開放血管窓と生体内蛍光顕微鏡を用いたマウス蝸牛の心房血流測定

蝸牛への正常な血液供給は、特に有毛細胞取引の重要な原動力である屋内蝸牛の可能性を維持するために、蝸牛メニエール病にとって非常に重要です。血液循環のこの機能は、さまざまな形態の難聴と密接に関連しています。人工内耳の血流をよりよく理解することで、血流障害に起因する聴覚障害をより効果的に管理できるようになります。

しかし、直接血流測定は、内耳を評価することが困難なため、非常に困難です。人工内耳血流を評価する技術は現在開発中です。本研究では、マウスなどの小動物種の人工内耳血流を狭くするために、高解像度蛍光顕微鏡で筋肉窓を開放する研究室で確立された最近の方法の1つを示します。

この手法をトランスジェネティック質量モデルに適用することで、血管内リスクにおける蝸牛血流に関連する聴覚機能と病理との関連を解明する研究が進む可能性があります。私たちの手順は慎重に行われるべきです。瞬間的な体の出血に加えて、血圧や心拍などの動物のバイタルサインを手術中に監視する必要があります。

心臓穿刺によってヘパリン中の約1ミリメートルの血液を採取することから始めます。血液を摂氏4度で3分間3000倍Gで遠心分離します。血漿を除去し、次いで、摂氏4度で3分間、3000倍Gで遠心分離することにより、血球ペレットを1ミリリットルのPBSで3回洗浄する。

PBS中の1ミリリットルの20マイクロモルDiOまたはDilで血球を標識し、室温で30分間暗所でインキュベートします。標識した血球を1ミリリットルのPBSで洗浄し、3000倍Gで3分間3回遠心分離します。注射前に、細胞ペレットを約0.9ミリリットルのPBSを含む30%ヘマトクリット値に再懸濁します。

滅菌手術器具とイメージングプラットフォームを準備し、ドレープの下に加熱パッドを置きます。麻酔をかけたマウスの反射不良と一般的な筋緊張を監視して、麻酔の深さを確認します。血圧と心拍を監視するためのモニターシステムの暖かい加熱パッドとその尾の上に動物を置きます。

直腸温を摂氏37度に維持し、麻酔状態で動物の収縮期血圧、拡張期血圧、および平均血圧を記録します。鼓膜と耳小骨をそのまま残した実体顕微鏡下での側方および腹側のアプローチを介して左鼓室を開きます。動きを最小限に抑えるために、頭を固定した状態で動物の首の正中線に沿って切開します。

左下顎下腺と顎二腹筋の後腹を切除し、焼灼します。胸鎖乳突筋と顔面神経が胸骨に向かって前方に伸びていることを特定することにより、骨ブラを見つけて露出させます。30ゲージの針で骨ブラを開き、外科用ピンセットで周囲の骨を慎重に取り除き、蝸牛と蝸牛動脈をはっきりと見ることができ、内側の縁が丸い窓のニッチの端にあり、楕円形の窓に向かって前方が優れています。

小さなナイフの刃を使用して、マウス蝸牛の頂点中央ターンで、頂点から約1.25ミリメートルの外側壁の骨を、薄い斑点が割れるまでこすります。小さなワイヤーフックで骨片を取り除きます。通常の生理学的状態を維持し、血管画像を記録するための光学ビューを提供するために、カットカバースリップで血管窓を覆います。

右伏在静脈に沿って1センチの切開を行い、血管を露出させます。FITC-デキストラン溶液と血球懸濁液を伏在静脈から動物にそれぞれ100マイクロリットル連続注入し、血管の可視化と血流の追跡を可能にします。注射の5分後にビデオモニターで血流をリアルタイムで観察します。

作動距離の長い対物レンズと、多帯域励起フィルターと互換性のある発光フィルターを含むランプハウジングを備えた蛍光顕微鏡を使用して血管を画像化します。高解像度デジタル白黒電荷結合デバイスカメラを使用してビデオを録画し、ビデオごとに350を超える画像を取得します。流速の解析を成功させるため。

適切なソフトウェアを使用して血管の直径を測定し、取得した画像で血管を横切る2つの固定点間の距離を決定します。ソフトウェアで血流のビデオを開き、画像のスケールを設定します。追跡機能を使用して、選択したDiO染色血球を追跡します。

次に、セルが移動した距離とビデオ内の画像フレーム間の時間間隔を使用して、流速を自動計算します。テキスト原稿に与えられた式を使用して体積流量を計算します。血流記録の前に騒音暴露モデルを作成するには、動物を金網のケージに入れ、音暴露ブースで120デシベルの音圧レベルで3時間広帯域騒音にさらします。

その後、翌日さらに3時間。騒音暴露の2週間後に血流を記録します。側壁の蝸牛毛細血管の外科的曝露後、FITCデキストラン標識血管内のDiL標識血球の生体内高分解能蛍光顕微鏡観察を、開いた血管窓を通して行った。

FITCデキストランで標識された線条血管内のDiL標識血球をここに示します。FITCデキストランで標識されたDio標識血球は、らせん靭帯の血管密度が、より密度の高い脈理血管密度よりもまばらであることを示しています。高分解能IVMは、対照群および騒音暴露群の血流パターンを示す。

血液循環の乱れたパターンは、ノイズにさらされたグループに見られます。異常には、血管の直径の減少と血管の直径のばらつきの増加が含まれていました。対照群および騒音暴露群における血流速度は、DiO標識血球の根を追跡することによって計算した。

騒音曝露群の血液速度および体積は、対照群よりも有意に低かった。開いた血管窓の確立を成功させるには、高度な外科的スキルが必要です。蝸牛側壁の骨を取り除く際には注意が必要です。