Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
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저자는이 작업을 실행하는 동안 도움이 토론의 Harata 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association), 근긴장 의학 연구 재단, 에드워드 말린 크로, 주니어 재단, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 NCH에 화이트 홀 재단의 교부금에 의해 투자되었다

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 자연과 소형 시냅스 활동을 유발하고, destaining 단계에서 이미징에 대한 응답으로 시냅스 소포를 염색하고 destaining을위한 프로토콜을 설명했다. 기존 프로토콜 이외에, 우리는 미니어처 시냅스 활성에 근거 FM의 destaining 관찰의 새로운 프로토콜을 포함했다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 운동 장애 근긴장의 마우스 모델에서 배양 된 신경 세포의 이상을 확인했다. 높은 활성 (20)에 의해 자극 될 때, 야생형 마우스에서 그들의 대응에 비해, 이들 뉴런은 칼슘 2 + 의존적으로 시냅스 소포 세포 외 유출을 가속화 받았다. 신경 전달 물질 방출 (19)의 패치 클램프 전기 생리학 기록에 의해 확인 된 이들 뉴런은 또한, 더 자주 소형 시냅스 활성을 나타내었다. 이러한 분석에서 FM 염료를 사용하기위한 프로토콜의 중요한 측면은 ASSE한다SS 및 광표백을 최소화합니다. photobleaching에 의해 야기되는 변화는 시냅스 활동에 의해 발생 된 것과 비교하여 작은 경우 FM 형광 강도의 미묘한 변화를 확실하게 평가할 수있다. 감소 광표백 또한 세포 독성을 억제 또는 제거 할 수있는 잠재력이있다. 광표백은 광을 여기하는 형광체의 노출을 최소화함으로써 감소 될 수 있고, 실시간 이미징 실험에서이를 수행하는 장치의 적어도 두 개의 구성 요소가있다. 한 가지 중요한 요소는 EMCCD 카메라 예를 들어, 광자의 민감한 검출기입니다. 이로써 부정적인 형광 발광의 검출에 영향을주지 않고 노광의 지속 시간 및 강도를 최소화 할 수있다. 관련된 구성 요소 검출기는 영상을 획득 할 때만 여기 광으로 시료의 노출을 제한하는 광원 시스템이다. 이것은 쉽게 노광의 타이밍을 효율적으로 제어 할 수 LED 라이트 (41) (ON / OFF t함으로써 달성된다AKES 1 밀리 초보다 훨씬 적은). 노출은 카메라 (도르 카메라의 예를 들어 &quot;불&quot;터미널)에서 디지털 출력으로 만 이미지를 캡처하는 동안 트리거 될 수 있습니다. LED를 사용하는 추가의 이점은 다음을 포함한다 : 패치 클램프 기록과 유리 피펫의 정확한 처리에 방해가 감광 필터, 광 강도의 장기적인 안정성, 기계적 진동의 부재를 사용하지 않고, 광 강도를 제어하는​​ 능력을 . 일반적으로, 구조적으로 상이한 염료 같은 촬상 조건에서 서로 다른 속도로 photobleach. 따라서 그것은 특히 실험에 사용 된 형광 물질의 광표백의 정도를 평가하는데 이상적 일 것이다. 라이브 신경 말단에서 FM 염료 위해, 때문에 자발적 또는 미니어처 시냅스 활동 시냅스 활성의 광표백 레이트 독립적를 평가하는 것은 기술적 도전이다. 이러한 activit 동안 형광 강도의 감소Y는 FM 염료 (세포 외 유출), FM 염료의 광표백, 또는 두 가지 모두의 생물학적 손실로 인해 수 있습니다. 다행히 고칠 FM 염료의 구조는 nonfixable FM 염료의 것과 거의 동일하도록 설계되어 있습니다. 시냅스 활동이 시편의 화학 고정술 후 차단 된 반면, 여기에 설명 된 프로토콜에서 고칠 FM 염료는 nonfixable FM 염료와 같은 방법에 의해 시냅스 소포에로드되었다. 촬상 조건 라이브 세포 이미징 19과 동일 할 때 특히,이 시스템을 사용하여 측정 광표백의 속도는 최저 2-3 %까지 2 분에 걸쳐 있었다. FM 염료는 시냅스 소포 재활용의 다양한 측면을 탐구하기 위해 다른 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 염색 및 destaining 동안 서로 다른 시냅스 활동 실험 목적과 평가 될 시냅스 소포 리사이클의 특정 기능에 따라 다양한 방법으로 결합 될 수있다. antagon의 선택ISTS 또한 실험의 목적에 따라 달라집니다. 또한, FM 촬상는 염색 단계 동안뿐 아니라 destaining 단계 9,18,42 동안 수행 될 수있다. 그것은 또한 명심해야한다, 그러나, FM 염료는 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (43)을 차단, 44, 저장소로 작동하는 칼슘 2 + 채널 45 mechanotransducer 채널을 침투하고, ATP (46) 수용체와 같은 예기치 않은 효과를 가질 수 있습니다. FM 염료 고농도 잠재적 시냅스 소포 세포 외 유출 자체 (47)의 효율을 변경할 수있다. 따라서 우리는 실험을 설계하고 시냅스 소포 재활용에 대한 결과를 해석에주의를하는 것이 좋습니다. 고려하는 보완 방법은 항원 결정기 소포 단백질 22,48의 내 내강 도메인입니다 항체의 시냅스 소포에 이해를 포함한다. 또한 pH 민감성 소포 루멘 49-51를 대상으로 GFP 변종과 이해를 표현 포함엑소 - 엔도 시토 시스와 함께 내 기공을 갖는 pH 변화를 감지 둘 pH 민감성 항체 복합체 52-54의. 원하지 않는 효과를 제외하면, FM 염료는 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 예를 들면, 그들은 동일한 시냅스 소포 풀이 자발에 대해 공유되어 있는지 해결하는데 사용할 및 소포 릴리스 17,55을 유발, 어느 정도 시냅스 소포 재활용의 효율성은 56, 57를 조절할 수있다하고, 될 수있는 효과 않는 이전 상태 (나머지 또는 자극) 등 자연과 소형 시냅스 활동을 기반으로 소포 재활용의 이상 상태를 발휘한다. FM 염료는 또한 FM 광 변환 방법 30,58-62 의해 빛과 전자 ​​현미경의 관찰 결과를 상관시킴으로써, 초 미세 구조 레벨에서 시냅스 소포 재활용을 평가할 수있다. FM 염료 동시에 시냅스 기능 및 내 Ca 2 + 콘을 모니터링하는데 사용될 수있다centration 5. 시냅스 소포, FM 염료와 같은 형광 덱스 트란 12 등의 다른 형광 유체 - 위상 마커 라벨링 외에도 격렬한 신경 활성에 의해 트리거되는 벌크 엔도 시토 시스를 모니터링하는데 사용될 수있다. 결론적으로, FM 염료의 응용 프로그램이 시냅스 소포 재활용 및 추가 시냅스 기능에 대한 귀중한 정보 소스를 제공합니다.

시냅스 소포의 기능은 시냅스 전달의 중요한 결정 요인이다. 그들은 시냅스 세포막 (세포 외 유출)와 융합 할 때이 소포는 신경 전달 물질을 방출, 그들은 세포막 (엔도 사이토 시스)에서 재생과 신경 전달 물질로 다시로드 된 후 릴리스의 또 다른 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. 의 역학과 시냅스 소포 재활용을 기본 메커니즘에 대한 연구는 크게 스티 FM 염료 (1)의 도입에 의해 가속화되었다. 긍정적으로 (그림 1A, 그림 1B의 FM1-43 stereoview에서 여러 염료) 친수성 머리 그룹과 소수성 꼬리가 청구 한이 양친 매성 분자는 가역적으로 입력을 침투하지 않고 지질 세포막을 종료 할 수 있습니다. FM 염료의 그룹들이 방출하는 빛의 범위에 영향을 미치는 유사한 기능을 공유 할 수 있습니다. 예를 들어, FM2-10, FM1-43, 및 FM1-84는 두 개의 고리 형 화합물과 슈 사이에 하나의 이중 결합이w 녹색 방출. 그들 사이의 차이는 소수성을 결정하고, 따라서 멤브레인으로부터 출구의 비율 (departitioning) 소수성 꼬리의 길이이다. FM5-95 및 FM4-64의 경우, 세 개의 이중 결합 사이 클릭 화합물을 연결, 그들은 적색 발광을 보여줍니다. 이 염료는 친수성 ​​부분에 대한 차이가 있습니다. 그들은 인해 친수성 ​​환경 소수성 환경 상대 양자 수율 증가, 생체막에 삽입 될 때 모든 FM 염료에서, 형광 강도가 증가한다. 따라서 FM 강도의 변화는 막 회전율의 변화를 나타냅니다. 다른 색 (발광 스펙트럼)과 hydrophobicities는 FM이 시냅스 소포 재활용의 다양한 연구 도구 염료합니다. 이러한 기능을 바탕으로, FM 염료는 대부분 시냅스 소포 재활용 분석을 다음과 같은 방식 (그림 2)에 따라 사용됩니다. 신경그들은 엔도 시토 시스 (염색)을 통해 형태로의는 시냅스 소포 (의 SV)에 채택되기에 가능, FM 염료를 포함하는 세포 외 용액에 목욕을합니다. 염료는 염료가없는 세포 외 용액을인가함으로써 세척하고, 이것은 즉 만 활발히 진행 엔도 시토 시스는 염료 (도 2 하단)으로로드 된 시냅스 소포의 클러스터를 포함 할 기능적 신경 말단을 보여준다. 이후의 세포 외 유출은 세포 외 공간으로 FM 염료의 손실과 형광의 수반하는 손실로 연결 (destaining; 인해 친수성 ​​환경에 departitioning 멀리 세포 외 유출의 사이트에서 확산 둘 다). 따라서 FM의 형광 강도의 변화는 시냅스 소포 엑소와 엔도 사이토 시스의 지표입니다. FM 염료는 다양한 생물과 준비 2,3에있는 시냅스 소포를 얼룩 destain하는 데 사용되었습니다. 예를 들면 포유류 neur 포함ONAL 문화 4-9, 포유류의 뇌 조각 10, 11, 신경 근육 접합부 (12, 13), 망막 바이폴라 뉴런 14, 15, 및 16 달팽이관의 유모 세포. 일반적으로 실험, 염색 및 destaining 모두 광범위 뉴런 (유발 활동을) 자극에 의​​해 트리거됩니다. 외부 자극 (자연과 소형 시냅스 활동) 9,17-19의 부재에서 재활용을 가지고 최근에, 그러나, 약한 자극에 대한 응답으로 시냅스 소포 재활용도 분석하고있다. 자연과 소형 시냅스 활동은 활동 전위의 자연 발화 (그림 3)을 포함하는 이전에, 외부 자극의 부재에서 발생하는 것과 같이 정의된다. 이러한 약한 시냅스 활동은 다양한 자극에 의​​해 트리거보다 FM 신호의 작은 변화와 관련되어있다. 측정을 요구하는 FM의 fluoresc의 변화줬어 강도는 정확하게 시냅스 소포 세포 외 유출 또는 엔도 시토 시스하지만 강도 인공적하지 않은 변경 사항을 반영합니다. 이슈의 원인 중 하나는 FM 염료에 의한 세포막의 비특이적 염색의 존재이다. 이 구성 요소의 점진적 유실이 잘못 시냅스 활동에 기인한다 측정 된 형광 강도의 점진적인 변화로 이어질 것입니다. 이 계수는 (프로토콜 참조) 적절한 방법에 의해 감소​​ 될 수있다. 이슈의 가장 주목할만한 원인은 시냅스 소포 내에 유지 FM 염료의 광표백입니다. FM 강도 광표백 관련된 변화를 측정하는 생물 (시냅스)의 변화에​​ 비해 작아야한다. 민감한 카메라의 최근의 개발은, 예를 들면 전자 승산 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라가 가능한 노광 시간을 단축하고 형광체를 여기 시키는데 사용되는 빛의 강도를 약화 photobleaching에 의해 최소화 할 수있다. 이슈의 또 다른 원인은 드리프트의 iN 광학 현미경의 초점 수준. 촬상 세션 동안 포커스 드리프트는 기계적 또는 열 효과에 의해 야기 될 수 있고, 잘못 측정 된 형광 강도의 변화로 이어질 것이다. 여기에서 우리는 가능한 특히, 소형 시냅스 활성, 약한 또는 전혀 자극의 컨텍스트에서 시냅스 소포 재활용을 분석하는 FM 염료를 사용할 수 있도록 프로토콜 및 장비를 설명한다. 우리는 배양 된 쥐의 해마 신경 세포를 사용하고 destaining 단계 이미징, 유발과 자발적인 시냅스 이벤트 기간 동안 소포의 염색과 destaining의 예를 보여줍니다. 또한 인하여 시냅스 활동에 대한 FM 염료 손실의 부재에서, FM 염료 광표백의 정도를 평가하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Pulse generator</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;Isolated stimulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (&lt;i&gt;e.g.&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Filter cube</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td></tr><tr><td>Filter cube</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td></tr><tr><td>Liquid recirculating chiller</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&amp;deg;C, and thereby reducing noise.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Fast perfusion system</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; balanced salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

기능 신경 말단에서 시냅스 소포는 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스를 받고있다. 이 시냅스 소포 재활용 효과적으로 막 매출을 공개 스티 FM 염료를 사용하여 분석 할 수 있습니다. FM 염료의 사용을위한 종래의 프로토콜이 자극 (유발) 시냅스 활성 다음 뉴런을 분석을 위해 설계되었다. 최근 프로토콜은 자연 또는 소형 시냅스 이벤트와 같은 약한 시냅스 활동을 함께 FM 신호 분석을위한 유효하게되었다. FM 신호의 이러한 작은 변화의 분석 영상 시스템은 강도의 작은 변화를 감지하기에 충분히 민감하다, 그러나 큰 진폭의 인공적인 변화가 억제되어 있어야합니다. 여기서 우리는, 유발 자발 및 미니어처 시냅스 활동, 예를 들어 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 적용 할 수있는 프로토콜을 설명한다. 이것은 중요하다으로서이 프로토콜은 또한, FM 염료의 광표백의 속도를 평가하는 수단을 포함강도의 작은 변화 이미징 유물의 소스.

예를 들어, 우리는 시냅스 소포의 destaining 시간 코스 (그림 4)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 배양 된 해마의 신경 세포가 자발적 시냅스 활동 (단계 2.3)를 사용하여 FM4-64로 염색 및 염료 무료 솔루션 (솔루션 2 린스)로 세척 하였다. 영상은 자발적인 활동 (단계 5.3) (연속 라인의 초기 부분, 그림 4A)를 사용하여 초기 destaining 시간의 과정을 보여줍니다. 이것은 120 초 동안 10 Hz에서 자극 필드 각각 (단계 5.1)로 유발 된 활성의 3 라운드를 사용 destaining 시간 코스 따른다. 유발 destaining의 양을 측정하는 방법 중 하나는 소포의 전체 리사이클 풀의 크기에 대응 양두 화살표 (ΔFM 유발)으로 설명된다. 첫 번째 자극이 주어지기 전에, (그림 (b)에 확대) FM 강도의 점진적 감소가 발생했습니다. 이 감소는 destaining 구성되었다때문에 자발적인 시냅스 활동 (ΔFM Spont) 및 광표백 (ΔFM PB). 광표백의 기여가 작은 경우, preimaging 기준선 (ΔFM Spont + ΔFM PB)까지 변화 자발 활동 destaining 량에 근사로서 사용될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50557/50557fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. FM 염료의 구조. A. FM은 주에게 몇 가지 일반적인 구조적 특징을 염료. 친수성 그룹은 수용액에 머물면서 소수성 꼬리는 FM 염료 막으로 분할 할 수 있습니다. FM2-10, FM1-43 및 FM1-84 쇼 녹색 방출, FM5-95 및 FM4-64 쇼 적색 편이 방출있다. FM1-43, 가장 일반적으로 사용되는 FM 염료 B. Stereoview. 친수성 그룹이 위쪽을 향하도록하고, 소수성 꼬리가 아래로 향하게됩니다. 되었습니다 Nitrogen 원자는 파란색으로 표시됩니다. FM1-43의 또 다른보기를 들어, Schote 및 Seelig 63을 참조하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50557/50557fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 수용액 즉 (그레이) 훨씬 덜 형광 반면 FM 염료 사용의 기본적인 방식은. 뉴런에 도포 후, 세포막 내로 삽입 FM 염료, 형광 (녹색)이된다. 그것은 일반적으로 세포 외 유출을 다음, 엔도 시토 시스를 거쳐 때 시냅스 소포 (SV)는, FM 염료에 의해 (염색)로드됩니다. 세포 외 용액에 FM 염료를 세척 만 스테인드 소포 형광이 될 수 있습니다. 이 세포 외 유출을 거쳐 따라서 FM 염료를 놓을 때 그 후, 시냅스 소포는 (탈 염색시킨) 언로드됩니다. 아래 이미지는 FM1-43 배양 해마 신경 세포의 모범 염색 (형광 및 위상 콘트라스트 이미지 오버레이를 보여줍니다). 그것은이 문서에 설명 된 프로토콜, 형광 puncta에이 시냅스 전 신경 말단 스테인드 시냅스 소포의 클러스터 (일반적으로 중앙 신경에있는 직경 ~ 1 μm의)가 아닌 개별 시냅스 소포 (직경 ~ 40 nm의) 대표,주의입니다. 단순화를 위해이 방식은 시냅스 소포 엑소 엔도 사이토 시스의 일반적인 생각을 나타냅니다. 그런 방 clathrin 매개 엔도 시토 시스, 과도 키스 앤 실행 엑소 엔도 사이토 시스, 벌크 엔도 시토 시스 (64)에 의해 다음에 전체 붕괴의 융합과 같은 엑소 엔도 사이토 시스의 복수 형태를 포함 할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50557/50557fig2highres.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50557/50557fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. FM 영상에 의해 연구 시냅스 활동의 세 가지 유형.<html> 유발 시냅스 활동은 일반적으로 외부 전기 자극을 필요로한다. 자발적인 시냅스 활성은 전기 자극의 부재하에 일어난다. 미니 시냅스 활동이 전기 자극없이 활동 전위없이 자발적으로 발생 일반적으로 활동 전위 생성은 전압 의존 나 + 채널, 테트로도톡신의 차단에 의해 억제된다. 세포 외 유출이 (세포질 내 칼슘 이온 농도의 지속적인 증가) 이오 노마 이신, 하이-K + 용액 (연속 탈분극)에 의해 자극, 자당 (쉽게 탈착 풀에있는 소포의 세포 외 유출을 도출)를 포함하는 고장 성 용액, 때 추가 활동이 유발 된 활동을 포함 세포 외 유출을 받아야하는 시냅스 소포에 대한 활동 전위의 발사를 필요로하지 않습니다 모두가. 일부 연구에서, 자발적인 활동이 광범위하게뿐만 아니라 소형 활동을 포함하는 것으로 정의되어 있습니다. igure 4 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot;5 인치 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 4. destaining의 대표적인 결과. A. 배양 된 해마의 신경 세포는 37 ° C (2.3 단계)에서 10 분 동안 2.5 μM FM4-64으로 자발적인 활동으로 염색하고 (프로토콜 3) 세척. 뉴런은 자발적인 활동 (단계 5.3)과 destaining 동안 몇 군데, 그리고했다 유발 활동 (단계 5.1) (연속 곡선, N의 평균 = 25 신경 터미널)의 3 라운드. 수직 막대는 SEM을 나타냅니다. Y 축은 절대 FM 강도를 나타내고, 카메라 셔터가 닫힐 때 &quot;0&quot;의 강도를 나타낸다. 유발 destaining의 총 양 (ΔFM 유발) 표시됩니다. B. 패널의 A (연속 곡선, 편의상 생략 SEM 바)에 destaining의 초기 단계의보기를 확장했다. 60 초 관찰하는 동안 억류 자발적인 행위에 주로 기인의 ivity (ΔFM Spont)하지만 인해 (ΔFM PB)을 photobleaching에 부분적이었다. FM4-64 (두꺼운 점선)의 광표백 시간 코스는 고칠 수 FM4-64 (프로토콜 6) 이미징에 의해 별도의 실험에서 산출 된 것입니다. 비율은 (15 분에 걸쳐 커브 피팅에 의해 결정된 5736 초의 시간 상수를 가진 단일 지수 함수)이 19 분에 걸쳐 2~3%이었다. 광표백 곡선 FM4-64의 측정 된 강도의 초기 값에 상당 가진 지수 함수로 그려졌다. 더 긴 기간 (9 분)에 광표백에 Kakazu 등. 19에 보충 그림 S5를 참조 변수 여기 강도와 노출 시간. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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21.0K 조회수.  University of Iowa Carver College of Medicine.  우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다. 

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

연구

신경과학

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

생물학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them water-soluble with the ability to reversibly enter and exit membrane lipid bilayers. These styryl dyes are relatively non-fluorescent in aqueous medium, but insertion into the outer leaflet of the plasma membrane causes a &#62;40X increase in fluorescence. In neuronal synapses, FM dyes are internalized during SV endocytosis, trafficked both within and between SV pools, and released with SV exocytosis, providing a powerful tool to visualize presynaptic stages of neurotransmission. A primary genetic model of glutamatergic synapse development and function is the Drosophila neuromuscular junction (NMJ), where FM dye imaging has been used extensively to quantify SV dynamics in a wide range of mutant conditions. The NMJ synaptic terminal is easily accessible, with a beautiful array of large synaptic boutons ideal for imaging applications. Here, we compare and contrast the three ways to stimulate the Drosophila NMJ to drive activity-dependent FM1-43 dye uptake/release: 1) bath application of high [K+] to depolarize neuromuscular tissues, 2) suction electrode motor nerve stimulation to depolarize the presynaptic nerve terminal, and 3) targeted transgenic expression of channelrhodopsin variants for light-stimulated, spatial control of depolarization. Each of these methods has benefits and disadvantages for the study of genetic mutation effects on the SV cycle at the Drosophila NMJ. We will discuss these advantages and disadvantages to assist the selection of the stimulation approach, together with the methodologies specific to each strategy. In addition to fluorescent imaging, FM dyes can be photoconverted to electron-dense signals visualized using transmission electron microscopy (TEM) to study SV cycle mechanisms at an ultrastructural level. We provide the comparisons of confocal and electron microscopy imaging from the different methods of Drosophila NMJ stimulation, to help guide the selection of future experimental paradigms.

Synaptic vesicle (SV) cycling is the core mechanism of intercellular communication at neuronal synapses. FM dye uptake and release are the primary means of quantitatively assaying SV endo- and exocytosis. Here, we compare all the stimulation methods to drive FM1-43 cycling at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) model synapse.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

FM Dyes in Vesicle Recycling

FM dyes are a class of fluorescent molecules that has found important use in studying the vesicle recycling process. By virtue of a chemical structure, these molecules can insert themselves into the outer leaflet of phospholipid bilayer membranes. After membrane insertion, they are internalized into the cell via endocytosed vesicles, and released when these vesicles recycle back to the membrane. Since, these dyes fluoresce strongly in the hydrophobic environment within membranes and weakly in the extracellular compartment, FM fluorescence levels can be used to track vesicular activity throughout the recycling process.This video provides an introduction to the use of FM dyes in experiments aimed to examine vesicle recycling. We first review the biochemistry of FM dyes and how their properties permit their use in these experiments. We then go through a general protocol for using FM dyes in such studies, and finally, discuss some recent research that makes use of these unique molecules.

소포 재활용의 FM 염색

FM dyes are a class of fluorescent molecules that has found important use in studying the vesicle recycling process. By virtue of a chemical structure, ...