我々のプロトコールは、SARS-CoV-2感染のK18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるin vivoおよびex vivoライブイメージングウイルス検出およびウイルス追跡のための蛍光または発光発現組換えSARS-CoV-2の使用を記載した。この技術の主な利点は、K18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるSARS-CoV-2のin vivoおよびex vivo研究のためのウイルス検出および追跡の適用および実現可能性である。K18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるSARS-CoV-2のインビボイメージングの使用は、インビボでのSARS-CoV-2感染の治療のための治療薬を評価するための優れた選択肢を表す。
レポーターSARS-CoV-2の実施は、病原性、ウイルス複製、およびインビボでの栄養症を評価するための優れた選択肢を表す。SARS-CoV-2を発現するルシフェラーゼを用いたin vivo研究では、生物発光シグナルを改善するために、マウスを剃毛し、基質注入後に迅速なイメージングを行うことが推奨される。in vivoイメージングシステム(IVIS)を開始し、パラメータを設定し、画像モードをクリックして生物発光をクリックしてからフィルターを開き、露光時間を自動に設定することで、生物発光モニタリングを開始します。
次に、既に剃毛して麻酔したマウスを隔離チャンバから取り出し、25ゲージ針を用いて、PBSで1〜10希釈したルシフェラーゼ基質100マイクロリットルをマウスに後眼窩的に投与する。次に、マウスを隔離チャンバに戻し、低体温を防止するための発熱部品を備えたIVISマシンに隔離チャンバを移し、IVISイメージャのドアを閉じて、ソフトウェアプログラムで[取得]を選択してイメージングを初期化します。取得した生物発光画像を解析するには、ソフトウェアのROIまたは関心領域ツールを使用して、正確な信号を指定し、フラックスを測定します。
イメージングソフトウェアを起動し、パラメータを設定します。画像モードを蛍光にクリックし、励起フィルターを500ナノメートル、発光フィルターを530ナノメートルに設定し、露光時間を自動に設定します。 壊死検査を行い、マウスから肺を切除します。
切除した肺を2ミリリットルの1X PBSを含む6ウェルプレートに入れ、すすぎ洗いして余分な血液を除去します。70%エタノールを使用してサンプル間の手術器具を消毒し、清掃する。IVISマシンを初期化した後、肺を黒いシートの上に置き、組織を互いに分離する。
次に、トレイをバイオセーフティキャビネット内の隔離チャンバ内に置き、隔離チャンバをIVISに移します。IVISイメージャのドアを閉じ、集録をクリックしてイメージングシステムを開始します。蛍光を分析するには、ROIツールを利用し、個々の肺の周囲にROIを描画します。
各ROIを手動で測定し、与えられた平均放射効率値を使用して、偽感染マウスから差し引く。イメージングが完了したら、ドライアイス凍結用のクライオチューブに組織を入れて、後で処理するためにマイナス 80 °Cで保存します。組織ホモジネートから得られたスーパーネートを利用して、10倍の段階希釈を行い、各上清希釈液の1ミリリットルを3連でベロE6細胞のコンフルエント単層に感染させる。
加湿された5%二酸化炭素インキュベーター内で37°Cで1時間ウイルスを吸着させます。完了したら、1ミリリットルの1X PBSで細胞を洗浄し、次いで、摂氏37度の加湿5%二酸化炭素インキュベーター内で、1%寒天を含む2ミリリットルの感染後培地中で細胞を72時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを10%中性緩衝ホルマリンで摂氏4度で24時間不活性化し、プレート全体が水没することを確認します。
バイオセーフティレベル3からプレートを取り出し、室温で10分間、1ミリリットルの0.5%Triton X-100で細胞を3回洗浄する。次に、透過処理した細胞を1ミリリットルのウシ血清アルブミンまたはBSAおよびPBSで摂氏37度で1時間ブロックし、続いて2.5BSAで希釈したSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質交差反応性モノクローナル抗体1C7C7を1ミリリットルあたり1ミリリットルの37°Cで1時間インキュベートした。1ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄し、製造元の指示に従ってABCおよびジアミノベンゼン、またはDABペルオキシダーゼ基質キットを使用してプラークを発生させ、ウイルス力価を1ミリリットルあたりのプラーク形成単位として計算する。
この研究では、生物発光性ナノルシフェラーゼ(Nluc)は容易に検出され、rSARS-CoV-2 Nlucに感染したマウスは観察されたが、rSARS-CoV-2野生型または偽感染マウスは感染しなかった。定量分析は、感染後の異なる日におけるNluc強度を示した。rSARS-CoV-2 Nlucに感染したマウスの肺表面上の肉眼病変は、rSARS-CoV-2野生型感染群の病変と同程度であった。
さらに、ウイルス力価が検出され、rSARS-CoV-2 Nluc感染マウスは、感染後の異なる日にすべての臓器においてrSARS-CoV-2野生型に感染したものと同等であった。同時に、Nluc活性は、rSARS-CoV-2 Nluc感染マウスからの器官においてのみ検出された。偽感染マウスおよびウイルス感染マウスの別群を、体重および生存率の変化について12日間モニターした。
rSARS-CoV-2 NlucおよびrSARS-CoV-2野生型に感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後7〜8日間にウイルス感染に屈した。rSARS-CoV-2金星感染後、rSARS-CoV-2金星に感染したマウスからすべての肺で金星の発現が容易に検出されたが、rSARS-CoV-2野生型または偽感染型に感染したマウスでは検出されなかった。定量的分析により、金星強度は感染後2日目にピークに達し、感染過程および感染マウスの肺にわたって減少することが示された。
肺表面の画像は、rSARS-CoV-2金星に感染したマウスの肉眼的病変を明らかにし、rSARS-CoV-2野生型感染マウスのそれと同程度であった。また、rSARS−CoV−2金星への感染は、全ての器官においてrSARS−CoV−2野生型に感染したマウスにおいて観察されたものと同等のウイルス力価をもたらした。rSARS-CoV-2金星およびrSARS-CoV-2野生型に感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後9日目までにウイルス感染に屈し、生存しなかった。
SARS-CoV-2を発現するレポーターの結果は、ウイルス感染の有効な代理であることを示している。したがって、これはSARS-CoV-2感染の治療のための対策の迅速な同定と評価につながる可能性があります。
