나선 신경절 신경 세포 (26)를 포함하는 코르티 기관의 cytoarchitecture의 우수한 보존과, 염증 반응의 증거를 입증하지 않습니다. 또한, 고용 cochleostomy 방법과 대조적으로, 본 연구에 사용 RWM 형질 달팽이관 손상이 발생하지 않았고, 높은 볼륨 (31, 32)을 주입 할 수있다. 이 기술을 사용 외상의 부족은 동등한 ABR의 thresho을 보여줌으로써 확인 하였다운영 및 제어 귀 사이의 신분증, (4) 마지막으로, RWM을 통해 AAV-VGLUT3 배달 ABR 결과 등. 쌰 볼 것과 유사한는 WT 마우스 (그림 4a 및도 4b) (26)에서 본 것과 비교 임계 값 발견. 우리는 마우스의 모든 연령대에서이 기술을 사용했지만 수포 뼈가 관통하기 어렵게되고 수포의 골절은 젊은 쥐에서보다 이전에 선명하기 때문에이 P40보다 나이가 생쥐의 기술적 도전이다. 수포 뼈의 조각은 목 조직을 lacerates 경우 고령에서,주의는 피하지 않으면 출혈이 발생할 수 있습니다. 이전에 나타났다 결론적으로이 보고서는 AAV 기반 벡터를 사용하여 마우스의 인공 세포의 여러 종류에 성공 유전자 전달을 설명합니다. 유전자 전달이 기술은 청각 손실로 연결되지 않는 외상을 최소화하고, 달팽이관, INC 세포 내의 다양한 종류의 널리 형질 초래할 수유모 세포 및 나선 신경절 신경 세포를 luding. 그것은 청력 손실의 선천성 및 인수 형태로 다른 유형의 큰 잠재력 응용 프로그램을 가지고 있으며, 또한 청력 손실의 마우스 모델에서 분자 치료의 다양한 적용 할 수 있습니다.

유전자 치료는 긴 유전 청력 손실에 대한 잠재적 인 치료로 제안했지만,이 지역에서의 성공은 1 애매 남아있다. 현재까지 바이러스로 매개 방법론은 상대적으로 접근 할 수없는 달팽이관 내의 특정 세포 유형을 대상으로 이론적 능력 때문에 지배적했다. 모두 아데노 바이러스 (AV) 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)는 인공 유전자 전달에 사용되어왔다. AAVs는 여러 이유로 달팽이관에서 유리하다. 그들은 복제 결핍 바이러스이고 효율적으로 신경 세포, 청력 손실의 원인의 수에 대한 중요한 목표를 포함한 다양한 종류의 세포로 형질 전환 분자를 전송할 수 있습니다. 셀에 AAV 항목은 특정 수용체 2에 의해 매개된다 세포 유형이되도록 형질 도입에 따라서, 특정 혈청 형의 선택은 호환되어야한다. AAVs 효과적으로 유모 세포를 형질 감염 3 및 TRA의 안정된 장기 발현 결과, 숙주 게놈 내로 통합 할nsgenic 단백질과 세포 4 표현형 변화. 이러한 모발 세포 재생 단기 애플리케이션에 반드시 유리한 반면, 장기적 발현 유전자 결함을 안정된 구조에 매우 중요하다. AAVs 임의의 인간 질병 또는 감염과 관련된 어떠한 5,6,7- 내이 신경 독성을 증명하지 않으므로, 손실 8 청력 상속 형태의 유전자 치료에 사용하기위한 이상적인 후보이다. 바이러스 벡터를 사용하여 포유류 내이 내로 외인성 유전 물질의 전사는 지난 10 년간 연구되어 손실 9 청력 유전자와 형태 모두 취득을 치료하기위한 유망한 기술로서 떠오르고있다. 달팽이관 잠재적 여러 가지 이유로 유전자 치료에 이상적인 대상이다 : 작은 부피 필요한 바이러스의 제한된 양을 필요 1); 다른 기관계 제한 부작용 2) 상대적 격리; 및 3)는 유체 충전식 챔버 바이러스 용이미로 10, 11,12,13,14, 15에 걸쳐 배달. 선천성 청각 장애의 마우스 모델은 체계적, 복제 방법으로 내이의 개발을 모니터링하는 연구의 많은 방법을 사용 할 수 있습니다. 마우스 cochleae의 작은 크기는 약간의 수술 어려움을 제시 않지만, 마우스가 다른 종 (16)에 비해 여러 가지 실험적인 장점 유전 청력 손실의 연구에 매우 중요한 모델 역할을합니다. 마우스 모델은 유전자 연관 분석, 상세한 형태 학적 관찰의 수집 및 병원성 시나리오를 시뮬레이션을 통해 특성의 범위의 평가를 허용; 같은, 그들은 바이러스로 매개 유전자 치료에 대한 좋은 후보입니다. 기술적 진보와 함께 생쥐에서의 광범위한 유전 연구는 실험실 가능한 17,18, 19, 20, 21에 걸쳐 재현 가능한 방식으로 유전자 변형 마우스를 생성하도록 만들었다. Furthermor모두 취득이 동물 모델 22, 23, 24에서 엄격한 테스트를 허용, 마우스의 청력 손실 표현형을 상속에 대한 전자, 다양한 모델이 존재한다. 따라서, 마우스 모델에서 바이러스로 매개 유전자 치료를 사용하여 청력을 보정하는 것은 인간의 질병에 대한 치료법에 대한 검색에 적절한 첫 번째 단계입니다. 우리는 이전에 수 포성 글루타메이트 트랜스 포터 3 (VGLUT3를) 부족 형질 전환 마우스 인해 IHC 리본 시냅스 (25)에서의 글루타메이트 방출의 부족으로 청각 장애인을 태어나는 것으로 나타났습니다. 이 돌연변이는 감각 유모 세포의 주요 퇴보로 이어질하지 않기 때문에, 이러한 돌연변이 생쥐는 잠재적으로 선천성 난청 인공 유전자 치료를 테스트하기에 훌륭한 모델입니다. 현재까지, 인공 유전자 치료 용 바이러스 전달 다수의 기술을 통해 라운드 cochleostomy 윈도우 확산 막, 둥근 막 윈도우 주입 및 전달을 포함하여 설명되었다. 강력한있다원점이라 장점들 및 이러한 방법 (9)의 각각의 단점. 여기에서 우리는 둥근 창 막 (RWM)를 통해 VGLUT3 KO 마우스 내 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법을보고한다. 포스트 귀의 RWM 주입 방법은 우수한 청각 보존과 최소 침습적이며, 비교적 빠르다. 우리가 이전에 게시 한 바와 같이,이 마우스 모델에서 청각 복원하기위한 노력의 일환으로, VGLUT3 유전자 (AAV1-VGLUT3)를 들고 AAV1 벡터는 출생 후 12 일에이 청각 장애 생쥐의 달팽이관에 도입되었다 (P! @), 결과 26 청력의 회복. 트랜스 유전자의 단백질 발현이 면역 형광 (IF)를 사용하여 확인하면서 VGLUT3 KO 마우스에서 보청기는 청각 뇌간 반응 (ABR)에 의해 확인되었다. 따라서이 방법론은 바이럴 - 매개 유전자 치료하고자 달리 난청 결과 유전자 결함을 보정 할 수 있다는 점을 입증 해 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen analgesia</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary pipette</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Suture PDS*plus Antibacterial</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GFP antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puller Model P-97&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT BioSig III System&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

감각 신경성 난청의 기능 회복을 달성하기 위해 사용되는 유전자 치료는 청력 손실에 기여하는 기본 분자 유전 메커니즘의 이해를 부여 할 것을 약속드립니다. 내이 (內耳)에 벡터의 도입은 기존의 구조에 손상을 최소화하면서 널리 달팽이관을 통해 에이전트를 배포하는 방법으로 수행해야합니다. 이 원고는 분자, 약물 및 마우스 출생 후의 일 10 라운드 창 막 (RWM)를 통해 이전에 바이러스 성 전달을 사용하여 마우스 와우 치료에 사용할 수있는 포스트 귀의 수술 방법을 설명합니다. 혈액 손실을 최소화하고 동물의 사망률을 피하면서이 수술 방법은 스칼라 고실에 신속하고 직접 전달할 수 있습니다. 이 기술은 필수적인 내부 및 중이의 구조뿐만 아니라 목 근육 완전히 청력을 유지하면서 무시할 또는 전혀 손상을 포함한다. 이 수술 기법, 소낭 glutam의 효능을 설명하기 위해3 녹아웃 (VGLUT3 KO) 마우스가 아데노 관련 바이러스 (AAV-1)를 사용하여 내 귀에 VGLUT3의 출산 후 청각 복구 선천성 청각 장애의 마우스 모델의 예로서 사용되는 수송을 먹었다.

기술적 특징과 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 유틸리티를 확인하려면 AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 및 AAV2-GFP는 RWM를 통해 P10-12 마우스 내이 (內耳)에 전달했다. 이 방법은 내부 유모 세포 내에서 성공적으로 유전자 발현을 보여줍니다 (IHC) (VGLUT3 그림 1과 GFP 그림 2와 GFP 그림 3A), 외부 유모 세포 (OHC) (GFP 그림 2)와 지원 세포 (GFP 그림 2와 그림 3A) (26) 코르티 손상의 중요한 기관이없는. 인공 전체 마운트 면역 형광 이미지 (도 2 및도 3a)에서 본 GFP를 발현하는 다른 형태의 세포 관찰 한 AAV 혈청 형의 선택은 형질 도입되는 세포 유형과 호환 가능해야한다는 것을 보여준다.도 2 및도 3a도 1을 (26) 아주 좋은 TR을 보여IHCs 및 OHCs 모두 ansfection뿐만 아니라 AAV1 또는 AAV2-GFP 또는 AAV1-VGLUT3 형질 전환 후 달팽이관에 걸쳐 유전자 단백질 (GFP / VGLUT3)의 분포. AAV1-VGLUT3 형질 (그림 3B) 후 VGLUT3을 표현 IHCs의 분포 (26)는 RWM를 통해 형질 전환 가까이 바이러스 전달의 사이트에 더 높은 형질 전환 속도를보고있는 다른 방법보다 전체 달팽이관을 통해보다 효과적이고 균일 제안합니다. 우리는 형질 전환 속도가 (도 1) 26 내이 주입 바이러스의 양을 증가시킴으로써보다 효율적으로 이루어질 수 있다는 것을 발견 하였다. 아니 인공 손상 VGLUT3 KO 마우스 IHCs에 성공 VGLUT3 식의 우리의 관찰은 구출 KO 마우스에 ABRS를 측정하여 청력 테스트 우리를 이끌었다. 그림 4a 및도 4b (26) 문서로 AAV1-VGLUT3의 후 귀의 RWM 전달의 능력 내부 전자VGLUT3 KO 마우스의 Ar은 선천성 난청이 마우스 모델에서 구조 청각 생성한다. 청성 뇌간 반응 (ABR) 트레이스 KO (그림 4A) 구조 VGLUT3 복원하고, ABR 임계 값은 야생형 마우스 (그림 4B)에서 본 것과 측정과 차이가 없었다되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. P10-P12 KO ​​마우스에 RWM 바이러스 성 전달 후 VGLUT3 IHC 형질 형질 cochleae는 안티 Myo7a 항체, 헤어 세포 마커 및 VGLUT3에 대한 항체를 사용하여 면역 형광 염색 P30에서 조사 하였다. KO 마우스에서 IHCs가 Myo7a 만 표현하면서 Myo7a과 VGLUT3은 만 WT의 모든 IHCs 표현했다. 구출 마우스 cochleae는 VGLUT3을 표현 일부 IHCs을 보였으며, 모든 IHCs는 Myo7a (행 3) IHC 표현했다. 내부 유모 세포를. 허가를 다시 인쇄(26). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52187/52187fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig2highres.jpg" /> 도 2 : 마우스 인공 전체 실장 야생형 P10-P12 생쥐 RWM AAV2-GFP 배달 AAV2-GFP 마우스 달팽이관 후의 이개 접근법을 사용하여 바이러스 전달을 평가하는데 사용 된 후에 면역 형광을.. AAV2-GFP 배달 P10-12 행해졌 GFP 형질 전환 및 발현은 항 GFP 항체를 이용하여 P21에서 달팽이관 조사 하였다. WT 마우스에 GFP 발현 (녹색) 인공 와우 전체 마운트는 내부 유모 세포 (IHC)보다 외부 유모 세포 (OHC)에 강한 GFP 발현을 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 마우스 COC<html> GFP의 달팽이관 식에 AAV1-GFP의 전달이 내부 유모 세포 (IHC)과지지 세포 (A),하지만 OHCs에서 볼 수 야생 형 P10-P12 마우스에 RWM AAV1-GFP 배달 후. 후 면역을-전체 마운트 hlear , VGLUT3 KO 마우스 (B)의 달팽이관에 AAV1 - VGLUT3 배달 VGLUT3 식의 결과 만 IHCs에 반면. AAV1-VGLUT3 전달 후 VGLUT3 KO 마우스의 달팽이관에 VGLUT3을 표현 IHCs의 수는 내이 (inner ear)에 전달 바이러스의 양의 따라 달라집니다; 바이러스의 0.6 μl를 주입 할 때 바이러스의 1 μL가 전달 된 후 IHCs의 100 % VGLUT3을 표현하는 반면 예를 들어, IHCs의 40 %, VGLUT3를 표명했다. 바이러스의 0.6 μl를 주입했을 때 정점, 중간 회전, 또는베이스 사이에 VGLUT3 발현에 차이가 없었다. (26)의 허가를 다시 인쇄합니다. g &quot;/&gt; . 그림 4 : 청성 뇌간 반응 (ABR) 평가 AAV1-VGLUT3 배달 후 대표 ABR 파형 구조와 야생형 생쥐 사이의 유사했다; 대조적으로, 더 ABR 파형 KO 마우스 (A)에 나타나지 않았다. 구출 KO 마우스는 또한 측정 ABR 임계 값을 보였다. ABR 선택된 임계 값 측정 모든 주파수 (B)에 대한 WT 마우스에서 본 견줄만했다. I :. (26)의 허가와 ABR 파 I. 재 인쇄 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52187/52187fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K 조회수.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) has been shown to be a useful approach to local drug delivery into the inner ear. The goal of this article is to describe, in detail, the surgical techniques involved in canalostomy in both adult and neonatal mice. As indicated by fast-green dye and adeno-associated virus serotype 8 with the green fluorescent protein gene, the canalostomy facilitated broad distribution of injected reagents in the cochlea and vestibular end-organs with minimal damage to hearing and vestibular function. The surgery was successfully implemented in both adult and neonatal mice; indeed, multiple surgeries could be performed if required. In conclusion, canalostomy is an effective and safe approach to drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice and may be used to treat human inner ear diseases in the future.

Here we describe canalostomy procedure which allows local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice through the semicircular canal with minimum damage to hearing and vestibular function. This method can be used to inoculate viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse inner ear.

성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

유전학

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

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The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

신경과학

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

의학

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small, easy-to-handle New World monkey which has a similar anatomy of the temporal bone, including the middle ear ossicular chains and inner ear to humans, than in comparison with that of rodents. Here, we report a reproducible, safe, and rational surgical approach to the cochlear round window niche for the drug delivery to the inner ear of the common marmoset. We adopted posterior tympanotomy, a procedure used clinically in human surgery, to avoid manipulation of the tympanic membrane that may cause conductive hearing loss. This surgical procedure did not lead to any significant hearing loss. This approach was possible due to the large bulla structure of the common marmoset, although the lateral semicircular canal and vertical portion of the facial nerve should be carefully considered. This surgical method allows us to perform the safe and accurate administration of drugs without hearing loss, which is of great importance in obtaining pre-clinical proof of concept for translational research.

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

We report a surgical method to administrate drugs to the inner ear of a non-human primate, the common marmoset (Callithrix jacchus), via the round window membrane.

비 인간 영장류 일반 비단 (Callithrix jacchus)에서 내가 의약품의 관리에 대 한 수술

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

마우스 내부 귀를 대상으로 약물 전달 방법의 비교 연구 : Bullostomy<em&gt; 대</em&gt; Transtympanic 주입

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법

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