細胞内NMR分光法は、生細胞におけるタンパク質の構造と機能を直接研究し、タンパク質-リガンド相互作用などの生物学的に関連するプロセスを監視するためのユニークなアプローチを提供します。このNMRバイオリアクターは、分光計で数日間、多数のヒト細胞を生存可能かつ代謝的に活性に保ち、リアルタイムの細胞内NMRアプリケーションを可能にします。この方法は、立体構造または化学変化を受ける任意の可溶性、自由にタンブリングする細胞内タンパク質に適用することができる。
同位体標識は、本方法の適用可能性をさらに拡張する。開始するには、第2のフローユニットNMRチューブを使用してフローユニットを組み立て、後で細胞を含むものと交換する。正しい組み立てについては、フローユニットの取扱説明書を参照してください。
フローユニット温度制御に接続されているウォーターバスを37°Cに設定し、貯水ボトルをウォーターバスに入れます。リザーバボトルのFEPチューブをポンプに接続します。バイオリアクターバルブを回してバイパスし、ポンプに媒体を事前に充填します。
次に、バイオリアクターバルブを回してフローさせ、バイオリアクターに毎分0.1ミリリットルの培地を事前に充填します。トランスフェクトされたHEK 293 T細胞のT75フラスコを二酸化炭素インキュベーターから取り出し、使用済み培地を除去した。2ミリリットルのトリプシンEDTAを細胞に加え、室温で5分間インキュベートして細胞を剥離する。
20ミリリットルの完全DMEMでトリプシンを不活性化し、上下にピペッティングすることによって細胞を完全に再懸濁する。その後、50ミリリットルの遠沈管に移します。細胞を800X Gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てる。
細胞ペレットを1.5ミリリットルのキャップ付き微量遠心管に移す。細胞をアガロース糸に埋め込むには、固化したアガロースのアリコートをブロックヒーターで摂氏85度で溶かし、ブロックヒーターで摂氏37度で溶液に保ちます。パスツールピペットで、フローユニットNMRチューブの底部に60〜70マイクロリットルの1.5%アガロースゲルを充填し、氷の上に置き、高さ5ミリメートルの底部プラグを作成します。
セルペレットをブロックヒーターで15〜20秒間加熱し、気泡の形成を避けて、セルを450マイクロリットルのアガロース溶液に慎重に再懸濁する。細胞/アガロース懸濁液を、1ミリリットルのシリンジに接続された内径0.75ミリメートルの長さ30センチメートルのクロマトグラフィーPEEKチューブに吸引する。チューブを室温で2分間冷まします。
フローユニットNMRチューブを室温で100マイクロリットルのPBSで予め充填する。アガロースに埋め込まれた細胞の糸をシリンジを穏やかに押し込むことによってフローユニットNMRチューブにキャストする。フローユニットから空のNMRチューブを取り外し、数分間流量を毎分2ミリリットルに増やして、入口チューブ内の残留気泡を除去します。
流速を毎分0.2ミリリットルに設定し、細胞を入れたNMRチューブをゆっくりと、しかし着実に上方に押し込んで挿入する。バイオリアクター媒体を毎分0.1ミリリットルの流量で供給する。NMR分光器の温度を310ケルビンに設定し、分光器にフローユニットを挿入します。
バイオリアクターがNMR分光計に挿入されたら、培地交換を可能にするために数分待ちます。陽子チャネルのマッチングと同調を調整し、磁石をシムし、陽子90度のハードパルス長を計算します。各パルスシーケンスのプロトンパワーレベルをプロトンハードパルスに従って調整します。
第1のzgesgpプロトンNMRスペクトルを記録し、試料含有量をフィールド均質性で記録する。zgesgp と p3919gp または SOFAST-HMQC 実験を希望の数にコピーし、集録スプーラにキューイングします。外部分子の濃縮溶液を滅菌された長針シリンジでシリコーンチューブを穿刺することによって、培地リザーバボトルに注入する。
NMR実験の最後に、細胞を含むチューブを空のチューブと交換し、フローユニットを水ですすいでください。標識されていない炭酸脱水酵素を発現する細胞の場合、ゼロ充填および指数線拡幅窓関数を適用してp3919gpスペクトルを処理します。窒素-15標識スーパーオキシドジスムターゼを発現する細胞の場合、ゼロ充填および二乗符号ベル窓機能を両次元に適用してSOFAST-HMQCスペクトルを処理します。
MATLABで、カスタムスクリプトLoad_ascii_spectraを使用してスペクトル領域をインポートします。Load_acqusスクリプトを実行して、1D スペクトルからタイムスタンプを抽出します。MCR-ALS 2.0 GUI を開くには、mcr_main スクリプトを実行し、[データ選択] タブでスペクトル マトリックスを読み込みます。
データをプロットして確認します。特異値分解または手動で成分数を評価し、純粋なスペクトルの初期推定方法を選択します。最も純粋な変数検出または進化因子分析のいずれかを使用できます。
[データセットの選択] ウィンドウで、[続行] を選択します。濃度の制約を「制約:行モード」ウィンドウで設定します。非否定性制約を適用し、[実装] として fnnls を選択し、種の数として 2 つを選択します。
次に、1 つのクロージャ拘束条件を適用し、拘束条件を 1 に設定し、クロージャ拘束条件を等しくして、すべての種に適用します。スペクトルの制約を「制約:列モード」ウィンドウで設定します。非否定性制約を適用し、実装として fnnls を選択し、種数として 2 つを選択します。
最後のウィンドウで、50 回の反復と 0.01 の収束基準を設定します。濃度、スペクトル、標準偏差の出力名を指定します。MCR-ALS フィッティングを実行するには、[続行] をクリックします。
バイオリアクター内の細胞は、トリパンブルー試験によって確認されるように、最大72時間生き続けることができる。バイオリアクターを、HEK 293 T細胞の細胞質ゾル中に過剰発現する炭酸脱水酵素への2つの阻害剤、アセタゾラミドおよびメタゾラミドの結合のリアルタイムモニタリングに使用した。過剰発現タンパク質からのシグナルの存在および場の均質性は、最初の励起彫刻陽子スペクトルを用いて評価された。
炭酸脱水酵素の場合、2つの阻害剤の細胞内結合は、亜鉛配位ヒスチジンおよび他の芳香族残基から生じるウォーターゲートスペクトルの11〜16ppmの領域におけるプロトンシグナルを観察することによってモニターされた。結合の成功は、追加のシグナルの出現によって確認された。MCR-ALSは、遊離および結合した炭酸脱水酵素から生じるNMRシグナルを分離し、2つの種の相対濃度プロファイルを提供するために使用された。
バイオリアクタームを、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣体であるebselenによって促進される分子内ジスルフィド結合の亜鉛結合スーパーオキシドジスムターゼの形成を監視するために適用した。2Dスペクトルの選択された領域に対するMCR-ALS分析は、2つの種から生じるシグナルを分離し、それらの相対濃度プロファイルを提供した。気泡の形成を引き起こす可能性のある圧力ジャンプを避けるために、フローユニットNMRチューブをゆっくりと着実に挿入および取り外すことが重要です。
NMRバイオリアクターの開発は、生細胞におけるレダックス調節や薬物/標的相互作用のプロットなど、原子分解能の時間依存プロセスを研究する道を開いた。
