協調の多くの例にもかかわらず、ほとんどの研究はアクチンまたは微小管タンパク質を個別に調べる。この方法は、単一の反応における両方の動的ポリマーの視覚化を可能にする。この技術により、ユーザーは、アクチンおよび微小管の動的バージョンでのみ見ることができた創発的な特性について、多様な調節タンパク質を評価することができる。
この技術は、合成細胞の構築に近づくために脂質または抽出物を含むように拡張することができる。PEGシランおよびビオチン-PEG-シラン粉末のアリコートを解凍し、PEG粉末を80%エタノールに溶解して、mPEGシラン1ミリリットルあたり10ミリグラム、ビオチン-PEGシラン1ミリリットルあたり2〜4ミリグラムのコーティングストック溶液を生成することから始めます。鉗子を使用してエタノール貯蔵からきれいなカバースリップを取り外します。
窒素ガスで乾燥させ、清潔なペトリ皿に保管してください。カバースリップを100マイクロリットルのコーティング溶液でコーティングし、少なくとも18時間または使用時まで摂氏70度でインキュベートする。両面テープを 12 枚切り取って、長さ 24 mm にします。
テープバッキングの片側を取り外し、クリーンなイメージングチャンバにある6つの溝に隣接するテープ片を固定します。テープの粘着面を各チャンバー溝に沿って露出させるために2枚目のテープバッキングを取り外し、チャンバーテープ側を上向きに清潔な面に置きます。小さな計量ボートでエポキシ樹脂と硬化剤溶液を1対1で混合し、P1000チップを使用して、各イメージングチャンバ溝の端にあるテープストリップ間に混合エポキシの滴を配置します。
次に、チャンバー、テープ、またはエポキシ側を上にして、きれいな表面に置きます。コーティングされたカバースリップを摂氏70度のインキュベーターから取り出し、カバースリップのコーティングされた表面とコーティングされていない表面を二重蒸留水で6回すすいでください。ろ過した窒素ガスで乾燥させた後、カバースリップコーティング側をテープに向けて撮影室に貼り付けます。
P200またはP1000ピペットチップを使用してテープ付きガラスのインターフェースに圧力をかけ、テープとカバースリップの間の良好なシールを確保します。組み立てたチャンバーを室温で少なくとも5〜10分間インキュベートして、エポキシが使用前にチャンバーウェルを完全に密閉できるようにします。灌流チャンバーは、組み立てから12〜18時間以内に期限切れになります。
灌流ポンプを使用し、50マイクロリットルの1%BSAを流して灌流チャンバ内のコンディショニング溶液を順次交換し、イメージングチャンバをプライミングします。ルアーロックフィッティングリザーバから余分なバッファを取り除きます。次いで、ストレプトアビジン1ミリリットル当たり0.005ミリグラムの50マイクロリットルを流し、室温で1〜2分間インキュベートする。
余分なバッファーをリザーバーから取り出します。50マイクロリットルの1%BSAを流して非特異的結合をブロックし、10〜30秒間インキュベートする。余分なバッファーをリザーバーから取り出します。
次に、50マイクロリットルの温かい1x TIRF緩衝液を流し、次いで50マイクロリットルの安定化および50%ビオチン化微小管種子を1x TIRF緩衝液で希釈する。最初の生化学反応をイメージングする前に、ステージまたは対物ヒーター装置を35〜37°Cの温度を30分間維持するように設定します。次に、取得間隔を15~20分間5秒毎に設定します。
次に、まず重合反応を調整してアクチンフィラメントアセンブリを開始することにより、488および647レーザー露光を5%〜10%パワーで50〜100ミリ秒に設定した。647ナノメートルで画像を取得し、適切な調整を行います。次いで、第2の馴化灌流ウェルで重合反応を調整し、微小管アセンブリを開始する。
488ナノメートルで可視化し、適切な調整を行います。使用の15分以内に、3マイクロリットルの10マイクロモル488チューブリンを100マイクロモルの蛍光標識されていないチューブリンの7.2マイクロリットルアリコートと組み合わせる。次いで、3マイクロリットルの希釈ビオチン関連アクチンを、蛍光的に標識されていない標識アクチンの適切な体積に結合して、最終混合物が10%〜30%の蛍光標識を有する総アクチンの12.5マイクロモルになるようにする。
イメージングの15分前までに、2マイクロリットルの12.5マイクロモルのアクチンミックスストックをチューブリンストックミックスと組み合わせることによって、細胞骨格ミックスを調製する。使用時まで氷の上に保管してください。2x TIRFバッファー、抗漂白剤、ヌクレオチド、バッファー、およびアクセサリータンパク質を含む他のすべての実験成分およびタンパク質を組み合わせて、タンパク質反応ミックスを調製します。
細胞骨格ミックスとタンパク質反応ミックスを別々に摂氏37度で30〜60秒間インキュベートする。反応を開始するには、タンパク質反応ミックスの内容物を細胞骨格ミックスに追加し、それを混合する。15マイクロモルの遊離チューブリン、1ミリモルのGTP、0.5マイクロモルのアクチンモノマー、および適切な量の緩衝液を添加した1x TIRF緩衝液を含む反応混合物の50マイクロリットルを灌流チャンバに流す。
顕微鏡ソフトを使用してタイムラプス動画を録画し、5秒ごとに15~20分間取得します。新しい灌流をウェルにコンディショニングし、バッファー容量を目的の調節タンパク質およびバッファーコントロールに置き換えます。創発的なアクチン微小管機能に対する調節タンパク質を評価するために取得する。
微小管およびアクチンフィラメントダイナミクスの測定例をこれらの画像に示す。チューブリンチャネルの平均時間投影は、Kymographプロットの生成に使用されるラインスキャンの全微小管長を効率的に視覚化します。黒い点線は、動的微小管の2つの例のキモグラフに対応する。
微小管の成長および分解段階は、各Kymographに示されている。活発に重合する単一のアクチンフィラメントを描いた2つのタイムラプス画像モンタージュの例がここに示されている。伸長率は、マイクロモル当たりのアクチンフィラメントの長さのプロットの傾きとして計算され、経時的にアクチンがかかる。
したがって、2つの補正係数を0.5マイクロモルアクチン反応に適用して、1マイクロモルアクチン濃度で典型的に決定される速度を比較しなければならない。5本のフィラメントの例をここに示します。全内部反射蛍光、または250ナノモルタウの非存在下で重合するアクチンフィラメント中の動的微小管のTIRF画像がここに示されている。
青色の点線及び矢印マークは、各条件に対応する線走査プロットについて線を引いた。アクチン領域における微小管間の重なりは、面積当たり設定された時点でスコアリングすることができる。細胞骨格タンパク質、特にアクチン、微小管、およびそれらの調節因子は、凍結/融解サイクルに対して非常に敏感である。
一貫性と成功のためには、高純度で適切に保存されたタンパク質を使用してください。
