Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
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プロトコル作成プロセスにおけるジュリア・ファイン博士のアイデアと議論、そして編集中の有益なコメントを寄せてくれたカッソンドラ・ヴェルニエ博士に感謝します。これらの資料は、食糧農業研究財団によって部分的に支援されたプロジェクトに貢献し、助成金ID 549025の下で。

著者らは開示するものは何もありません。

ここでは、幼虫の収集、ウイルスの繁殖、抽出、濃縮、ならびにケージ給餌実験の形でのウイルス処理を含む、ウイルス増幅および接種剤ストック調製プロセスのすべてのステップを詳述する方法を概説した。これらの方法は、半純粋なウイルス粒子の生成を可能にし(図4)、その有効性は、成人にとって致死的であるウイルスの用量反応死亡率試験によって一貫して定量化することができる(図5)。感染能や病態を確認した後、生成した粒子をバイオアッセイに利用し、ミツバチとミツバチウイルスの相互作用を解明することができます。
記載されたプロトコルの最も特徴的な利点の1つは、蛹の収穫、粒子の産生、またはバイオアッセイの実施のいずれであっても、それぞれが容易に大量のものにスケーリングされることです。蛹切除方法33を使用すると、1時間あたり約100匹の蛹を除去することが期待できますが、この数は熟練度に応じて拡大します。しかし、ここで報告した幼虫の自己除去方法は、異なる計画およびスケジューリング手順を必要とする一方で、比較的少ない手作業とミツバチへの機械的負担を伴わずに、一晩で除去されたミツバチの数の10〜20倍を簡単に生成することができる。
この方法の主な制限は、自己除去された幼虫が以前にVarroaに寄生していなかったことを保証する方法がないことである。定期的なダニ治療とソースハイブのモニタリングは、このリスクを最小限に抑えることができますが、一部の幼虫はまだある程度のレベルのVarroa寄生を持っていた可能性があります。しかし、蛹を個別に手動で除去すると、ユーザーは特定の蛹の細胞内にダニが存在するかどうかを観察することができます。さらに、自己除去プロセスは幼虫の食物探索行動に依存するので、これらの幼虫を含むフレームは、通常起こる最終摂食の前に除去されなければならない。労働者によるこのプロビジョニングの欠如のためにのみ、幼虫は彼らの細胞から這う。したがって、この方法に由来する蛹は、コロニー内で完全に発達し、わずかに小さく見える幼虫と比較して、栄養ストレスの非常に短いウィンドウを経験する。これは、フレーム上に存在するコホート内の最年少の幼虫において特に顕著である。女王は24時間の窓の上に卵を産んだので、これらの幼虫は比例してより多くの摂食時間を逃しています。これらは通常、手動切除によって除去されたものと比較して非常に小さいサイズのために蛹化中に明らかに注目に値する。しかし、自己除去によって産生される幼虫の量は、減少した個々のバイオマスを補う以上のものである。さらに、手動切除法はまた、蛹が細胞から引き抜かれるときに、蛹に実質的な機械的ストレスを引き起こし得る。ウイルス粒子を生成するためだけでなく、いずれかの方法を実験の一部として使用する場合は、適切な制御を確実に行うように注意する必要があります。
抽出方法にかかわらず、ウイルス増殖プロトコルは、蛹を用いて大量のウイルス粒子を生成することができ、これは、ミツバチウイルス応答について試験する際に、現在実施されている他のウイルス接種方法35、36、37によって誘発される変動性を最小限に抑える。このプロトコルは、ピコルナビラレスの順に非エンベロープウイルス(例えば、イスラエル急性麻痺ウイルス、変形翅ウイルス)を用いて最適化され、試験されたことに注意することが重要です。エンベロープウイルス44を扱う場合、ウイルス粒子を単離するための異なる戦略に従うべきである。大まかな近似として、ウイルス採取作業に関与する16サンプル(図4の4つのコロニーを含む)のそれぞれを、200〜300匹の注射された蛹から生成し、2〜2.5mLの濃縮ウイルス粒子調製物を得た。ウイルス接種剤濃度を0.1%と標準的な35ミツバチケージと仮定すると、16個のウイルス調製物のそれぞれが3,300〜4,200個のケージに十分な粒子を提供するであろう。この感染性物質の余剰は、実験上の制限を軽減し、ハイスループットバイオアッセイを可能にします。ウイルス粒子濃縮物は、-80°Cで保存すると数ヶ月または数年生存可能なままであり得るが、凍結融解サイクルを数回受けても感染力が徐々に低下する可能性があることに注意することが重要です。したがって、ウイルス調製ストックを小さなアリコートに保存することが推奨され、そのうちのいくつかは、ウイルス力価を定量化し、実験時に治療用量を検証するために使用することができる。さらに、図5で示された年々の変動性は、定期的な線量反応試験の必要性をさらに強化し、それによってウイルス生存率の予期せぬ喪失の可能性を最小限に抑える。
ケージバイオアッセイ自体にも制限、または少なくとも考慮する必要がある警告があり、主なものはケージバイオアッセイ環境の人工的な性質です(図3)。ミツバチを囲いにグループ化すると、個々のレベルを超えたウイルス検査が可能になります。ケージはミツバチそのものではなく実験ユニットになります。これは、孤立して処理されている単一のミツバチよりも実際のコロニーに似ていますが、現実的なハイブ環境からはまだほど遠いです。女王やひなのフェロモン、異なる年齢のミツバチ、その他の手がかりを含む社会環境から取り除かれたこれらのミツバチは、実物大のコロニーのように反応しないかもしれません。ただし、これらは主にケージシステムを使用した大規模な実験の考慮事項です。ケージウイルスバイオアッセイから収集された結果は、主にベースライン情報確立として扱われるべきであり、ユーザーが望むように、より現実的な設定にスケーリングされた将来のウイルス検査の決定を知らせるために使用することができる。
ここで説明する方法は、ミツバチウイルスアッセイに使用するためのウイルス粒子の大量生産のための標準化されたプロセスを提供する。このようなアッセイは、マルチウイルス感染や、ウイルス感染に直面した場合の食事の質と栄養補助食品が生存にどのように影響するかなど、ミツバチとウイルスの相互作用のさまざまな側面を調べるためにすでに実施されています11,18,45,46。それらは、コロニー全体の感染実験11、47での使用、および行動47および遺伝子発現48に対する感染の影響を研究するためにスケールアップされている。全体として、これらの方法は、ミツバチウイルス接種剤の産生および評価に使用できるツールのベースラインを提供する。

ミツバチ(Apis mellifera)は、現代の世界の農業景観において重要な役割を果たしていますが、現在、農薬曝露、飼料不足、寄生虫、病原体など、生物的および非生物的ストレッサーの組み合わせに苦しんでいます1,2。懸念される最も重要な病原体の1つはウイルスであり、その多くは別の主要なミツバチストレッサーである寄生性Varroaダニ(Varroa destructor)によってベクター化されています。これらのウイルスは、繁殖期の生存率の低下、発達上の欠陥、および越冬期間の前後に完全な巣箱の崩壊につながる可能性のある麻痺を含む、ミツバチに一連の悪影響を引き起こす可能性があります3,4,5。ウイルス感染と戦うために使用される技術の開発には有望な進歩がありましたが、6,7,8,9、多くのウイルスがミツバチやコロニー内で伝播、拡散、相互作用するダイナミクスはまだよく理解されていません5,10.ミツバチとウイルスの相互作用の基本的な生物学と他の環境要因との関係を理解することは、効果的なウイルス管理技術を開発するために不可欠です。
しかし、ミツバチとウイルスの相互作用を研究することは、プロセスを複雑にする多数の既知および未知の要因を伴う課題を提起する。これらには、食事11,12との相互作用、農薬曝露13、およびミツバチの遺伝的背景14,15が含まれる。ウイルス感染のみに焦点を当てた場合でも、ミツバチの個体群(管理されたミツバチと野生の両方)は、急性症状を示さないことが多いが、常にある程度の背景ウイルス感染を有するため、合併症は一般的である16,17、ウイルス共感染の影響はよく理解されていない18。これにより、ミツバチウイルスの影響の研究を解きほぐすことが難しくなっています。
多くのミツバチウイルス研究は、状況ウイルス感染を使用して他のストレッサーとの相互作用を探し、バックグラウンド感染が他の治療法とどのように変化するかを観察しています12,19,20,21。このアプローチは、重要な効果の同定、特に農薬や食事療法がウイルスのレベルと複製にどのように影響するかを発見することに成功していますが、既知の含有量と濃度のウイルス治療を接種することは、ウイルス感染ダイナミクスの実験的試験にとって重要です。それでも、実験的治療をバックグラウンド感染から分離することも課題を引き起こす可能性があります。フィールド研究では、研究者はミツバチからマルハナバチへのウイルス感染の証拠を提供するために、変形した翼ウイルス(DWV)の株を分化させました22が、このアプローチを使用することはミツバチだけでは困難です。ウイルス感染性クローンは、感染の追跡23,24,25だけでなく、ミツバチウイルスの逆遺伝学研究やウイルス宿主相互作用研究26,27,28のための強力なツールです。しかし、ほとんどの場合、感染性クローンは、粒子を生成するために細胞内の感染サイクルを満たすために依然として必要とされる。このような粒子は、その感染力が裸のウイルスRNAよりも高く、かつ、キャプシドゲノムによる接種が自然感染を模倣するため、実験的処置のための接種剤として好ましい。
純粋で汚染されていないミツバチウイルス接種剤(野生型ウイルス株または感染性クローンに由来するもの)の生産も課題を提起する。これらは主に、純粋株ウイルス29,30を産生するための信頼性が高く、連続的に複製され、ウイルスを含まないミツバチ細胞株を得ることの困難さによるものである。いくつかの細胞株が産生されているが、これらのシステムは不完全なままである。それでも、生存可能な細胞株29を生産できるという希望があり、ウイルス産生と調査をより細かく制御できるようになるでしょう。このようなラインが広く利用可能になるまで、ほとんどのウイルス産生プロトコルは、インビボウイルス産生および精製の使用に依存し続けるであろう18、31、32、33、34。これらのアプローチには、目的のウイルス粒子を同定して精製すること(または感染性クローンを産生すること)と、それらを使用してミツバチ(通常は蛹として)に感染することが含まれる。蛹に標的ウイルスを注射し、次いで屠殺し、さらに粒子を抽出および精製する。しかし、そもそもウイルスのないミツバチはいないため、そのような濃縮物には他のウイルスの痕跡から常にある程度の汚染があるため、バックグラウンド感染の可能性が低いミツバチを選択する際には細心の注意を払わなければなりません。さらに、これらのプロトコル33で使用するための櫛細胞から蛹を除去するための方法は、非常に労働集約的であり、ミツバチにストレスを誘発することができ、これらの手段18、32によって産生を制限する。ここでは、ミツバチへの労力と機械的ストレスを少なくして幼虫を大規模に除去できる代替方法を報告する。
蛹が得られ、開始ウイルス接種剤を注射したら、ウイルスが複製する時間を提供するためにインキュベートされなければならない。その後、産生されたウイルス粒子は、実験ミツバチに感染するのに使用可能な形態に加工することができる。これを達成するためのいくつかの簡単な方法があり、感染源37としてウイルス感染したミツバチから生成された粗ホモジネート35、36または血リンパ液を使用することを含む。これらの方法は有効であるが、バックグラウンド基板から未知の変数(例えば、死んだミツバチホモジネート中の他の因子)を導入する可能性が高くなる。さらに、実験で大量の既知の用量のウイルスを短時間で与える必要がある場合は、粒子を濃縮することが望ましい。したがって、より良好な制御のために、ウイルス粒子のある程度の精製および濃縮を可能にする方法を使用することが好ましい。一般に、一連の沈殿および遠心分離ステップは、ほとんどすべての可能な非標的ウイルス材料33の除去をもたらすであろう。
この濃縮接種剤を製造した後、ウイルス力価(qPCR)を定量し、in vivoバイオアッセイでそれを特徴付けて、その生存率および死亡率を引き起こす能力をテストし、感染後に増加したウイルス力価が得られることを裏付けることが有益である。これは、注射実験(蛹または成虫のいずれか)または摂食実験(幼虫または成虫への)によって達成することができる。これらのアプローチはすべて可能ですが、ケージ内の成虫ミツバチのグループに餌をやることは、しばしば最速かつ最も簡単です。ケージアッセイ法は、農薬毒性38、卵巣発生39、および行動に対する栄養的影響40,41を含むミツバチに対する様々な他の治療法の試験にも広く使用されており、したがって、ウイルス感染を他の因子42と結びつける実験のための良好な基礎を形成することができる。
ここでは、ミツバチの労力と機械的ストレスを軽減する蛹を除去する方法や、ウイルス感染と影響をテストするための再現性の高いハイスループットバイオアッセイなど、高価な超遠心分離機を使用せずに大量の半純粋で高濃縮のウイルス粒子を製造するための信頼性の高い方法について説明します。ウイルス接種剤の純度を厳密に制御することにより、研究者は他のウイルス接種方法と比較してミツバチウイルス応答の変動を低減することができる。さらに、バイオアッセイは、現場で現実的な設定にスケーリングする前に、再現性の高い実験ユニットを使用して小グループレベルでウイルス効果をスクリーニングすることができ、これは管理にはるかに労力がかかります。これら2つの方法を組み合わせることで、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の全体的な理解を深めるのに役立つ研究に必要なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

ミツバチは世界中で生態学的および農業的に非常に重要ですが、ウイルス病原体への曝露を含むミツバチの健康に悪影響を及ぼすさまざまな圧力にもさらされています。このようなウイルスは、多種多様な壊滅的な影響を引き起こす可能性があり、実験的治療の効果を既存の背景感染から分離することを困難にする複数の要因のために、研究が困難な場合が多い。ここでは、大量のウイルス粒子を大量生産する方法と、ウイルス感染と効果をテストするためのハイスループットバイオアッセイを紹介します。連続したウイルスのないミツバチ細胞株の現在の欠如によって必要とされる、ウイルス粒子は、最小限のストレスの方法論を用いて巣箱から大量に抽出されるミツバチの蛹を用いて 生体内で 増幅される。これらのウイルス粒子は、その後、ミツバチケージバイオアッセイで、接種剤の生存率、ならびに栄養、農薬、および他の病原体との相互作用を含む様々な他のウイルス感染動態を試験することができる。このような粒子を使用する主な利点は、感染したミツバチの血リンパ液やホモジネートを介した感染などの現在の代替手段と比較して、その後の実験で未知の変数を導入する可能性を大幅に減らすことですが、バックグラウンドウイルス汚染を最小限に抑えるために、ミツバチを調達する際には注意が必要です。ケージアッセイは、コロニーレベルでウイルス感染効果をテストする大規模でフィールド現実的な実験に代わるものではなく、代わりに、半純粋なウイルス粒子と組み合わせて、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の様々な次元を調べるための重要なツールとして役立つベースラインウイルス応答を確立する方法として機能する。

蛹注射とウイルス抽出のプロトコル(図1)に首尾よく従うと、大量のウイルス粒子が生成されます。しかし、さまざまなコロニーから供給された蛹を複数の時点でサンプリングして注入することで、汚染の少ない標的ウイルスを獲得する可能性が最大化されます。ミツバチの中でウイルスが複製し、互いに相互作用するダイナミクスはよく理解されていません。既存の感染の可能性と相まって、たとえ蛹が同じ元のコロニーからサンプリングされたとしても、注入された(望ましい)ウイルスが任意の所与の蛹において優勢になるという保証はない。 図4は 、抽出後に予想されるウイルス比率の潜在的な範囲を示しています。表示された4つのコロニーは、すべての蛹が最初に〜95%のイスラエル急性麻痺ウイルス(IAPV)接種剤を注射されたより大きなウイルス収穫努力のサブセットを表す。これらの抽出に関与する16のコロニーサンプルのうち10は、99%(例えば、コロニー1)の一部を含む、高純度のIAPV(>95%)を含>ていたが、他のサンプルはIAPVの割合が異なり(例えば、コロニー2〜3)、変形した翼ウイルス(DWV)などの他のウイルス(例えば、コロニー4)によって支配されているものもある。
表1は、RT-qPCR閾値サイクル(Ct)値(PCR標的が検出の閾値に達する点)および100ng RNAあたりの総ウイルスゲノム当量(ge)の形で図4に示される4つのウイルス(BQCV、DWV、IAPV、SBV)の増幅レベルに関する追加のコンテキストを提供する。Ct値は比率の予測変数として使用できますが、ge値は検量線ベースの方法17を使用して計算する必要があります。生成される粒子(すなわち、ge)の実際の量は、処理された蛹の数および抽出プロセス中のフィルタリングストリンジェンシーに依存することに注意してください。
ウイルス粒子調製物(増幅種菌)は-80°Cで保存する必要があり、複数回の凍結融解サイクルを受けると著しく分解するため、それらをアリコートすることが推奨される18。さらに、多数の外的要因(ハイブ遺伝学、ミツバチの健康など)が非常に可変的なウイルス応答につながる可能性があるため、用量反応アッセイは常に実験前に実施する必要があります。実験ケージ(図3)から得られたデータを用いて、 図5は 、2つの異なる年の間に同じIAPV粒子を給餌したミツバチの用量反応生存曲線を比較することによって、そのような変動性を実証する。同じウイルス接種および1%~0.01%IAPVの範囲の試験濃度を含む同一の試験パラメータにもかかわらず、2018年(図5A)および2019年(図5B)に実施された試験では、スクロース接種物にウイルスを投与されなかった対照治療を除くすべての試験において、著しく異なる生存応答が生じた。なお、所望により、LD50 計算をこの時点で実行して、より正確な死亡率測定値43を得ることもできるが、近似値が一般に十分であるため、これは通常必要ではない。2018年には、1%の投与で感染後72時間(hpi)で約50%の生存率を達成し、その年に実施されたほとんどのウイルスケージ実験のデフォルト濃度となりました。しかし、その同じ用量は、同じ時点で2019年にほぼ全死亡率を達成し、その結果、その年に行われたほとんどのウイルスケージ実験は、代わりに0.01%IAPV接種を受けた。この有意に低い濃度は、2018年に1%IAPV接種剤と同じレベルの死亡率に達し、ウイルス粒子の使用も100倍少なくなりました。
これらのデータは、図 3に図示したものと同様のケージを用いたバイオアッセイで作製した。上部と側面のフィーダー穴は食事管理を容易にし、スライドケージドアは、接種剤トレイや死んだミツバチなどのケージ環境への物体の追加または取り外しを容易にします。しかし、一般化ウイルスアッセイプロトコルは、これらのタイプのケージや食事の選択に限定されず、実験的ニーズに合わせて変更する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig01.jpg"> 図1:幼虫自己除去プロトコル中の様々な段階の代表的な画像。 (a)一晩の自己除去期間の後に予想される幼虫量の例(1.6)。(B)別々の注射/成長トレイ上で互いに離間した幼虫(1.6.3)(C,D)ウイルス注射の準備ができている白目の蛹(1.9)。茶色の斑点は乾燥した幼虫であり、除去する必要はない。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig02.jpg"> 図2:皮下注射針とマルチディスペンサーチップを組み合わせて作成した注射器装置の例。 針と先端を液体接着剤を使用して接合し、繰り返しピペッターに取り付けたときに一貫して1μLの液体注射を送達した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig03.jpg"> 図3:ウイルスバイオアッセイで使用されたケージの例。 スクロース溶液および花粉は、試験期間中にフィーダー穴を通して 自由 摂取で提供された。ウイルス接種剤は、ケージの底に挿入されたトレイを使用して簡単に送達することができた。ケージタイプおよびフィーダ内容物は、実験パラメータに合うように必要に応じて調整することができることに留意されたい。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig04.jpg"> 図4:4つのサンプルコロニーからのウイルス調製物全体の平均総ウイルス負荷および比率。 ウイルス負荷は、100ng RNA中のブラッククイーンセルウイルス(BQCV)+変形翼ウイルス(DWV)+イスラエル急性麻痺ウイルス(IAPV)+サクブロードウイルス(SBV)ゲノム等価物(ge)としてRT-qPCRによって測定した。各サンプルコロニーは、もともとIAPVを注射された150以上の均質化された蛹からなり、蛹ウイルス注入プロトコルから生成されたウイルス比率の典型的な範囲を表す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig05.jpg"> 図5:ミツバチバイオアッセイケージの用量反応生存曲線。 2018年(A)および2019年(B)の両方のケージにIAPVを接種し、試験期間中、30%スクロース溶液を自由摂取させた。処置は、30%スクロース溶液中で混合された1%〜0.1%IAPV粒子調製物を示す10-2〜10-4のIAPV接種剤濃度を表す;対照スクロース接種にはウイルスが含まれていなかった。n = 2018年の総ケージ数は56個。n = 2019 年の合計ケージ数は 77 個。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:4つのサンプルコロニーからの4つのウイルス調製物におけるウイルス混合物の100ng RNAあたりの平均閾値サイクル(Ct)値およびゲノム当量。 各サンプルコロニーは、蛹ウイルス注入プロトコルから生成された150以上の均質化された蛹からなる。ウイルスは、各ウイルスに特異的なプライマーを用いたRT-qPCRにより検出した。 <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/Table_1.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。

ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K ビュー.  University of Illinois. ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

神経科学

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

環境学

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

の伝播<em&gt; Homalodisca coagulataウイルス01</em&gt;経由<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt;細胞培養

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

免疫・感染学

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、<em&gt;アピスミツバチ</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

要約

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ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（

の伝播

シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、

CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染