이 작품은 BMBF Forschungsinitiative에 의해 지원되었다 &quot;BioEnergie 2021 - Forschung 모피 Nutzung 폰 Biomasse 다이&quot;과학을 촉진하기 위해 독일 연방 정부 및 주 정부의 우수 이니셔티브 재정 지원을 통해 우수 &quot;바이오 매스에서 맞춤형 연료&quot;의 클러스터 독일 대학의 연구.

야생형 N.의 tabacum 식물 1. 성장 <ol><li> N. 성장 tabacum L. 이력서. 토양에 쁘띠 하바나 SR1 식물, 발아 일반 화분 용 흙으로 가득 적절한 냄비에 담배 씨앗을 배치합니다. 이주 후, 각각의 화분에 모종을 전송합니다. 상수 22 ° C (어두운 기간) 또는 25 ° C (빛 기간)과 온실에서 식물과 70 %의 상대 습도를 품어. 8분의 16 시간 빛 / 어둠주기에 조명을 제공합니다 (예 : 필립스 IP65 400 W 램프, 180 μmol · 초 -1 · m -2, λ = 400 ~ 700 nm의) 매일 물. </li></ol> TrCel5A 및 TrCel5A - mCherry 단백질의 2. 일시적 발현 <ol><li> 멸균 조건에서 Agarobacterium 튜메 파시 엔스의 단일 콜로니 (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) pTRAkc-ER-TrCel5A 또는 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry 10 ㎖의 효모 추출물을 함유하는 삼각 플라스크로 전송 중 하나를 포함을 선택선택을위한 국물 (YEB, 제조업체의 사양에 따라 준비) 중간 및 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖), 리팜피신 (50 ㎎ / ㎖) 및 카르 베니 실린 (100 ㎎ / ㎖). 26 ° C에서 36 ~ 40 시간, 180 rpm으로 배양한다. 참고 : 단백질 발현에 적합한 구조의 디자인은이 글의 범위를 벗어나지 만, 지침, 맥클레인 등 13 먼로와 Pellham (14)의 방법은 구조 설계에 따라 할 수있다.. </li><li> 위에서 언급 한 항생제 농도 YEB 20 ㎖를 접종하고 이전과 같은 조건에서 배양 각 문화의 200 μl를 가져 가라. </li><li> 36-40 시간 후, 2 μL의 acetosyringon (200 μM 최종 농도), 100 ㎕의 40 % (w / v)의 포도당 용액 1 M MES 버퍼 산도 5.6의 200 μL.을 추가하여 문화를 preinduce 밤새 품어. </li><li> 배 침투 버퍼 (100g / L의 자당, 3.6 g / L의 포도당, 8.6 g / L 무라 시게와 스쿡 기초 염 100 ㎖를 준비,)의 수산화 칼륨을 사용하여 pH를 5.6로 조정합니다. </li><li> 이 OD 5-6의 (600)에 도달 할 때까지 1시 5분 희석와 문화의 OD 600을 측정합니다. OD 600에서 30 ㎖의 침투 매체에 필요한 문화의 볼륨을 계산합니다. 배 침투 버퍼의 15 ML을 추가하고 30 ㎖까지 버퍼를 만들기 위해 탈 H 2 O를 추가합니다. </li><li> 온실에서 식물을 타고 침투를 용이하게하기 위해 정상에서 5 번째 잎에 닉에 제 3의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투를 용이하게하기 위해 대화명에 잎의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투 매체와 주사기를 입력하고 이전에 만든 닉 중 하나에 (바늘없이)에 넣어. 향축 잎면에 손가락으로 주사기를 지원합니다. interveinal 잎 영역의 조직으로주의 깊게 매체를 누릅니다. 참고 : 침윤 후, 상술 한 바와 동일한 조건 하에서 식물을 온실에서 재배. 또한, untr의 동일한 비율을 유지침투 식물과 같은 조건에서 컨트롤로들 어갈, 비 일시적 발현 식물 (NTEPs). </li></ol> 식물 잎의 TrCel5A - mCherry 식 3. 평가 <ol><li> 4-6일 후, A. 침투와 식물을 온실에서 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry을 포함하는 형광 분석을위한 어두운 방에 배치 튜메 파시 엔스. </li><li> 빨간색 필터 (620-750 nm의)와 515 nm에서 녹색 빛을 방출 휴대용 광원을 사용 TrCel5A - mCherry, 빛 식물을 표현 잎 부분에서 형광을 시각화합니다. 참고 : 깊이에서 식물의 잎에서 단백질 발현의 특성은 빛과 형광 현미경 아래 vibratome 및 검사에 얇은 절편 잎에 의해 달성 될 수있다. 이를 위해 아래의 단계를 따릅니다 : <ol><li> 침투 잎에서 약 5 × 5 ㎜ 크기의 작은 부분을 잘라 아가로 오스 50 mM의 인산염 완충액 (pH 5.7)에 녹인 4 %에이를 포함 할 수 있습니다. </li><li> 절단vibratome를 사용하여 임베디드 잎에서 80 ~ 90 ㎛의 크기의 섹션. 버퍼 또는 커버 슬립 커버와 상기 한 바와 같은 파장 필터를 사용하여 형광 검출기로 10 배 배율의 현미경을 사용하여 검사, 현미경 슬라이드에 배치합니다. </li></ol></li></ol> 담배 잎에서 4. TrCel5A 추출 <ol><li> A. 감염된 식물에서 1g의 대략적인 무게에 담배 잎에서 조각을 잘라 pTRAkc-ER-TrCel5A 및 액체 질소로 미리 냉각 박격포 위치를 포함하는 튜메 파시 엔스. 샘플에 액체 질소의 적절한 금액을 추가합니다. 갈기는 예비 냉각 유를 사용하여 분말로 떠난다. </li><li> 지상 잎 물질에 1mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 추가하고 잎 물질의 대부분은 현탁액이 될 때까지 혼합한다. 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 단백질 함유 상층 액을 원심 분리기 추출물. </li><li> 원심FUGE 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 추출하고 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 단백질 함유 상층 액을. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 부분적으로 10 분 동안 55 ° C에서 단백질 함유 상층 액을 배양하여 TrCel5A을 정화. RT에서 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 한 후, 추가로 실온에서 10 분 동안 휴식을 허용한다. 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물에 대한 부분 정제 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물의 부분적인 정화 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅 및 TrCel5A - mCherry &lt;의 아조-CMC Zymography/ P&gt; <ol><li> 구매 또는 설치 방법 15에 따라 (W / V) SDS-PAGE 젤 12 %를 준비합니다. </li><li> 1.5 % (w / v) 용액을 수득 물에 녹여 CMC. CMC-SDS-PAGE 젤을 만들려면 (w / v) CMC + 12 % (W / V 0.1 %의 결과로, 10 ㎖ SDS-PAGE 젤 혼합 용액에 물 1 ㎖에 1.5 % CMC 1 ㎖를 대체 ) SDS-PAGE 젤 혼합. 일반적으로 젤을 붓는다. 주 : (직접 사전 겔 용액을 제조하는 과정을 반복) 기존의 해결에서 CMC가 완전히 40 ° C로 교반 및 가열의 조합에 의해 용해되는 것을 확신합니다. </li><li> 설치 방법 (12)에 따라, SDS의 존재에 끓여 샘플을 변성. 양성 대조군으로서, T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 1:500 희석을 사용 이러한 T.로 reesei, reesei ATCC 26921. 음성 대조군으로 비 침투 잎 (NTEPs)에서 유사하게 제조 단백질 용액을 사용합니다. </li><li> 일반 프로토콜 15에 따라 전기 영동을 수행,염료 전면 겔의 하단에 도달하면 예를 들면 정지 전기로 50 분 ~ 200 V를 사용합니다. </li><li> 0.1 %를 사용한 한 SDS-PAGE 겔을 염색 (w / v) 쿠마시 브릴리언트 블루 및 메탄올 / 빙초산 혼합물을 사용한 destain. 참고 : 빠른 염색과 destaining 부드럽게 염색을 가열하고 10 분 후 destaining 솔루션을 변경, 따뜻하게 (그러나 비등) 먼저 염색을하고 destaining 솔루션 15 초 ~를위한 전자 레인지를 사용하여 즉, 솔루션을 destaining하여 수행 할 수 있습니다 또는 냉각하고, 새로운 destaining 용액으로 반복하면. </li><li> 설립 프로토콜 (16, 17)를 사용하여 하나의 SDS-PAGE 젤 웨스턴 블로 팅을 수행합니다. (보조), 알칼리 인산 분해 효소에 접합 된 그의 태그 (주) 및 폴리 클로 날 염소 항 - 토끼 항체 Fc 영역에 대한 다 클론 토끼 항체 : 다음과 같은 항체를 사용합니다. 참고 : 2 차 항체는 nitroblue의 테트라를 사용하여 시각화를 가능하게 선택해야윰 chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;- indolyphosphate의 P-톨루이딘 소금 (NBT / BCIP), 18 설명한대로. </li><li> 0.15 %에 접힘에 젤 단백질 (W / V) 실온에서 β-사이클로 덱스트린, 20 mM의 인산 구연산 버퍼, 산도 6.5, 1.5 %에 젤을 배양하여 (w / v) CMC SDS-PAGE 젤을 수행 부드러운 15 분 19 진탕. </li><li> β-사이클로 덱스트린 솔루션을 취소하고 잠시 H 2 O와 젤을 씻어 추가로 15 분 동안 50mM의 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에서 RT에서 배양한다. 50 ℃에서 20 분 동안 30 mM의 아세트산 나트륨 완충액 pH를 4.8에서 젤을 배양하여 접힘 0.15 % CMC SDS-PAGE 젤을 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> (w / v) CMC SDS-PAGE 겔 50 ℃에서 20 분 동안 30 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에 젤을 배양하여 접힘 0.15 %를 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> 0.1 %를 사용하여 10 분 동안 젤을 얼룩 W / 30 분 콩고 레드 솔루션 destain V 또는 명확한 밴드가 1 M 나를 사용하여 관찰 될 때까지CL. 선명한 영상을위한 0.3 % (V / V) 아세트산 젤을 씻으십시오. </li></ol> TrCel5A 6. 4 MUC 활동 분석 <ol><li> 50 %에서 10 mM의 4-MUC (v / v) 메탄올의 스톡 용액을 준비하고, 그것을 실온에서 어두운 곳에서 보관 </li><li> 직전에 분석을, 4-MUC 배 일 1 ㎜ 4-MUC로 구성된 솔루션, 60 MM의 아세트산 나트륨, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> (inducibly 표현 또는 TrCel5A없이) 잎 단백질의 100 μL, T. 100 ㎕를 시판 셀룰라아제의 혼합물을 포함하는 샘플에서이 테스트를 수행 reesei의 1:1,000, 및 순수한 H 2 O였다. 세중의 각 샘플을 실행합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 4 MUC 작업 솔루션의 피펫 100 μL는, 각 샘플의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통해 4-MU 형광 0 분 평가시기를 결정한다. </li><li> 20 접시를 품어50 ° C에서 분, 증발을 방지하기 위해 접착제 뚜껑으로 덮여있다. 냉동 (또는 ㎕의 0.15 M 글리신, pH가 10.0, 별도의 플레이트에 샘플 100 μl를 (100)를 결합하여)에 의해 반응을 중지합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통한 4-MU 형광의 종점을 결정한다. 형광 값의 변화를 얻기 위해 엔드 포인트 (20 분) 평가시기에서 0 분을 뺍니다. </li></ol> TrCel5A 7. 아조-카르복시 메틸 셀룰로오스 활동 분석 <ol><li> 1.5 %의 재고를 준비 (w / v) RT에서 저장되고, 아조 - CMC 18 mM의 아연 아세테이트, 0.5 M 아세트산 나트륨, pH를 5 ~ 80 % 에탄올 (v / v), 룸에서 상점을 함유 침전 용액 온도. </li><li> 직전에 분석에 1 %로 구성 아조-CMC 배 작업 솔루션, (W / V) 아조-CMC (H 2 O의)와 60 mM의 나트륨 아세테이트, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> 샘플의 50 μL와 작품의 50 μl를 결합1.5 ML 튜브에 용액을 주입. </li><li> (일시적으로 표현하거나 TrCel5A없이) 잎 단백질의 50 μl를 포함하는 테스트 샘플; T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 100 μL reesei는 1:1,000 희석; 순수한 H 2 O 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 품어 침전 용액 250 μl를 첨가하여 반응을 정지. 소용돌이 적극적으로 10 초 동안 각각의 샘플 솔루션이 완전히 결합 된 보장합니다. </li><li> 다시 10 분 후 소용돌이 RT에서 샘플을 품어. 10 분 1,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 96 - 웰 플레이트에 각 시료의 상층 액 200 μl를 제거합니다. </li><li> 590 ㎚의 파장에서 흡수 분광법을 이용하여 분석. </li></ol> TrCel5A 8. PAHBAH 분석 <ol><li> 여과지의 원형 (~ 5.5 mm 직경)을 잘라 구멍 펀치를 사용합니다. 100 ㎕의 60 mM의 NaAc, 산도 4.8, 1 추가샘플 (inducibly 표현하거나 TrCel5A없이) 잎의 단백질을 포함하는 하나 또는 상업적 T. 00 μL reesei 셀룰라아제 혼합물, 1:1,000 희석하고, 300 rpm으로 흔들어으로 50 ° C에서 20 시간 동안 필터 종이 서클 품어. 종이 필터와 함께 배양 각 샘플의 경우, 개별 샘플 - 컨트롤과 같은 종이 필터없이 중복 솔루션을 품어. </li><li> RT에서 5 100 ㎖의 용액의 총 염산 집중 ML 및 저장소의 추가와 H 2 O에 PAHBAH을 용해하여 330 밀리미터 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 지드 (PAHBAH) 솔루션을 준비합니다. 참고 : 최상의 결과를 H 2 O 100 ml의 볼륨을하기 전에 해산을하는 데 도움이 온도에서 교반 PAHBAH 슬러리, 즉 30 ㎖의 작은 부피에 염산을 추가하여 달성된다 </li><li> RT에서 50 mM의 시트르산 나트륨, 10mM의 염화칼슘 및 500 mM의 수산화 나트륨 및 판매자를 함유 PAHBAH 용액 B를 준비한다. </li><li> IMMEDiately 전에 분석에 사용할 때까지 (4 시간 내에서 사용되는) 얼음에 10 ㎖의 완충 용액, 상점에 1 ㎖의 PAHBAH 시약의 1.5 배의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 내열성 0.2 또는 0.5 ML 튜브에 샘플을 준비합니다. 종이 필터 (단계 8.1) H 2 O 45 μL와 PAHBAH 작업 용액 100 μL와 함께 배양 각 솔루션의 5 μL를 결합합니다. 샘플 컨트롤 (종이 필터없이 배양하는 샘플)는 같은 농도 (5 ㎕의 샘플, 45 μL의 H 2 O, 100 μL의 PAHBAH 작업 용액)에서 실행해야합니다. 또한 0과 포도당 0.2 g / L를 포함하는 5 기준 (5 μL), 순수한 H 2 O를 테스트 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 100 ° C에서 정확히 10 분 동안 샘플을 품어 후 정확히 10 분 동안 실온에서 냉각. 410 nm의 파장에서 96 웰 플레이트와 분석 광학적 피펫 솔루션을 제공합니다. 최종 얻기 위해 샘플에서 (종이 필터없이 배양) 개별 샘플 컨트롤을 빼기값. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 (20)에게<...

<html> 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 (1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 2의 용이성 및 식물 세포벽 하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 세 posttranslationally 필요한 효소를 수정할 수있다. &quot;ve_content&gt; 된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉 셀룰라아제의 번역 후 변형 동안에, 짧은 시간 기간 5에서 단백질 생산을 가능하게하는 기술이다. 또한 식물에서 더 표현 전략을위한 기반을 마련하면서는 기본적인 분석을위한 셀룰라아제 (들)의 생산을 가능하게한다. 이러한 일시적 발현 전략을 사용하여, 진균 숙주 트리코더마 reesei (Hypocrea의 jecorina)로부터 유도 된 글리코 하이드 롤라 가족 05 Cel5A, 6 endoglucanase은 (이하 TrCel5A라고 함) 제조된다. TrCel5A는 기본적으로 당화 된 42 kDa의 단백질과 유압에 매우 활성화되어셀룰로오스 사슬 7을 roylzing. 여기에 설명 된 일시적 발현 기술은 식물 아그로 박테리아는 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 운반 남긴다 침윤, 비교적 널리 사용되는 시스템에 기초한다. 란타 식 성공의 신속한 분석을 허용하기 위해 TrCel5A 또한 mCherry 원래 Discosoma SP에 유래 모노머 형광 단백질과 융합 단백질로서 발현 될 수있다. 단백질에 융합 된 추가적인 여섯 히스티딘 (그의 태그)와, 8 DsRed를 C-말단 (TrCel5A - mCherry). 이종 융합 단백질, TrCel5A - mCherry의 표현 따라서 mCherry 분산을 검토하는 녹색 빛을 사용하여 식물 성장에서 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 경우, 식물 재료의 얇은 부분은 단백질의 특정 지역화를 확립 녹색광 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 작품, 신호 전송 용앉아 펩티드는 소포체 9 이종 단백질의 수출을 집중하기 위해, 구조에 통합되었다. 셀룰라아제 활성 시험의 수가 실행될 수 TrCel5A 포함한 식물 발현 셀룰라아제의 활성을 분석한다. 전체 수용성 식물 단백질 추출 후 TrCel5A 부분적 열 배양 기술을 이용하여 정제 할 수있다. 단백질의 크기는 웨스턴 블로 팅 다음 SDS-PAGE를 사용하여 설정됩니다. 용해도 10 : (CMC 카르복시 메틸 셀룰로오스를 만드는) Zymography는 기판, 카르복시 메틸화왔다 예 셀룰로오스 대 활성을 분석하기 위해 사용될 수있다. 셀룰라아제 및 글루코시다 활동 (: 4-MUC 결합) β-D-cellobioside과 관련된 형광 물질 4 - 메틸 움 (4-MU)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. endoglucanase 활동을 평가하는 또 다른 방법은 아조-D와 연결되었습니다 CMC의 분광 분석을 포함너희 (Remazolbrilliant 블루 R) 11. 또, endoglucanases 및 셀룰라아제의 범위 모두의 단백질 활성은 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 자이드 (PAHBAH) 분석으로서 12 설탕 분석 시험의 사용에 의해 모니터링 될 수있다. 이러한 기술은 또한 표현 셀룰라아제의 활성을 규명하고 정량화 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &amp;beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon (concentrated)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - kanamycin</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - rifampicin</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - carbenicillin</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethyl cellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase from &lt;em&gt;Trichoderma reesei&lt;/em&gt; ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Congo red</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie brilliant blue G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper - Rotilabo blotting paper</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Soil, Einheitserde classic&amp;nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV light source - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.

TrCel5A 및 TrCel5A-mCherry는 일시적 발현 시스템 (도 1a 및도 1b)를 사용하여 담배 식물에서 성공적으로 발현되었다. TrCel5A - mCherry 융합 단백질의 발현 패턴의 시험은 건강한 나뭇잎 녹색 빛 (그림 1D)에서 널리 단백질 발현을 보였다 (그림 1C)를 공개했다. 총 수용성 단백질의 추출이 포함 된 잎을 가지고 담배 공장에서 수행 된 일시적 TrCel5A 단?...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.8K 조회수.  RWTH Aachen University.  담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다. 

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

환경과학

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

생화학

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

생체공학

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

화학

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

생물학

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

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