このプロトコルは、抗クリプトコッカス特性を有する軟体動物からの化合物の単離を可能にする。この技術は、ヒト真菌病原体を殺すなど、潜在的な特性を持つ軟体動物から化合物を同定して分離するための公平なアプローチを提供します。HIV患者の治療に使用されているHIVプロテアーゼ阻害剤などの他の化合物があります。
しかし、他の病原体への拡大、および天然源の調査は、発見の新しい道を表しています。最後のステップは、サンプルがろ過されない可能性があるため、最も難しいステップです。その結果、サンプルをろ過のために希釈する必要がある場合があります。
指定および承認された自然地域からチパンゴパルディナチネンシスのような軟体動物を収集することから始めます。在来種と侵入種を選択して、幅広い潜在的な抗真菌効果を評価します。乳棒と乳鉢を使用してC.chinensisの殻をそっと破り、ピンセットで固い部分を取り除きます。
一般に、10匹の軟体動物がプロトコル用にプールされます。約15〜20グラムのサンプルを集めて計量し、はさみを使用して臓器を約0.5〜1センチメートルの大きさの小片に切断します。乳棒と乳鉢を使用して臓器サンプルを微粉末に粉砕する前に、液体窒素を使用して解剖および切断された臓器サンプルをフラッシュフリーズします。
完了したら、約15グラムの臓器サンプル粉末を30ミリリットルの冷たい蒸留水に加えて、1対2の比率を達成します。2ミリリットルのサンプルを耐衝撃性2ミリリットルのチューブに注ぎ、各チューブに約500マイクログラムの3ミリメートルのステンレス鋼ビーズを追加します。弾丸ブレンダーまたはビーズビーターを使用して、摂氏4度で1, 200 RPMで3分間均質化します。
チューブを12, 000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を新鮮な50ミリリットルのチューブに集め、ペレットを捨てます。フィルターは、0.22マイクロメートルの膜を使用して上清を滅菌し、抽出物を清澄化する前にサンプルを氷上に保存します。
上清サンプルを摂氏60度の温浴に30分間置き、氷で満たされたバケツにサンプルを20分間移してすぐに冷却します。冷たいサンプルを 15 、 000 G で摂氏 4 度で 45 分間遠心分離します。上清を新鮮な50ミリリットルのチューブに集め、ペレットを捨てます。
フィルター 0.22ミクロンのメンブレンフィルターを使用してサンプルを滅菌し、氷上に保管します。完了したら、定量アッセイを使用して、粗抽出物および清澄化抽出物中のタンパク質濃度を決定します。最適なタンパク質濃度範囲は、ミリリットルあたり4〜8マイクログラムです。
サンプルを氷上で最大1時間インキュベートするか、液体窒素で急速凍結してから、必要になるまで摂氏マイナス20度で保管します。96ウェルの平底プレートで、1ミリリットルあたり4ミリグラムの粗または清澄化軟体動物タンパク質抽出物10マイクロリットル、測定された直線範囲内の濃度を有する10マイクロリットルのサチライシンA、および8.6pHの220マイクロリットルの100ミリモルトリス塩酸塩を摂氏25度で10分間インキュベートします。次に、サチライシンAの基質であるN-スクシニル-アラニン、アラニン、プロリン、フェノールアラニン、p-ニトロアニリンを10マイクロリットル加え、最終反応量250マイクロリットルに対して最終濃度1KMで加えます。
完了したら、405ナノメートルの光学密度を15秒ごとに3分間監視することにより、酵素活性を測定します。抽出物を含まないウェルが読み取り中に直線曲線を生成することを確認してください。残存酵素活性を決定するには、軟体動物抽出物の存在下での酵素活性と抽出物非存在下での酵素活性の比率を計算します。
阻害活性が認められる場合は、上記抽出物の濃度の範囲を用いて阻害濃度50またはIC50値を測定する。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、C.neoformans H99野生型の単一コロニーを5ミリリットルの酵母エキスペプトンデキストロースまたはYEPD培地に導入し、摂氏30度および200RPMで16〜18時間インキュベートします。キュベットに500マイクロリットルの培養物を集め、600ナノメートルの光学密度を読み取ることによって成長を測定します。
培養液を酵母窒素ベースまたはYNB培地で最終光学密度0.02に希釈します。96ウェルプレートで10マイクロリットルの抽出物と190マイクロリットルの希釈C.neoformans培養物を混合することにより、C.neoformans細胞を異なる濃度の粗抽出物と清澄化抽出物と共培養します。プレートリーダーを使用して、600ナノメートルの光学密度を15分から1時間ごとに、200 RPMおよび摂氏37度で72時間読み取り、成長を測定します。
C.chinensisの抽出物は、クリプトコッカスネオフォルマンスの病原性に関連するサブチリシンAのタンパク質分解活性を阻害することができ、IC50値は粗抽出物では5.3マイクログラム/ミリリットル、清澄抽出物では4.53マイクログラム/ミリリットルでした。真菌の増殖を含むC.Neoformans病原性因子産生に関連するプロセスに対するC.chinensis抽出物の評価は、粗および清澄化されたC.chinensis抽出物の存在下で摂氏37度で真菌の成長の有意な減少があったことを示しました。カプセル、メラニン産生、およびバイオフィルムの形成に対する抽出物の評価は、粗または清澄化されたC.chinensis抽出物の存在下でカプセルまたはメラニン産生に変化がないことを示しました。
しかしながら、バイオフィルム形成における70〜80%の有意な減少は、未処理対照と比較して高濃度の粗および清澄抽出物で観察された。プロトコルの成功は、粉砕、適切な量の酵素の添加、基質の添加後の読み取りなどの適切な抽出手順に依存します。この技術は、重要なクリプトコッカスの病原性因子として熱耐性に焦点を当てています。
ただし、メラニンやカプセルの生成、バイオフィルムの形成など、他の病原性因子を評価することができます。これらの結果は、より高い安定性、特異性を提供し、耐性を受けにくい天然化合物を使用した抗真菌戦略の新しいアプローチを構成する新しい経路を開きます。長期的な目標は、これらの真菌性病原体に対する新しい方法を見つけ、耐性メカニズムを最小限に抑えることです。
