私たちのプロトコルは、C.elegansの動きを定量化する2つのアッセイを提示します。これらの方法は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルによって示されるような運動性表現型を評価する。放射状のロコモーションアッセイは、固体表面上のクロールを検出するための費用対効果が高く、簡単に行える方法です。
スイミングアッセイは、コンピュータベースのトラッキングを使用して、液体中のスラッシング運動のバイアスのない検出を行います。これらの方法は、C.elegansの運動の違いを定量化するのに役立ちます。我々はALSを研究しているが、それらは変化した運動性を有する任意の株に使用することができる。
NGMアッセイプレートを上下逆さまに反転します。そして、アッセイするC.elegans株の識別子で底にラベルを付けます。逆さまのプレートの中央にマーカーを持つ小さなドットを作成します。
解剖顕微鏡で作業しながら、ワームをアッセイプレートの中央に移します。そして、30分間タイマーを設定します。蓋を皿に戻し、脇に置きます。
すべての株が指定されたアッセイプレート上に入るまで、ワームの移送を続けます。30分後、蓋を外し、解剖顕微鏡の下にプレートを下に置いて最初のプレートのスコアリングを開始します。すべてのワームがオーガーを通して見えるように顕微鏡の焦点を調節します。
中心点とは異なる色のフェルトチップペンを使用して、各ワームの位置に小さなドットを入れます。いくつかのワームがそこに終わる可能性があるので、プレートの端を確認してください。また、中心点から移動しなかったワームの数をカウントして記録します。
各ワームの中心点から最終的な位置のマーキングまでの距離を測定し、ルーラーを使用して距離を記録します。最初のワーム ポイントはダッシュでマークされます。時計回りにプレートを回転させることにより、各ドットの長さデータを連続して記録します。
関連するソフトウェアを開いてビデオを設定し、録画します。ビデオ キャプチャ アイコンをクリックします。調光ノブを押し下げ、時計回りに回してライトを調整します。
ビデオキャプチャウィンドウで、設定タブをクリックし、ビデオモードを2456x2052_Mono8、フレームレートを14に、モノクロで出力するように調整します。0.00300 秒の露出。1 dB にゲイン。
ガンマを1つにします。そして180に回転します。キャプチャ タブに戻り、記録フォルダを選択し、ファイルのプレフィックステキスト ボックスにファイル名を入力してファイル名を割り当てます。
バッファーなどの他のキャプチャ設定を 128 フレームに設定し、持続時間を 1 分に設定します。デバイスステージにライトアップされたアッセイプレートを配置し、ビデオキャプチャ画面で中央に置き、蓋を取り外します。マイクロピペットを使用して、M9の1mlで約50個のワームをアッセイプレートに洗浄します。
プレートをそっと旋回して動物を中央に持ち込むか、マイクロピペットを使用してM9を数滴加え、動物を分離します。60秒間タイマーを設定して、ワームが泳ぎに順応できるようにします。ディスプレイが露出過ぎることなくできるだけ明るいように、ライトノブを調整します。
ディスプレイを見ながら、カメラのレンズ本体に焦点を合わせるリングを手動で調整します。60秒後に録音ボタンを押し、ワークフローメニューの「イメージシーケンスをインポート」の最初のボタンを選択し、ビデオを見つけてダブルクリックします。ワークフローメニューから「シーケンス情報の設定」を選択します"新しいメニューウィンドウで命名スキームを確認し、メモを追加し、メタデータを検証します。
「イメージを調整」を選択すると、新しいポップアップメニュー「イメージ調整」が開きます。背景スムージングを 10 に設定し、ガウス スムージングを 5 に設定し、穴を 2 つに塗りつぶし、小オブジェクト フィルタをゼロに設定し、積分微分セグメンテーションをスキップして、画像処理設定を調整します。動物が完全に緑で塗りつぶされるが、背景とは異なるものに、しきい値レベルを調整します。
次に、ワークフローメニューから「検出して追跡」を選択し、3~7個のワームを選択し、検出タブの「ワーム検出」ボタンをクリックします。追跡タブに移動します。追跡パラメータで[バックトラッキングを使用する]をオンにし、画像の端にある[ワームを追跡]をオフにします。
最大追跡仮説を 5 に設定します。トラッキングモードをスイミングに設定します。詳細設定セクションに移動し、ワームが境界に触れることができるフレームを 50 に設定します。
フレームワームは 500 に重なる場合があります。位置許容値を 0.50 に設定します。そして、0.50に形状許容範囲。
これらの設定を保存し、構成として保存して、実験内のすべてのビデオに展開します。左上のアイコン メニューで構成マネージャーに移動し、[保存]アイコンをクリックします。この構成に名前と説明を付けます。
そして、「はい」をクリックして、ワークフローメニューで「プロジェクトを保存」をクリックし、ワークフローメニューに移動し、バッチ」アイコンをクリックして、ビデオを追跡します。このバッチ処理メニューのファイル選択セクションの下にある「追加」ボタンをクリックします。をクリックし、処理するすべてのプロジェクト ファイルを選択します。
次に、[スタート]ボタンをクリックして開く]をクリックし、最初のファイルの緑色の進行状況インジケータを確認します。すべてのファイルを処理できるようにします。読み取ったすべてのファイルが終了したら、ソフトウェアを閉じます。
[データの分析] を選択する"トラックの概要に移動します。また、右下のエクスポートボタンを使用して、スプレッドシートの読み取り可能な形式でデータをエクスポートします。「ターンカウント」と「トラックデュレーション」を使用して、スプレッドシート機能を使用する各トラックの毎分回転数を計算します。
5種類の異なる株の発生ステージL4幼虫の非刺激分散液を、ラジアルロコモーションアッセイを用いて測定した。そして、1分あたりマイクロメーターとしてグラフ化された。棒グラフとして表示されるデータは、歪み間の相対的な違いをより明確にします。
グラフ内にプロットされた各ワームの最終的な変位に対して、母集団内の変動をより良く視覚化することができます。液体中のスラッシングまたは起起き周波数の観点から泳ぐ率は、公平なコンピュータ支援スコアリングおよび分析を用いて測定した。そして、毎分スラッシュとしてグラフ化。
棒グラフデータは、ひずみ間の相対的な違いを見やすくします。各個々のワームの採点されたデータがグラフ内にプロットされているのに対し、母集団内の変動をより良く視覚化することができます。放射状のロコモーションアッセイでは、軽度のTDP-43株は野生型N2株と有意に異なっていなかった。
しかし、水泳アッセイでは、軽度と強いTDP-43株の両方が野生型N2と有意に異なるだけでなく、互いに異なっていました。ALS変異型TDP-43株は、ラジアル・ロコモーションによる重度のクロール障害を有し、液体中でスラッシュしない。タウ発現株は、ラジアルロコモーションに重度の障害を有するが、水泳アッセイでスラッシュすることができます。
これらの方法で考慮すべき最も重要な側面は、反復間の一貫したコントロールを維持することです。これは、運動性の変動が環境条件ではなく、異性の違いによって引き起こされることを保証します。これらの方法は、2つの主要なC.elegans運動パラダイムの包括的な評価を提供する。
フォローアップ方法には、追加の行動特徴付け、生化学的分析、または筋肉またはニューロン機能の調査が含まれる可能性があります。
