このプロトコルは、研究者が放射能を必要とせずにin vivoでの鉄分布を追跡および定量できるようにするため、重要です。同じサンプル内で複数の安定鉄同位体を同時に検出できるため、この手法を使用して、さまざまなソースからの鉄の取り込み、調節、および分布を理解することができます。まず、ベンダーから提供されたガラスバイアルの鉄12に58ノルマル塩酸を加え、キャップを緩く交換します。
鉄を溶かすには、溶液を摂氏60度で1時間温めます。それでも溶解しない場合は、溶液をヒュームフード内で室温で一晩放置して溶解します。次に、塩化第二鉄溶液を生成するために、酸化を促進するためにキャップを外して溶液を摂氏60度に温めて、残りの塩化第一鉄を酸化します。
さらに酸化を促進するために、溶液50マイクロリットルあたり1マイクロリットルの35%過酸化水素を追加します。キャップを外した状態で、塩化第二鉄溶液を摂氏60度のフードに入れてサンプルを蒸発させます。その後、塩化第二鉄を超純水で100ミリモルに再構成します。
初期金属重量に基づいて必要な水の量を計算します。次に、調製した塩化第二鉄溶液とニトリロ三酢酸を、20ミリモルの重炭酸ナトリウムの存在下で室温で5分間インキュベートすることにより、1ミリリットルのニトリロ三酢酸第二鉄を調製する。次に、500ミリグラムのアポトランスフェリンを4ミリリットルのトランスファーバッファーおよびローディングバッファーに溶解し、4ミリリットルのこのアポトランスフェリン溶液を15ミリリットルのチューブ内の調製したニトリロトリアセテート第二鉄溶液に加えます。
ニトリロ三酢酸第二鉄をアポトランスフェリンに最大限に負荷するには、溶液がpH 7.5であることを確認し、必要に応じて重炭酸ナトリウムまたは塩酸でpHを調整します。.混合物を室温で2時間半インキュベートする。次に、過剰のアンバウンドニトリロ三酢酸第二鉄を除去し、鉄-58トランスフェリン溶液を分子量カットオフカラムに移し、カラムを遠心分離することによりニトリロトリアセテートを放出した。
遠心分離後、10ミリリットルのトランスフェリンローディングバッファーを添加し、カラムを遠心分離してカラムを2回洗浄します。その後、カラムを10ミリリットルの生理食塩水で洗浄し、再度遠心分離します。最後に、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して鉄58トランスフェリン溶液を滅菌し、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管します。
生理食塩水中でミリリットルあたり35ミリグラムの鉄-58トランスフェリン溶液を調製します。次に、麻酔をかけた妊娠中のマウスを加熱パッドの上に置き、鉄-58トランスフェリン溶液を眼窩後洞にゆっくりと慎重に注入します。注射後6時間でマウスを安楽死させ、滅菌鉗子と解剖ハサミを使用して子宮を慎重に除去します。
子宮の一部に囲まれた羊膜袋内の単一の胎児と胎盤からなる胎児胎盤ユニットを切り取る。次に、胎児と胎盤を乱すことなく、子宮と羊膜嚢を慎重に切ります。その後、羊膜嚢をはがし、胎児と胎盤を取り除きます。
臍帯を切断した後、胎児と胎盤をきれいなタスクワイプで拭き取り、余分な羊水を取り除き、胎盤全体の重量を記録します。かみそりの刃で各胎盤を半分に切ります。各半分を2ミリリットルのチューブに入れ、液体窒素でスナップフリーズします。
胚の肝臓を集めるには、胚を犠牲にし、腹部を露出させたまま安定化のために胚を固定します。解剖ハサミを使用して、へその緒が取り付けられた場所に小さな切開を行います。解剖はさみの一端を切開部に挿入し、冠状面に向かって1/4インチの中央面カットを行います。
次に、横面カットを実行して胎児の肝臓を露出させます。鉗子を使用して、胎児の肝臓を取り除き、胚肝臓全体の重量を記録します。胚肝臓全体を2ミリリットルのチューブに入れ、液体窒素で急速凍結します。
ティッシュは摂氏マイナス80度で無期限に保管してください。胎盤と胎児の肝臓の非ヘム鉄を定量するには、胎盤の半分と胎児の肝臓全体を解凍します。次に、胎盤の半分の重さを量ります。
組織サンプルに400マイクロリットルのタンパク質沈殿溶液を加え、電気ホモジナイザーを使用して組織を均質化します。サンプルを摂氏100度で1時間インキュベートします。その後、室温の水で2分間冷却します。
キャップを開けて圧力を解放します。その後、チューブを再度閉じます。サンプルを遠心分離して組織破片をペレット化した後、上清をICP-MS分析用の新しい標識チューブに注意深く移します。
次にヘム鉄を定量し、遠心分離後に得られたペレットの重量を記録する。次に、ペレットを10ミリリットルの濃縮70%硝酸で消化し、1ミリリットルの30%過酸化水素を補給します。サンプルを摂氏200度に15分間加熱してから、ICP-MS分析に送ります。
ICP-MS測定により、2つの異なる鉄同位体を検出できました。最も豊富な鉄同位体である鉄56は、組織内の慢性イオン変化を反映しています。別の同位体である鉄58は、注入された鉄の分布の急激な変化を反映しています。
鉄56の測定により、鉄欠乏妊娠の胚肝臓は、鉄欠乏妊娠の胚肝臓と比較して鉄貯蔵量が減少していることが確認されました。鉄58の測定では、鉄欠乏妊娠では、鉄分が豊富な妊娠よりも6時間にわたって胚肝臓に移動する鉄が少ないことが確認されました。手順を実行している間、組織の重量を記録することを忘れないでください。
これらの重みは鉄濃度を計算するために必要です。Iron-58は特別な取り扱い上の注意や廃棄を必要としないため、未処理の組織をウェスタンブロッティングやqPCRなどの他の分析に使用できますが、これらに限定されません。
