Name: induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

참고 : 모든 실험 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인을 준수, 오타와의 동물 관리 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 수술 전 준비 및 재료 <ol><li> 플라스미드 준비 : <ol><li> 제조업체의 프로토콜에 따라 키아 MegaPrep를 사용하여 플라스미드를 준비합니다. 높은 DNA 수율을 보장하고 밤새 품어 변형 박테리아 LB 배지의 적어도 400 ml에 Innoculate. </li><li> 적어도 5 ㎍ / μL 최종 농도 100-200 μL에 재현 탁 TE 플라스미드. -20 ° C에서 나누어지는 DNA를 저장. 농도가 너무 낮 으면, 석출되지 않고 불순물이 추가로 재현 탁. 새로운 준비를 시작. </li><li> 수술하기 전에, 0.1 % 희석 플라스미드 용액 10 또는 20 μL 당 (w / v)의 빠른 그린 염료의 1 μL에 멸균 물에 2 ㎍ / μL에 하나의 플라스미드 (예를 들어 Cre 호텔 - GFP)을 희석. GFP 경우GFP로​​ 표시된 모든 셀 모두 - 일렉트로 공동되는 가능성을 최대화하기 위해 4 : 관심있는 유전자는 GFP 플라스미드 1의 비율로 목적 유전자를 운반하는 플라스미드를 주입​​, 별도의 플라스미드 상에 공동 전기 천공하여야하며 플라스미드. </li></ol></li><li> 62 ° C에서 한 단계 끌어 오기를 사용하여 표준 바늘 풀러에 - 유리 마이크로 모세관 튜브 (이하 바늘로 언급 1mm 외경)을 당깁니다. </li><li> 다음이 포함 된 수술 팩 압력솥 : 니들 홀더, 상처 견인기, 집게, 수술 가위, 바늘 가위, 스테이플러, 스테이플, 거즈, 상처 커버, 수술 용 드레이프 (그림 1A, B, 재료 표). </li><li> 다른 필요한 도구를 수집 : Electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ~ 7 mm)를, 식염수, 봉합, 5 ML의 주사기 (자료 표). </li></ol> 2. 수술을 위해 마우스를 준비 <ol><li> 통증 관리를 위해 타임-P를 주입일시간 수술 전 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)에 우세한 마우스. E17.5에 배아 일 12.5 (E12.5)에서 아무 곳이나 초과 마우스에이 프로토콜을 적용합니다. </li><li> 백로드하는 microloader 피펫 팁을 사용하여 플라스미드 솔루션 바늘을 뽑아. 이 바늘이 막힐하는 원인이됩니다 아직 바늘의 끝으로 모든 방법을 기입하지 마십시오. </li><li> 1 L / 분 O 2 2-5% 이소 플루 란 가스를 사용하여 마우스를 마취시키다. 일단 움직이지, 얼굴에 마스크를 취하게하고 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 1 ml의 생리 식염수 다시 (0.9 % 염화나트륨) 피하에 주입한다. 참고 : 이소 플루 란 가스로 작업 할 경우, 초과 가스를 탈환하고 방으로 탈출을 방지하기 위해 가스 제거제를 사용합니다. </li><li> 복부를 면도. , Chlorohexadine 스크럽으로 복부를 씻어 물로 씻어 및 chlorohexadine 및 70 % 에탄올의 최종 준비 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 멸균 드레이프 또는 거즈 커버 마우스 모피를 포함하지만 복부 노출 (그림 1C, D)을두고있다. </li></ol>자궁 전기 천공 법 (electroporation)에서 <ol><li> 낮은 유두 사이의 복부를 통해 피부에 절개를합니다. 결합 조직을 찢어서 멀리 하부 근육층으로부터 피부를 당겨, 다음 백선 알바 따라 복강 복막 통해 잘라. 떨어져 상처의 가장자리를 당겨 상처 견인기를 삽입합니다. </li><li> 복강에서 자궁을 제거하고 그림 (그림 1E)로 배치. <ol><li> 다른 새끼 (예 관심 유전자 GFP 대 GFP와 같은) 다른 플라스미드를 주입 할 경우, 각 측면에 새끼를 카운트하고 각 플라스미드 얼마나를 주입하는 것을 결정하고. 다시 따뜻한 윤활 배아를 유지하기 위해 복부에 자궁의 한쪽을 교체합니다. 즉시 식염수 노출 자궁 (바람직하게는, 체온으로 가온)을 적시고. </li><li> 같은 플라스미드 모든 새끼를 주입하면 ONL (예 : 유전자 변형 배아에 Cre 호텔 - GFP를 주입 할 때 등)Y는 한 번에 자궁의 하나의 뿔을 제거합니다. </li></ol></li><li> 작은 수술 가위 또는 미세 집게 한 쌍의 끝을 잘라 조심스럽게 주입 지팡이의 손잡이 머리에로드 된 바늘을 넣고. 여전히 유체 (그림 1Ji-IV)를 통과 할 수 있도록하는 동안 바늘만큼 가능한 한 유지되도록 끝을 잘라. <ol><li> 풋 패드 누를 때 0.1-0.2 μL의 작지만 쉽게 볼 액 적이 바늘의 팁에 나타나도록 마이크로 인젝터에서 (초)의 주사 길이와 분사 압력을 조정한다. 다른 바늘 사이에 최대한의 일관성이 방울의 볼륨을 유지합니다. 참고 :이 단계는 배아의 생존 (설명 참조) 매우 중요하다. </li><li> Femtojet에 대해 다음 주입 매개 변수를 사용하여 압력을 주입 (PI) = 250 ~ 300 헥토 파스칼; 주입 시간 (TI) = 0.8 ~ 1.2 초; 보상 압력 = 10 ~ 50 헥토 파스칼. 필요한 경우, 바늘 사이의 변화를 수용하기 위해 이러한 매개 변수를 조정합니다. </li></ol></li><li> 에스배아을 선출하고 부드럽게 다시 위쪽으로 기울어 진 머리 (그림 1 층)에 위치. 참고 :이 켜거나 배아를 이동해야 할 수 있습니다; 너무 많은 압력을 적용하고 배아를 조작하는 동안 양막의 파열을 방지하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아가 작성되면, 시상 동에 초승달 모양의 그림자 병렬로 제시 뇌실을 찾습니다. 약간의 각도에서 심실 위의 자궁에 바늘의 끝 부분을 터치하고 자궁 벽을 통해 바늘을 안내합니다. 설정 압력의 크기는 바늘의 선명도에 의존한다. 뇌실에 피질을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 참고 : 거의 모든 추가 검출 저항 없지만 태아의 머리는 종종 약간 멀리 밀려 후 바늘이 뇌실 내로 통과 피질로 젖혀. </li><li> 플라스미드 솔루션을 주입하기 위해 발 패들 펌프. 녹색 영역이 표시되고 준수 될 때까지 펌프 계속뇌실 (그림 1G)의 아크 모양. 젊은 배아 (E14.5에 E12.5)에서 염료는 종종 반대편 심실로 확산됩니다. 주 : 펌프 수가 바늘 끝의 직경에 따라, 태아 (및 결과적인 심실의 크기)과 원하는 주입량의 연령. 볼륨을 유지하는 것은 배아 사이에 가능한 한 일치 주입. </li><li> 서너 배아를 주입한다. 절차를 통해 식염수와 습기 노출 된 배아를 유지합니다. </li><li> 다시 주입 된 최초의 배아로 이동하고 양극은 뇌 (그림 1H)의 원하는 영역에 플라스미드를 그릴 것 같은 패를 놓습니다. 각도가되도록 음극 전극 사이의 최단 경로는 전기를 대상으로 구조 (도 2)를 통해 직접 통과한다. </li><li> 패 자리에되면, 충격을. 배아의 나이와 크기에 따라 35 ~ 50 V의 5 펄스를 사용 (T 참조수 1). 전기 천공 다음 파라미터를 사용하여 5 msec의 펄스의 길이를 950 밀리 초 펄스 간격으로. 모든 주입 배아와 반복합니다. </li><li> 마지막 바늘 가능성이 건조 단계 3.9 동안 막힘 등의 단계 3.3에서와 같이 새로운 사전로드 된 바늘의 끝을 잘라. 같은 플라스미드 또는 다른 플라스미드 중 세 가지 또는 네 개의 배아의 다음 세트를 주입 한 후 단계 3.9에서와 같이 충격을. 자궁의 한쪽에있는 모든 새끼가 주입 될 때, 여성의 복부에서 자궁의 두 번째면을 제거하고 따뜻하게 유지하기 위해 완성 된면을 교체합니다. </li><li> 양수 주머니에 외상을 방지하기 위해 너무 많은 압력을 적용 식염수가 아닌 촉촉한 표면을 유지하기 위해주의하면서 여성에게 자궁의 양쪽 모두를 돌려줍니다. 단순한 연속하여 스티치를 폐쇄 근육층 봉합사. 스테이플 피부가 닫힙니다. 스테이플을 사용할 수없는 경우, 간단한 인터럽트 스티치 피부를 봉합. (그림 1I) </li><li> suturi 동안NG, 점진적으로 임신 여성의 마취 밝게 할 수 있도록 이소 플루 란을 줄이십시오. 주 : 수술이 완료되면이 댐의 각성을 촉진한다; 배아 생존율을 향상 가능한 한 짧은 시간 동안 마취를 유지 여성. 총 수술 시간, 여성이 먼저 마취 때부터 시작하여, 약 30 분이어야한다. </li></ol> 4. 애프터 케어 <ol><li> 인큐베이터 또는 마취에서 회복하기 위해 가열 패드에 봉합 여성을 놓습니다. 깨끗한 침대에 그녀를 침대와 케이지의 표준 복구 젤은 수분을 유지 놓습니다. 다음 수술 통증 관리를 들어, 수술 후 8 시간 간격으로, 12 시간 간격으로 네 개의 추가 용량으로 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)의 투여 량 세 여성을 준다. </li></ol> 5. 수확 두뇌 참고 : 두뇌는 성인에 대한 연령까지 수확 할 수있다. 다음이 적용됩니다이전에 출생 두뇌를 수집합니다. 새끼가 태어난 후, 자궁 내 순서는 쓰레기의 모든 강아지 중 하나가 같은 플라스미드를 주입​​해야하므로, 분실, 또는 제어 및 실험 동물을 구별하는 다른 방법이 고안되어야합니다. <ol><li> 감기 (4 ° C에서)를 준비, 여성 안락사 이전에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 필터링. </li><li> 펜 토바 비탈 나트륨 (100mg / kg 체중)의 치사량의 복강 내 주사를 사용하여 여성을 안락사 개방 복부 잘라. 자궁의 양쪽을 잡아 당겨 새끼가 초기에 주입 된 경우와 같이 배치. <ol><li> 모든 새끼는 트랜스 제닉 깔짚 Cre 호텔로 주입 할 때와 같은 플라스미드를받은 경우, 배아 순서에 따라서 PBS 여성 및 여길 자궁 잘라, 중요하지 않다. </li><li> 강아지가 다른 플라스미드를 주입​​ 한 경우, 죽은 새끼를 지적, 각각의 강아지를 찾을 수 있는지, 그리고 제어 및 experimen 주입 된 것 확인여성에서 자궁을 제거하기 전에 탈 플라스미드. 강아지가 자궁 PBS에있는 그룹 후에 속한 추적주의하십시오. </li></ol></li><li> 개별적으로 각각의 강아지를 제거 날카로운 가위 또는 면도날로 목을 베다와 PBS에 머리를 배치합니다. 트랜스 제닉 마우스의 경우, 유전자형 분석을위한 조직 샘플을 수집 및 12 웰 플레이트와 같이, 각 개별 헤드를 유지한다. </li><li> 해부 범위에서 닉에주의하면서 두개골에서 피질 뇌를 제거하거나 중간 선을 찢어. 형광 현미경을 사용하여 성공적 전기 천공 된 것을 나타내는 뇌가 GFP + 패치가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 PFA에 침수로써의 머리를 고정합니다. 참고 : PFA는 종종 신호를 소멸하기 때문에 이전의 고정에 GFP의 발현을위한 두뇌를 확인합니다. </li><li> 이전 동결에 적어도 3 일 동안 20 % 자당의 침수를 통해 Cryoprotect 두뇌. t 자당 ​​10 %의 구배, 15 % 및 20 % (각 솔루션에 24 시간)을 사용하여O 삼투압으로 인한 조직 손상을 방지한다. -80 ° C에서 냉동 두뇌를 저장하고 10 ~ 14 μm의 두께 부분에서 저온 유지 장치에 잘라. </li></ol> 안티 GFP 6. 공동 염색 주 : 항원 검색 공동 얼룩 방지와 GFP를 위해 필요한 경우에는 GFP 신호를 손상시키지 않는 부드러운 항원 검색 프로토콜을 사용하는 것이 중요하다. 일부 항원 검색 프로토콜 (심지어 GFP에 대한 항체를 사용) GFP 염색과 함께 사용하기에 너무 가혹. 선행 차 항체의 적용에 염기성 시트르산 전처리 가장 에피토프 24 성공적이다. <ol><li> DDH 2 O. 시트르산 0.01 M 용액을 제조 보정 된 pH 미터를 사용하여 pH 6. </li><li> 구연산 산까지 전자 레인지 또는 물을 욕조에 염색 실에서 열 구연산은 75 ~ 80 ° C를 도달한다. 10 ~ 15 분 동안 염색 실에 슬라이드를 넣습니다. 가능한 한 안정적으로 온도를 유지한다. </li><li> PBS에서 슬라이드를 씻으3X 실온에서 3 분. 차 항체를 적용하고 표준 프로토콜에 따라 면역 염색 진행합니다. </li><li> (그림 3A)를 허물고 확인 GFP를위한 공동 라벨링 및 관심의 유전자에 의해 Cre 호텔 매개 절제의 유효성을 검사합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

자궁의 electroporations에서 수행의 기본 과제의 두 배 치사 및 2) electroporations 사이의 변동성을 감소 방지) 일 수 있습니다. 무딘 바늘 배아에 더 손상을 입힌다으로 사멸을 방지하는 가장 중요한 요소 중 하나는, 바늘 품질이다. 바늘을 절단 할 때에는 여전히 발 패들 (그림 1J)의 펌프 다음 나타나는 유체의 0.1 ~ 0.2 μL의 볼 방울을 허용하면서, 가능한 한 오랫동안 팁을 유지. 바늘이...

레이디 얼 이주 초기 대뇌 피질의 개발에 중심 과정이다. 여기에는 올바른 유사 분열 출구 및 신경 분화, 세포 극성 골격 역학과 막 관통 수용체의 발현의 조절뿐만 아니라 반경 폐해 지지체의 형성과 같은 비 세포 자율 요소와 같은 셀 자율 다양한 요인에 의존 철새지도의 분비 1-3 분자. 이러한 메커니즘의 임의의 중단 때문에 복잡하고 어려운 과정이 될 수있는 이주에서의 결함의 근본 원인을 판정하는, 트랜스 제닉 마우스 모델 4-8 신경 마이그레이션을 방해 할 수있다. 자궁 전기 (IUE) 보체 간소화하는데 사용될 수있다 이에 따라 유전자 녹아웃 모델의 표현형과의 해석은 반경 마이그레이션 7,9-11에 필요한 중요한 메커니즘을 해명. 자궁 내에서 전기 천공 (IUE)가 프로세스되는 플라스미드에 의해 carryi<html> 관심의 유전자와 기자 모두 ng를하는 것은 마우스 나 쥐 태아의 뇌의 뇌실에 주입 한 후 전류 12 ~ 14의 사용을 통해 심실을 안감 세포로 그려집니다. 이 연구자가 또는 개발 또는 electroporation하여 신경 세포의 기능에 대한 관심이 유전자의 규제 아래의 효과를 분석 할 수 있습니다. IUE 다음, 두뇌는 면역 조직 화학 7,9-11, 전기 생리학 (15) 또는 세포 배양 (16, 17)에 대해 처리 할 수 있습니다. IUE의 주요 이점은 유전자 발현이 고도로 특이 조작 할 수있게된다. 또한, IUE는 지시 전류 (그림 2)을 통해 개발 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. IUE 또한 다양한 프로모터 플라스미드 또는 활성화 시스템의 제어하에 유전자를 운반하는 플라스미드의 주입을 통해 특정 세포 타입을 표적하는 데 사용할 수 10,18-21 (테트라 사이클린 유도 유전자 발현은 예이다). &gt; IUE가 치운다 훈제 연어 매개 유전자 절제 시스템 7-9,11,22와 함께 사용될 수있다 jove_content는 &quot;. Cre 호텔 단백질의 메시지를 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 floxed 대립 유전자 배아 동형 접합체 (에 electroporation 수 하는 유전자 또는 특정 DNA 영역은 Cre 호텔 중재 DNA 재조합에 대한 두 가지에 loxP 사이트)에 의해 측면에 있습니다. Cre 호텔은 다음 구체적으로 electroporation하여 신경 전구체에 대한 관심의 유전자의 재조합을 유도 할 것이다,의 floxed allele.The 효과를 노크 아웃을 생성 신경 영동 개별 뉴런 내 개발 단백질 분해 후 연구 될 수있다. Cre 호텔의 일렉트로 그대로지지 환경을 떠나는 영향 세포의 작은 집단에서 재조합을 유도한다. 반대로, 특정 세포 유형의 제어하에 Cre 호텔의 조직 특이 적 발현 프로모터, 조직 전체에 걸쳐 발생 모두 마이그레이션 neuroblasts 및 주변 환경의 영향을받을 수있다. 따라서, 그렇게 jux이 두 가지 방법의 taposition은 주어진 마이그레이션 결함이 자율적 또는 셀이 아닌 자율적 인 메커니즘을 세포에 의한인지 여부를 확인 할 수 있습니다. 두 실험 시스템의 결함 마이그레이션이 제안 셀 자치기구에서 관찰 된 표현형 결과 그; 조직 특이 Cre 호텔 모델에서 결함이 이주 Cre 호텔의 전기 다음 정상 마이그레이션은 관심의 유전자가 아닌 세포 자율 메커니즘을 통해 작동하고 있음을 나타냅니다. 또한 IUE 녹아웃 동물 7,9,10 전위에 작용하는 유전자를 구조 electroporating하여 실험을 수행하는 데 사용될 수있다. 예를 들어, 연구자는 다운 스트림 대상을 electroporating 및 마이그레이션 결함이 일렉트릭 뉴런에서 해결 여부를 결정하여 형질 전환 모델의 마이그레이션 표현형을 구출하려고 시도 할 수 있습니다. 이것은 성공적인 구조 정상적인 마이그레이션 SPE에서 단백질 발현을 조작함으로써 복원 될 수 있음을 나타낸다 추가적인 이점을 갖는다cific 뉴런, 주위 환경​​이 여전히 표적 유전자 결핍에도. 다시,이 방법은 더 많은 시간과 불량 메커니즘 자율 셀인지 여부를 판단하는 추가적인 이점과 함께, 트랜스 제닉 라인들을 교차하거나 발생보다 비용 효과적이다. IUE는 노크 배아 (그림 4C)에 리포터 플라스미드의 전기를 통해 신경 세포 마이그레이션을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 수술시 심실 안감에만 뉴런 17 일렉트로됨에 IUE는 생체 내에서, 형태의 시각화 이점과 특정 시간에 태어난 뉴런을 수행하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 이러한 내측 등쪽 telencephalon, 해마 신경절 또는 융기 (도 2)와 같은 뇌 영역을 대상 IUE를 사용하는 것이 가능하다. 이는 연구자에게 합병증 결과 특정 영역에서 독립적 유전자 기능을 연구 할 수있는 능력을 준다이웃 구조에서 단백질 분해에서 보내고. 망막 모세포종 단백질 (pRb와는), P107과 P130은 포켓 단백질 가족을 포함하고 잘 세포주기 출구의 규제를 설정됩니다. 그러나, 이들 단백질은 또한 신경 발달의 세포주기 독립적 양태를 조절한다는 증거가 증가하고있다. 우리는 앞에서 설명한 것처럼, pRb와 및 P107은 모두 접선 4,23 및 방사형 마이그레이션 6에 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 유전자 변형 모델에 Cre 호텔의 자궁 전기에서의 사용을 예시하는 신경 마이그레이션 6 포켓 단백질 가족 PRB 할당과 P107의 역할을 보여줍니다. 요약하면, IUE 유전자 삭제 (또는 과발현)의 셀 자치 효과를 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 모델을 노크 특정 조직과 함께 사용하면 IUE 신경 마이그레이션을 제어 메커니즘에 관한 추가 정보를 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>Electroporator only &amp;ndash; buy cables separately (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Footswitch for ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td>Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td></tr><tr><td>Tweezertrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>Platinum forcep style electrodes</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Holds the pulled needle</td></tr><tr><td>Universal Capillary Holder</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Connects griphead to tube</td></tr><tr><td>Injection Tube</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Connects capillary holder to Femtojet</td></tr><tr><td>Foot Control</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Foot paddle for hands-free injection</td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Tips for loading the pulled capillary tubes</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Non-toxic dye</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>For trimming the needles</td></tr><tr><td>Bonn Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Colibri Retractors</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Stapler</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>For 7mm clips</td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder</td><td>Medical Tools</td><td>SNH-6737</td><td>Straight, with lock</td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>For pulling microcappillaries</td></tr><tr><td>Microcapillaries</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td></tr></tbody></table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

트랜스 제닉 마우스 라인 치운다 된 LOX 시스템을 사용하여 유전자 결실은 단백질의 기능을 연구하는데 사용되는 강력한 툴이다. 그러나, 매우 구체적인 Cre 호텔 모델을 제외하고, 조직 또는 세포 인구에 걸쳐 단백질의 삭제는 종종 여러 상호 작용 메커니즘에 의한 복잡한 표현형에 연결됩니다. 문제, 또는 해당 셀의 환경 손상으로부터 초래 비 자율기구 셀로부터 셀로의 극한이다 자율 셀기구의 파괴로부터 표현형 결과를 분별하기 어려운 될 수 있는지 여부를 결정하는 단계. 자궁 전기에서, 생체 맥락에서 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻으려면 (IUE)가 개발 피질 또는 다른 선택 뇌 영역 내 세포의 작은 하위 집합 유전자 삭제를 할 수 있습니다. IUE는 지느러미 telencephalon, 중간 telencephalon, 해마, 또는 신경절 예하을 포함한 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. 이 관찰 O를 용이하게건강한 환경의 컨텍스트에서 자율적 셀 유전자 결실의 결과 F. 이 프로토콜의 목적은 IUE 단백질 결실 셀 자율 및 비 - 셀 자율 효과 구별 중시, floxed 트랜스 제닉 마우스 선에서 방사상 이동의 결함을 분석하는 방법을 보여주는 것이다. 뇌 발달에 단백질 기능에 한정된 세포 집단에서 IUE 매개 유전자 결실 대 전체 피질 내의 유전자 결실로 인한 표현형,보다 정밀한 분리하여 비교함으로써 어느 기술을 이용하여보다 더 얻을 수있다.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

단백질 삭제의 유도를 통해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.2K 조회수.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

비디오: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

발생학

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

단백질 삭제의 유도를 통해

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터