単一粒子クライオ電子顕微鏡は、高分子をほぼ原子分解能で構造化的に測定する方法です。画像処理や構造計算には複数のソフトウェアパッケージが用意されていますが、3Dマップ上の結果は、計算時に適用されるアルゴリズムの違いにより、品質と解像度が異なることがよくあります。したがって、異なるプログラムを組み合わせて使用することは、多くの場合、最適な結果を達成するために有益です。
このプロトコルは、CryoSPARC、RELION、Scipionの3つの異なるクライオEM処理プラットフォーム間でワークフローをナビゲートするようにユーザーをガイドします。このパイプラインを用いて、遺伝子治療に広く用いられているベクターであるアデノ随伴ウイルスの高分解能構造を得る方法を紹介します。Web ブラウザーで CryoSPARC v3 を開き、プロジェクトのワークスペースを作成したら、新しいワークスペースに移動し、右側のパネルでジョブビルダーを開きます。
[ムービーのインポート]をクリックし、ムービーパスを指定し、参照ファイルパスを取得します。次に、集録パラメータを設定します。次に、キューをクリックし、ジョブを実行するレーンとワークスペースを選択して、[作成]をクリックします。
パッチモーション補正とムービーのインポートジョブカードを開きます。次に、imported_movies出力を新しいジョブのムービープレースホルダーにドラッグし、ジョブをキューに入れます。コントラスト伝達関数またはCTF推定を行うには、パッチCTF推定を開く。
生成された顕微鏡写真を入力し、ジョブをキューに入れます。平均化された顕微鏡写真とCTF補正顕微鏡写真を検査し、さらなる処理のためにサブセットを選択するには、露出をキュレートし、前のステップから得られた露出を入力し、ジョブをキューに入れます。ジョブが待機モードに入ったら、ジョブ・カードの対話式タブをクリックします。
パラメータのしきい値を調整し、さらなる処理のために個々の顕微鏡写真を受け入れるか拒否します。現在のデータを処理しながら、乱視の上限を400オングストロームに設定し、CTFは分解能を5オングストロームに、相対氷厚を2に設定しました。次に、[完了]をクリックして、下流処理用の顕微鏡写真を選択します。
手動ベースのピッキングの場合は、手動ピッカーを開きます。受け入れられたエクスポージャーを入力し、ジョブをキューに入れます。次に、インタラクティブタブをクリックし、ボックスサイズを300ピクセルに設定し、複数の顕微鏡写真にわたって数百個の粒子をクリックして、粒子の重複を回避します。
選択が終了したら、[抽出粒子の選択が完了しました]をクリックします。次に、自動パーティクル ピッキング用のテンプレートを生成するには、[2D 分類] をクリックし、生成されたパーティクル ピックを入力します。次に、2D クラスの数を 10 に変更し、ジョブをキューに入れます。
次に、選択 2D クラスを開き、前の手順で取得したパーティクルとクラスの平均を入力します。次に、インタラクティブタブをクリックし、信号対雑音比が良好な代表的な2Dクラスを選択し、[完了]をクリックします。テンプレートベースのパーティクルピッキングの場合は、テンプレートピッカーを開き、選択した 2D クラスと顕微鏡写真を入力します。
次に、粒子径を 220 オングストロームに設定し、ジョブをキューに入れます。最後に、顕微鏡写真から抽出液を開き、検査から得られた顕微鏡写真と粒子ピックとを入力する。次に、抽出されたボックスのサイズを300ピクセルに設定し、ジョブをキューに入れます。
2D 分類の場合は、2D 分類をクリックし、抽出した粒子を入力します。次に、2D クラスの数を 50 に設定し、ジョブをキューに入れます。次に、選択した 2D クラスを開き、取得したパーティクルとクラスの平均を入力します。
インタラクティブなタブをクリックします。クラス内の解像度とパーティクルの数に基づいて 2D クラスを選択し、[完了] をクリックします。初期 3D ボリュームを生成するには、ab-initio 再構成を開き、最終的な 2D 分類のパーティクルを入力します。
次に、対称性を二十面体に調整し、ジョブをキューに入れます。次に、均質な微細化を開き、前のステップからの体積と最終的な2D分類からの粒子を入力する。次に、対称性を変更し、ジョブをキューに入れます。
ジョブが終了したら、フーリエシェル相関またはFSC曲線を検査し、UCSF キメラで調べるボリュームをダウンロードします。CryoSPARC v3 で、最終的な 2D 分類から選択した 2D クラス ジョブのジョブ カードを開きます。次に、[詳細]タブで、[ジョブのエクスポート]をクリックします。
PyEM を使用して、particles_exportedを変換します。示されたコマンドを実行して、cs ファイルをスター形式にします。粒子抽出をクリックした後、I/Oタブに、CTF補正顕微鏡写真と座標を入力します。
次に、[抽出]タブをクリックし、パーティクルボックスのサイズを300ピクセルに変更してジョブを実行します。3D リファインメントを行うには、CryoSPARC v3 で生成されたマップを RELION-3 の初期モデルとして使用します。インポート方法を選択し、「I/O」タブで示されたパラメーターを設定します。
次に、[その他] タブで、入力ファイルとして CryoSPARC v3 マップを選択し、ノード タイプを 3D 参照に変更してジョブを実行します。次に、3D自動絞り込みを選択し、[I/O]タブで入力画像をパーティクルとして設定します。最後の選択ジョブからのスター・ファイル。
CryoSPARC v3再構成を参照マップとして使用し、参照タブをクリックして、初期ローパスフィルタを50オングストロームに変更し、対称性を二十面体に変更します。次に、[最適化]タブで、マスクの直径を280オングストロームに変更し、ジョブを実行します。後処理の場合は、[後処理] をクリックします。
また、[I/O]タブで、作成したハーフマップとマスクを入力し、キャリブレーションされたピクセルサイズを1.045オングストロームに設定します。次に、シャープタブで、Bファクターを自動的に推定するには、yesと入力します。自動Bフィットの解像度が最も低い場合は、10と入力します。
そして、あなた自身のBファクターを使用するために、入力no。最後に、[フィルター] タブで、FSC 重み付けのスキップを [いいえ] に設定し、ジョブを実行します。研磨トレーニングには、ベイジアン研磨を開きます。
また、[I/O]タブで、モーション補正された顕微鏡写真、パーティクル、およびポストプロセスを入力します。以前に取得したスターファイル。[トレーニング] タブをクリックし、トレーニングの最適パラメータを yes に設定し、テスト対象のフーリエ ピクセルの割合を 0.5 に設定し、この数のパーティクルを 5, 000 に設定します。
次に、ジョブを実行します。トレーニングジョブが終了したら、[ベイジアン研磨]をクリックします。次に、[トレーニング] タブで、トレーニングの最適パラメーターを [いいえ] に設定します。
[ポリッシュ]タブを選択し、最適化されたパラメータファイルで、opt_params_all_groupsへのパスを指定します。前のステップのtxtファイルをクリックし、[実行]をクリックします。高次収差を推定するには、CTF 絞り込みを開きます。
また、[パーティクル]の下の[I/O]タブで、最近改良した3Dジョブから研磨されたパーティクルを含むスターファイルへのパスを選択します。次に、後処理 STAR ファイルで、最新の後処理ジョブからの出力へのパスを設定します。次に、[適合]タブを選択し、推定異方性倍率をnoに設定します。
CTFパラメータをnoに当てはめて実行します。ビームチルトを yes に推定します。また、トレフォイルをはいに推定します。
そして、4次収差を「はい」に推定します。次に、ジョブを実行します。RELION-3 マップをさらに改良して検証するには、Scipion 3 を起動して新しいプロジェクトを作成します。
左側のプロトコルパネルで、インポートドロップダウンを選択し、パーティクルのインポートをクリックします。インポートするパラメータを RELION-3 に変更し、スターファイルを postprocess.star に変更します。次に、前述のように集録パラメータを指定し、[実行]をクリックします。
次に、[インポート]ドロップダウンをクリックし、[インポートボリューム]を選択します。[インポート元] で、RELION-3 マップへのパスを指定し、ピクセル サイズのサンプリング レートをピクセルあたり 1.045 オングストロームに変更して実行します。グローバルアライメントを実行するには、プロトコルパネルから絞り込みドロップダウンメニューを選択し、xmipp3-highresをクリックします。
前のステップからインポートしたパーティクルとボリュームをそれぞれフルサイズのイメージと初期ボリュームとして入力し、対称グループを二十面体に設定します。次に、角度割り当ての下の[画像位置合わせ]タブで、[グローバル]を選択し、最大ターゲット解像度を3オングストロームに設定してジョブを実行します。ローカル位置合わせを実行するには、xmipp3-highres global を選択し、前の実行から続行を yes に変更して、前のジョブを選択します。
次に、[角度割り当て]タブで、画像の配置をローカルに変更し、最大ターゲット解像度を2.1オングストロームに設定します。終了後、xmipp3-highres 結果ウィンドウで、表示解像度プロットをクリックして絞り込み後に FSC がどのように変化したかを確認し、角度変更のあるプロットヒストグラムをクリックしてオイラー角度の割り当てが変更されたかどうかを確認します。UCSFキメラのボリュームを調べます。
ズームインして、高解像度の機能を探します。CTF適合度が高く、乱視が低い顕微鏡写真はさらなる処理のために選択され、高い乱視および没収を有する顕微鏡写真は廃棄された。明確に定義されたクラスを含む 2D クラス平均が選択され、解像度が低く、ノイズ、および部分粒子が拒否されました。
アデノ随伴ウイルスの原子座標を取り付けたクライオ電子顕微鏡マップの領域をここに示します。明確に定義されたEM密度は、個々のアミノ酸、水分子およびマグネシウムイオンの側鎖を適合させることを可能にする。CryoSPARC v3、RELION-3、およびScipionを使用して計算されたFSC曲線は、ワークフロー全体の分解能の向上を示し、構造および解像度ヒストグラムを通る4つの異なるスライスでの分解能推定値は、ワークフロー全体のマップ間の局所分解能の漸進的な改善を示しています。
CryoSPARC、RELION-3、Scipion、およびPhoenixのクライオEM処理アルゴリズムを組み合わせることで、処理パイプライン全体でアデノ随伴ウイルス構造の分解能が2.9オングストロームから2.3オングストロームに増加しました。各ステップで指定するパラメータはサンプルと顕微鏡に依存することを覚えておくことが重要です。さらに、高解像度に達する能力は、サンプルと生データの品質に大きく依存します。
このビデオでは、さまざまなソフトウェアプラットフォーム間でクライオEMデータを処理するための堅牢なSPワークフローを紹介します。このアプローチを使用することで、複数のプログラムがクライオ構造を改良および検証するためのアルゴリズムを実装できます。このワークフローは、多種多様な高分子集合体の構造計算に適用できます。
