本研究は、肺感染症モデルにおけるマウスの気道内容物保存のための効率的なプロトコルの確立を目指す。私たちは、吸入した真菌胞子が肺のどこに着地するかという疑問に答える能力を開発しています。最近、多くのグループが、感染を感知し、防御免疫応答を開始する上で、さまざまな気道上皮細胞の役割を特定しました。
これらの上皮細胞は、気管支のクラブ細胞から末端肺胞のII型上皮細胞までさまざまです。一般的な肺調製技術は、液体固定剤で肺を膨らませて、下流の組織学的分析のために肺組織を保存することです。ただし、この技術は、吸入された真菌胞子などの気道の内容物を置換します。
私たちのプロトコルは、肺内の吸入された真菌胞子の自然な位置を維持しながら、空気膨張による適切な肺の形態と血管灌流による適切な肺の固定を維持します。このプロトコルを使用して、モデルで胞子が着地しているように見える気管支肺胞接合部を特徴付けたいと考えていますが、さまざまな上皮細胞に近接する胞子の位置を利用し、結果として生じる免疫応答を研究します。まず、5マイクロモル濃度のCFSEで6つのCoccidioides posadasii胞子の10倍を10倍に1回、摂氏30度で30分間染色します。
染色後、胞子をPBSで洗浄します。胞子を12, 000 gで遠心分離し、適切な濃度で胞子接種用のPBSの25マイクロリットルにペレットを再懸濁します。25マイクロリットルの胞子接種物を入れたピペットを準備します。
Nalgene ジャーでマウスに麻酔をかけた後、マウスを片手で仰臥位に置き、3 〜 5 回定期的に息を吐くようにします。ピペットの先端をマウスの中咽頭の後部に置き、吸入中に接種物を放出します。マウスの胸部の後面と前部にパチパチという音を手と親指で感じて、接種の吸入を確認します。
深く麻酔したマウスに70%エタノールを噴霧します。はさみを使用して、マウスの皮膚を慎重に切り取り、次にそれを引き離して腹膜を露出させます。次に、上半分から皮膚をマウスの頭の上に引っ張り、腕を解放します。
次に、胸骨と胸郭の下面に沿って腹膜を切断し、腹膜を露出させます。横隔膜を明らかにするために肝臓を下方向に変位させます。はさみを使用して、横隔膜を肺実質から慎重に離して穴を開けます。
次に、左側の胸郭を切開して心臓を露出させます。30ゲージの針を使用して、5〜10ミリリットルのPBSを右心室に注入します。針を取り外した後、新しい針を使用して、5ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを右心室に注入します。.
はさみを使用して、胸郭の前半分を取り除きます。気管を露出させるには、気管がある正中線を避けて、上肋骨と鎖骨を首の左右に切ります。鉗子を使用して、首の正中線近くの残りの上部の肋骨と鎖骨をつかみ、気管が露出するまで上方向に引っ張ります。
10センチの縫合糸を用意し、気管の下に引っ張ります。露出した気管の下端で緩い結び目を事前に結びます。次に、18ゲージのカテーテルで1ミリリットルの空気の注射器を準備します。
18ゲージの針を使用して、露出した領域の上端にある気管に穴を開けます。次に、カテーテルを穴に挿入し、空気が逃げないようにしっかりとフィットします。次に、10秒かけて1ミリリットルの空気をゆっくりと肺に注入し、すべての肺葉の膨張を観察します。
完全に膨らませると、肺が心臓をわずかに包み込み、穿刺されていない横隔膜が占める体積が満たされます。マウスから肺を分離した後、20ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンで満たされた50ミリリットルの円錐管の上端に肺を置きます。縫合糸をチューブの外側に置き、キャップをねじ込みます。
まず、単離したマウスの肺をPBSですすぎ、30%ショ糖PBS溶液に摂氏4度で72〜96時間置きます。その後、余分な組織を取り除き、OCT培地を入れたクライオモールドに肺を入れます。試料をマイナス80°Cで凍結します。
OCTクライオブロックで試料をマイナス20°Cで1時間平衡化してから、ブロックを20〜100マイクロメートルの厚さで切片化します。切片をスライドガラスに集め、30分から1時間乾燥させます。スライドを室温のPBS浴に30分間入れて、組織からOCTを取り除きます。
次に、ワイプを使用して、組織標本の周りのスライドの周囲に余分な液滴を取り除きます。疎水性PAPペンを使用してスライド上の標本の周囲に周囲を描き、5分間乾燥させます。次に、新たに調製したアニマルフリーブロッキング溶液300マイクロリットルをスライドに加え、室温でインキュベートします。
次に、スライドを300 μLの一次Alexa Fluor 647標識ラット抗マウスEpCAM抗体溶液で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、抗体溶液を取り出し、スライドを300マイクロリットルのPBSで5分間2回洗浄します。乾燥後、室温でソフトセットしたSlowFadeガラス封入剤を各ティッシュに1滴加えます。
組織の上にカバースリップを置き、サンプルと疎水性マーカーの周囲を超えて広がるようにします。まず、真菌胞子を接種し、免疫染色したマウス肺切片をマルチチャンネル蛍光顕微鏡下に配置し、適切な対物レンズを選択します。肺葉全体をキャプチャするには、十分な画像タイルを収集し、それらを結合します。
顕微鏡のソフトウェアを使用して、下流処理のために肺葉全体の画像をエクスポートします。QuPathでプロジェクトファイルを作成し、蛍光画像をファイルに追加します。EpCAM陽性ピクセルを上皮として分類するには、分類、ピクセル分類、およびしきい値の作成を順番に選択します。
解像度、チャネル、スムージング シグマ、およびしきい値を選択して、ターゲット領域を特定します。分類子を一意の名前で保存し、[オブジェクトの作成] を選択します。新しい [オブジェクトの作成] ウィンドウで、[新しいオブジェクト タイプ] として [注釈] を選択します。
肺上皮の場合は、最小オブジェクトサイズと最小穴サイズを100平方マイクロメートルに設定します。[OK]を選択すると、注釈が作成され、ブラシツールを使用して変更できます。胞子を分類するには、肺上皮のアノテーションで示されている手順を繰り返します。
次に、[オブジェクトの作成] ウィンドウで、新しいオブジェクトの種類として [検出] を選択します。最小オブジェクト サイズと最小穴サイズを 0 平方マイクロメートルに設定し、[オブジェクトの分割] を選択します。次に、胞子の空間解析を順番に行うには、[解析]、[空間解析]の順に選択し、注釈までの符号付き距離を 2 次元で計算します。
EpCAM陽性上皮までの距離は、検出された胞子ごとに計算されます。最後に、[測定] をクリックし、続いて [測定値のエクスポート] をクリックして結果をエクスポートします。Coccidioides posadasiiの胞子は、主に遠位気管支と空気膨張した肺の近くの肺胞腔に蓄積しました。
胞子は、空気で膨らませた肺と比較して、フォーマルで液体で膨らんだ肺で気管支から離れて分散しているように見えました。胞子とEpCAM陽性細気管支上皮との間の距離は、生理的な空気膨張と比較して、液体膨張肺の方が大きく、胞子がより分散していることを示しています。
