このプロトコルは、研究者が無傷の振る舞い椎骨の制御された刺激に対する単一の感覚ニューロンの活性および応答を監視することを可能にする。このパッチ電気生理学は、リアルタイムで個々のニューロンのスパイク活動から記録するための迅速かつ直接的な方法です。また、ほとんどの光学イメージング技術よりも低コストで、より優れた時間分解能と感度を提供します。
横線の毛細胞は、人間の内耳のものと相同である。したがって、この技術は、人間の難聴や聴覚障害に適用される毛細胞回路の特性を明らかにする準備ができています。電気生理学は、見て、物理的に模倣する必要がある細かい運動能力を使用した工芸品です。
テキストのみの指示は、誤解のためのあまりにも多くの余地を残します。まず、シルガードのような自己混合シリコーンエラストマーの薄い層をカバーガラス底の組織培養皿に分配し、シリコーンエラストマーボトムレコーディングディッシュを作ります。解剖ピンを作るために、DC電源を使用してエッチャントの100ミリリットルビーカーに5ボルトの負の電荷を提供し、正に帯電した出力にタングステンワイヤーを取り付けます。
先端が鋭いポイントに狭くなるまで、ワイヤーの先端を繰り返しエッチャント浴に浸します。ステレオ顕微鏡の下で、ワイヤーを先端から約1ミリメートル切断し、ストレートエッジカミソリブレードで切断します。これを3回繰り返し、細かい鉗子を使用して硬化した録音皿にピンを挿入します。
記録電極を準備するには、ボックスフィラメント付きマイクロピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張ります。電極は後部横線からの無気泡のニューロンを記録するために使用されるテーパーが付いている直径30マイクロメートルの先端を有するべきである。追加のホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを、小さな1~5マイクロメートルの先端径の電極に引き込みます。
各手に1つの電極を持ち、チップをそっと互いに横切って動かして先端を壊します。マイクロフォージを使用して、ベベジチップを滑らかになるまで磨きます。最終的な先端の直径は30から50マイクロメートルの間であるべきである。
ゼブラフィッシュの幼虫を固定化し、ピペットを移すために大きな先端を使用して35ミリメートルのシャーレに移します。周囲のソリューションをできるだけ多く取り外します。幼虫を10マイクロリットルの0.1%α-ブンガロトキシンに約5分間浸す。
麻痺した幼虫を細胞外液で10分間洗います。次いで、トランスファーピペットを使用して、幼虫を細胞外溶液浴からシリコーン底付き記録皿に移動させる。ステレオ顕微鏡の下で、このシリコーンマットの中央の上に細かい先端の鉗子で幼虫をそっと配置し、体の前部と後部端が左から右に走る横側を上に置きます。
細かい先端鉗子を使用して、肛門に直接後ろ向きの幼虫の脊索を通してシリコーンに直交するエッジピンを挿入する。尾の端近くの脊索を通して2番目のピンを挿入し、ガス膀胱の脊索後回を通して3番目のピンを挿入します。4つ目のピンを大蓋小胞に挿入し、ピンがカプセル化剤に挿入する際にわずかな回転を提供します。
わずかな回転が適用されると、クリースラムとオティック小胞の間の組織を監視して、発泡性ソマタのクラスターを明らかにする。DIC顕微鏡の固定ステージ上の目的の10倍の下にピン幼虫を置き、左ヘッドステージベクターに平行な筋肉ブロックのミオセプタル裂け目を向けます。地上線を浴室の溶液に入れ、それが左のヘッドステージに接続されていることを確認します。
柔軟なゲルローディングピペットチップを使用してVR記録電極に30マイクロリットルの細胞外溶液を充填し、左ヘッドステージピペットホルダーに挿入します。空気圧トランスデューサで得られる正圧を加えながら、倍率を40倍にし、記録ピペットを皿溶液に下げます。2つのミオメア腹孔の間のミオセプチムの上に電極先端を持ってきて、裂け目がVR電極先端の開口部の中心になるまでピペットを下に下げて上皮にそっと接触させます。
最初の接触の後、ピペットを斜めに操縦して、先端が接触し、シールを生成できることを確認します。空気圧トランスデューサで負圧を加え、保持します。パッチクランプソフトウェアで、ツールバーの再生ボタンをクリックしてVR信号を監視します。
Wellsステレオタイプのバースト信号ダイナミクスを使用して運動ニューロンの活動が観察されたら、VR記録が達成されていることを確認します。30マイクロリットルの細胞外溶液でアフェレンス記録電極を充填し、右ヘッドステージピペットホルダーに挿入します。次に、空気圧トランスデューサーによって生成される陽圧を加えながら、皿溶液にそれを下げます。
電極を見つけて、電極先端を試料の上に持って来なさい。マイクロマニピュレーターを使用して、クリースラムの上の位置を保持するまで、アフェレント電極先端を下げます。倍率を40倍の浸漬に増やし、後側線神経とクレイスラムの交点を見つけます。
電極先端をアフェレントガングリオンの上に持ち込み、先端が上皮に接触するまでピペットを下げます。先端全体が帯の神経節に接触するように電極を穏やかに操縦する。空気圧トランスデューサで負圧を加え、保持します。
パッチクランプソフトウェアで再生をクリックした後、スパイクがおよそ100〜200ミリ秒ごとに自発的に発生したときに、細胞全体の緩いパッチ記録が達成されることを確認してください。一度、発泡ニューロンと運動ニューロンの活動が検出されたら、ピーククランプ10のツールバーのRecordボタンをクリックして、両方のチャンネルで同時にギャップフリーの録音をキャプチャします。テキスト原稿に記載されているデータの前処理を行います。
このギャップフリー記録プロトコルを使用して、afferentとVRニューロンのリアルタイム活動を同時に測定することができます。カスタム作成前処理スクリプトは、しきい値、最小期間、最小インタースパイク間隔などのパラメータを使用してスパイク検出の視覚化を支援するプロットを生成します。分離信号は、前処理スクリプトで下限検出変数と上限検出変数を調整することによって得られた。
腹側根スパイク検出は、追加の入力を伴う同一のパラメータに従います。モーターコマンド内のバーストは、少なくとも5ミリ秒持続する0.1ミリ秒以内の最低2つのスパイクで定義され、200ミリ秒未満のインターバースト間隔を持つ最低3つのバーストによって線分化されます。この場合、平均自発活動は、時間がゼロに等しいとしてX軸に描かれた運動活動の発症に対する劇的な変化を示す。
水泳前のスパイク率と水泳前と泳泳後期間の両方のスパイクレートの間の発泡スパイク率に有意な違いが検出されました。無フェレントスパイク率は泳ぐ期間と負の相関があった。相対的なスパイクレートと泳ぎの頻度の間には相関関係は検出されません。
動物の健康は、この手順を試みるとき最も重要なものです。動物の福祉を確保するだけでなく、神経記録の成功の可能性を高めるために、速い血流を監視することが重要です。ゼブラフィッシュで利用可能な遺伝的ツールを活用することにより、この電気生理学プロトコルは、強力に強力にヘアセルシステムおよびそれ以降の解剖学的および機能的回路接続性を調査するためにトランスジェニックラインによって補完することができます。
このパッチクランプ技術の簡単な変更により、生体内での感覚システムの機能を監視することができます。
