イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

このプロトコルは、古いゼブラフィッシュ幼虫および変態中の若年期の遺伝子発現の決定を可能にするため、重要である。この技術の利点は、いくつかのステップが、腎臓のプローブ浸透および可視化のために最適化されたことである。まず、最後の食事の後、午後遅くに交配タンクに1匹のオスと1匹のメスの魚を加えて、成虫のゼブラフィッシュを交尾するように設定します。

翌日、E3培地を含むペトリプレートに胚を集める。受精後5日間、400マイクロメートルのスクリーンを2.8リットルタンクに入れ、2センチのシステム水で満たします。その後、1ペトリプレートから幼虫を追加します。

幼虫を固定するには、目的の時点で幼虫のタンクを取り外し、その先端を切断してピペットを移し、幼虫をペトリプレートに移します。次に、2%トリカインの2ミリリットルを加えて幼虫を固定化する。固定化後、トリケーヌを20ミリリットルの固定溶液に交換します。

30分後、幼虫を25ミリリットルの新鮮な固定溶液を含む50ミリリットルのチューブに移します。その後、キャップがしっかりとしていることを確認し、ゆっくりと2日間摂氏4度でチューブを揺らします。3日目に、固定溶液を20ミリリットルのPBSTに交換し、幼虫をペトリプレートに移します。

幼虫を測定するには、ペトリプレートを解剖顕微鏡の下の平らな定規の上に置き、まつげマニピュレータを使用して各幼虫を定規に移動して全長を測定します。すべての幼虫を測定した後、PBSTと1つの5.5ミリリットルガラスバイアルに同様の長さのいくつかの幼虫を組み合わせます。脱水の場合は、ガラスバイアルのPBSTを100%メタノールの4ミリリットルに置き換え、バイアルをマイナス20度で2日間保存します。

水分補給のために、100%メタノールを75%メタノールと25%PBST溶液の4ミリリットルに交換し、バイアルを5分間揺らします。次いで、メタノールとPBST溶液を4ミリリットルの新鮮なPBSTに交換し、バイアルを10分間再度揺らします。プロテナーゼK消化の場合、PBSTを2ミリリットルのプロテアーゼK溶液に置き換え、室温でバイアルを30分間揺らします。

次に、漂白のために、幼虫を6ウェルプレートに移し、PBSTを3ミリリットルの新鮮な漂白液に置き換えます。メサネフロスに沿った色素沈着が完全に消失した後、幼虫をガラスバイアルに戻し、漂白液を4ミリリットルのPBSTに交換し、バイアルを10分間揺らします。プレハイブリダイゼーションの場合は、固定溶液を4ミリリットルのPBSTに交換し、バイアルを10分間ロックし、PBSTを4ミリリットルのHyb溶液とロックに10分間交換します。

Hyb溶液に2つの追加インキュベーションを行った後、Hyb+溶液の4ミリリットルに溶液を交換してください。EGFPフルオレセインプローブをハイブリダイゼーションプラス溶液の500マイクロリットルで1~100個同時に希釈し、バイアルとプローブを一晩摂氏70度でインキュベートします。翌日、プローブをハイブリダイズするには、バイアル内のHyb+溶液を予熱プローブに交換し、一晩摂氏70度でインキュベートします。

翌日、50ミリリットルのチューブに予熱0.2倍のSSCTを50ミリリットル加えます。その後、チューブの上部に100マイクロメートルの細胞ストレーナーを挿入し、ガラスバイアルから細胞ストレーナーに幼虫を移し、幼虫が緩衝液に沈着していることを確認し、バイアルを摂氏70度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、予熱した0.2倍のSSCTを含む新しいチューブに細胞ストレーナーを移し、摂氏70度で2時間再びインキュベートする。

次に、ブロッキングのために、幼虫を新しいガラスバイアルに移し、室温まで冷却させます。その後、0.2回のSSCT溶液を67%0.2回のSSCTおよび33%MABT溶液の4ミリリットルに交換し、10分間室温でバイアルを揺らします。次に、SSCTT MABT溶液を4ミリリットルの新鮮なMABTと交換し、ロッカーにバイアルを10分間インキュベートします。

その後、MABTを4ミリリットルのブロッキング溶液に交換し、一晩で摂氏4度をインキュベートします。翌日、ブロッキング溶液を抗体溶液に交換し、摂氏4度で2日間インキュベートします。抗体洗浄の場合は、幼虫を50ミリリットルのチューブに移し、40ミリリットルのPBST2を加え、チューブを横に置いて摂氏4度で一晩インキュベーションします。

12日目、溶岩を6ウェルプレートに移した後、PBST2を3ミリリットルの染色バッファーに交換する。ロッカーに5分間のインキュベーションを行った後、染色液を3ミリリットルに交換します。所望の染色強度に達したら、染色液を停止液の3ミリリットルに交換し、30分間ロックします。

次に、幼虫を新しいガラスバイアルに移し、停止溶液を4ミリリットルの新鮮な固定溶液に交換し、室温で1時間インキュベートします。イメージングの場合は、固定溶液を4ミリリットルの新鮮なPBSTと交換してください。ロッカーに10分間インキュベーションした後、幼虫を6ウェルプレートに移し、PBSTを4ミリリットルの新鮮なPBSTに交換し、プレートを再び10分間揺らします。

次に、PBSTに50%グリセロールの3ミリリットルを加え、10分間ロックし、次に解剖顕微鏡を用いて、幼虫を6ウェルプレートに直接画像化する。このシンチハイブリダイゼーションプロトコルは、メサネフロスの発達を用いて腎臓前駆細胞および種々のニーフロン構造を効果的に標識する。最初のメソーネフリック腎は、約5.2ミリメートルの下に形成され、発生しやすい。

前駆細胞のクラスターは、単一の前駆細胞に加えてメサネフロスの発生時に存在する。より大きな少年では、背景染色は、スマイトで発生する可能性があります。全体的に見て、この方法は、解剖された成人器官に加えて、変態中に形成される他の組織を研究するために使用することができる。