Name: successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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この研究は、サムスン科学技術財団(プロジェクト番号SSTF-BA1801-10)からの助成金によって支えられました。

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著者は開示するものが何もない

ここで述べたような扁桃体のような深部脳領域における頭部取付小型顕微鏡による生体内光学的カルシウムイメージングの成功を達成するためには、巧みな手術技術が不可欠である。したがって、このプロトコルは、ベースプレートアタッチメントとGRINレンズの移植の最適化された外科プロセスのためのガイドラインを提供しますが、重要なステップのために追加の最適化プロセスが必要な場合があります。プロトコルセクションで述べたように、手術における扁桃体座標、ベースプレート接続ステップにおける気流速度、画像取得設定(フレームレート、LEDパワーなど)をカルシウム記録及び変数(ICA時間重量、イベント最小減衰時間など)で最適化する必要がある。
ベースプレートのアタッチステップは変更できます。ヘッドプレートは、モバイルホームケージで行われたベースプレートアタッチメント中に目を覚ますマウスの頭部を固定するのに役立つため、必要です。しかし、移動式家庭用ケージが実験室で準備されていない場合、イソフルランガス麻酔システムは代替オプションです。この代替方法では、イソフルランガスの濃度が重要である可能性があります。我々は、1.5%のイオブルラン下のマウスの扁桃体でGCaMPシグナルがめったに検出されないことを観察した。それどころか、GCaMPシグナルは0.8%のイオブルラン状態で検出され、マウスはほぼ覚醒状態にとどまるが、この状態では頭部の動きは実質的にない。この麻酔条件により、ヘッドプレートやモバイルホームケージなどの追加のデバイスを使用せずにベースプレートアタッチメントを行うことができます。
スカルスクリュー、セメント、ベースプレート、および顕微鏡の不安定なアタッチメントは、モーション補正ソフトウェアアルゴリズムを使用して補正できるモーションアーチファクトを引き起こす可能性があります。横心室の動きは、現在利用可能なモーション補正ソフトウェアでは簡単に修正できない不規則なタイプのモーションアーティファクトを引き起こすと考えられています。このような不規則な動きのアーティファクトは、海馬や皮質などのほとんどの表面的な脳領域では最小限です。しかし、扁桃体における光学イメージング中に頻繁に検出される。この問題を克服するために、このプロトコルは、GRINレンズをウイルス注入部位から50μm離れた側側(図1C)に移植することを示唆しており、横心室から発生する潜在的な運動アーチファクトを低減することによって画像取得プロセスを大幅に改善する。ウイルス注入部位に対して50μmを設定するが、レンズ注入の目標座標も、側心室に対して設定することができる。このプロトコルでは、イメージングの成功したパフォーマンスのためにウイルス発現部位を正確に標的にすることがより重要であると推論した。そこで、レンズ注入の目標座標を設定するための基準としてウイルス注入座標を用いた。繰り返しの試験を経て、横心室の動きによる動きのアーチファクトを避けながら、効率的にウイルス発現部位を標的とするGRINレンズを可能にする最適条件を確立しました。最終的には、あらゆるモーションアーチファクトを効率的かつ正確に修正できる方法は、将来的に光学イメージングをより深い脳領域にアクセスするのに大きな助けになるでしょう。
頭部取り付け小型顕微鏡による生体内光学カルシウムイメージングは強力なツールであり、最適化されていますが、まだ多くの面で改善の余地があります。このプロトコルは、自由に振る舞う動物の扁桃体におけるリアルタイム神経活動の調査を目的とした研究を促進する。

カルシウムはユビキタスな第二のメッセンジャーであり、ほぼすべての細胞機能8において重要な役割を果たしている。ニューロンにおいて、作用電位焼成およびシナプス入力は、細胞内遊離の急速な変化を引き起こす [Ca2+]9,10.したがって、カルシウム過渡性を追跡することは、神経活動を監視する機会を提供する。GEC は、定義された細胞集団および細胞内区画11,12で [Ca2+] を監視できる強力なツールです。タンパク質ベースのカルシウム指標の多くの異なるタイプの中で、GCaMPは、単一のGFP分子13に基づくCa2+プローブで、最も最適化され、広く使用されているGECIです。複数のエンジニアリングを通じて、GCaMPの多くのバリエーションが12、14、15、16で開発されました。我々は、このプロトコル16で最近開発されたGCaMPの1、GCaMP7bを使用しています。GCaMPセンサは、開発中のCa2+過渡現象のイメージング、特定皮質層18における生体内イメージング、運動タスク学習19における回路ダイナミクスの測定、海馬および扁桃体20、20の連想恐怖記憶に関連する細胞アンサンブル活動のイメージングなど、多くのモデル生物における神経回路機能の研究に大きく貢献してきた。
GECI の光学イメージングには、いくつかの利点があります。遺伝的コード化により、GECは、遺伝的プロファイルまたは解剖学的接続性の特定のパターンによって定義される特定のサブセットの細胞において、長期間安定して発現することが可能になります。光学イメージングは、生きている動物のニューロンの数百から数千の生体内の慢性同時監視を可能にします。脳内でのGECのイメージングおよび解析のために、ヘッドマウント小型蛍光顕微鏡21、23、24、25を用いて、マウスを自由に振る舞う光学イメージングシステムがいくつか開発されている。GECを用いたin vivo光学イメージング技術、GRINレンズ、およびヘッドマウント小型顕微鏡は神経回路活動と行動との関連を研究する強力なツールであるにもかかわらず、この技術を扁桃体に適用することは、扁桃体でGECを発現する細胞に対するいくつかの技術的な問題により困難であった。このプロトコルは、扁桃体における生体内光学カルシウムイメージングを成功させるための重要なステップであるベースプレート付着およびGRINレンズ注入の外科的処置に役立つガイドラインを提供することを目的としている。このプロトコルは扁桃体を標的としますが、ここで説明するほとんどの手順は、一般的に他のより深い脳領域に適用されます。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、他の代替システムでも同じ目的が容易に達成され得る。

<table><tbody><tr><td>26G needle</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&amp;alpha;-GFP</td><td>custom made</td><td></td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink)</td><td>Lang</td><td>1334-pink</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Air flow manipulator</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Baseplate</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Baseplate cover</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (chamber)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Testcage</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Carbon cage</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Data processing software</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Data Processing Software</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill bur</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Glass needle</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Head plate</td><td>Neurotar</td><td>Model 5</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hex-key</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Laptop computer</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microscope gripper</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Microscope, DAQ software, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Mobile homecage</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Moterized arm</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Moterized arm software</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NI board</td><td>National instrument</td><td></td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Removable epoxy bond</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Resin cement (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C&amp;amp;B</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Skull screw</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic electrode holder</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Baseplate Attachment</td></tr></tbody></table>

successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse

自由に動く動物の神経活動のリアルタイムモニタリングは、神経活動を行動に結びつける重要なアプローチの1つです。このため、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)、蛍光顕微鏡の微細化、および勾配屈折率(GRIN)レンズを用いてニューロンのカルシウム過渡症を検出するinvivoイメージング技術が開発され、多くの脳構造1、2、3、4、5、6に応用することに成功しました。このイメージング技術は、遺伝的に定義された細胞集団の長期にわたる数週間の慢性同時イメージングを可能にするため、特に強力です。有用であるが、このイメージング技術は、扁桃体、感情処理および連想恐怖記憶7に不可欠な脳構造である扁桃体などの脳内の深部に位置する脳構造に容易に適用されていない。扁桃体にイメージング技術を適用することが困難になるいくつかの要因があります。例えば、運動アーチファクトは、通常、脳の深部に移植されたヘッドマウント顕微鏡が比較的不安定であるため、より深い脳領域で行われるイメージング中により頻繁に発生する。もう一つの問題は、横心室が埋め込まれたGRINレンズの近くに位置し、呼吸中のその動きが、容易に矯正できない非常に不規則な運動アーチファクトを引き起こし、安定したイメージングビューを形成することが困難になることです。さらに、扁桃体の細胞は通常安静状態または麻酔状態で静かであるため、後のイメージングのための基固め手順の間に扁桃体中のGECIを発現する標的細胞を見つけて焦点を合わせるのは難しい。このプロトコルは、扁桃体でGECIを発現する細胞を頭部小型化顕微鏡で効率的に標的化し、このようなより深い脳領域で生体内カルシウムイメージングを成功させる方法に関する有用なガイドラインを提供する。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、それに限定されないことに留意された。

GRINレンズ注入の検証 セメンテーションによってベースプレートを脳に慢性的に取り付ける前に、GRINレンズの注入を検証する必要があります。レンズの移植に成功した動物では、GCaMP発現細胞と血管の両方が、顕微鏡の対物レンズと埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定される焦点面範囲内で明確に観察された(図2AおよびB)。対照的に、オフターゲット移植を有する動物では、GCaMP発現細胞の鮮明な画像は、焦点外または視野外の範囲内で観察されなかった。焦点が合っていない場合、焦点が合った血管は観察できたが、焦点面範囲内の細胞に対してぼやけた画像しか観察できなかった(図2CおよびD)。視界外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面範囲内で蛍光シグナルは検出されなかった(図2E)。また、他の場合とは異なり、埋め込まれたGRINレンズは明るいエッジを示した(図2F)。ベースプレートの取り付けは、ターゲットGRINレンズの注入で検証された動物にのみ行われます。
聴覚刺激に応答したLAニューロンにおけるGCaMP信号の記録 このプロトコルでは、擬似ランダム化されたトーン(2.8 kHz、200 msの持続時間、25パルス)の4つの例がマウスに提示され、GCaMP信号はヘッドマウントマイクロエンドスコープを有するマウスのLA細胞に光学的に記録された。一方的な横扁桃体にAAV1-Syn-GCaMP7b-WPREを注射したマウスをイメージングに用いた。GRINレンズの移植に成功した動物では、ウイルス発現細胞および血管が焦点面範囲内で明確に観察された(図3A)。行動条件では、およそ50〜150個の細胞は、通常、ΔF/F画像に示すようにトーンがなくてもLAの視野に有意な蛍光変化を示し、自発的に活性細胞である可能性が高い(図3B)。トーン表示の際、ΔF/F画像解析で決定したGCaMP信号のトーン特異的変化を示したセルはごくわずかです(図3Cおよび図3Dの6セル)。同じ手順を、AAV2/1-CaMKIIα-GFPをコントロールとして注射したマウスにも実施した。GFP発現細胞は焦点面範囲内で検出されたが、ΔF/F画像解析で決定されたトーンの有無にかかわらず、有意な蛍光変化を示す細胞はなかった(図3Eおよび図3F)。
GCaMP発現およびGRINレンズの標的化の組織学的検証のために、死後の脳の冠状動脈部分を蛍光顕微鏡下で調べる(図4Aおよび図4B)。DAPI染色は、GRINレンズ周囲の脳組織の炎症による無傷の細胞と組織損傷の兆候を確認するために使用される(図4C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig1.jpg"> 図1:LAにおける生体内 微小内視鏡的カルシウムイメージングのための立体的手術のための模式的ワークフローおよび図 (A)LA における生体内微小内視鏡的カルシウムイメージングの概略的ワークフロー。 (B) ウイルス注射およびGRINレンズインプラント手術のための頭蓋骨切り出し部位の2次元座標を示す顕微鏡写真。2本の頭蓋骨ねじとレンズは、等三角形を形成する。 (C) ウイルス注入部位と埋め込み型GRINレンズとの相対位置を表す図、および「値A」を算出するための概略説明。 (D) 外科手術の最終段階で、頭蓋骨表面からヘッドプレートまでのセメント層の断面。樹脂歯科用セメントは、ネジの壁と埋め込まれたGRINレンズをカバーする必要があります。アクリルセメントは、樹脂歯科用セメントに適用されます。ヘッドプレートはセメント層に取り付けられています。パラフィンフィルムは、埋め込まれたGRINレンズ表面を覆い、ほこりから保護します。取り外し可能なエポキシ結合はパラフィンフィルムの取り外しを防ぐ。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig2.jpg"> 図2:ベースプレート付着後のGRINレンズの注入とセメント層の構成の検証。(A) GRINレンズの移植に成功した動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。GCaMP発現細胞および血管の両方が明確に観察される。 (B)GRIN レンズの移植に成功した動物からの埋め込まれたGRINレンズ表面のスナップショット画像。 (C) 焦点が合っていないGRINレンズの注入を有する動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。 (D) 焦点外のGRINレンズ注入を有する動物からの埋め込み型GRINレンズ表面のスナップショット画像。焦点が合っていない場合、血管は時々はっきりと観察されるが、焦点面範囲内の細胞のぼやけた画像だけである。 (E) 視野外のGRINレンズの注入を用いた動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。視野外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面内で蛍光シグナルは検出されない。 (F) 視野外のGRINレンズ注入を用いた動物からの埋め込み型GRINレンズ表面のスナップショット画像。他の場合とは異なり、この場合は明るいエッジが観察されます。 (G) ベースプレート付着用セメント層の構成。ベースプレートとヘッドプレートはアクリルセメントで取り付けられています。ベースプレートとGRINレンズの間にアクリルセメントで満たされていないスペースが必要です。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig3.jpg"> 図3:LAニューロンにおけるGCaMP信号の記録(A~C)AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREを注射したマウスから得られたデータ。(A)動作テスト中の代表的な内視鏡的スナップショットイメージ。GCaMP7b発現細胞および血管は、焦点面範囲内で明確に観察された。(B)ΔF/F信号を示す代表的なスナップショット画像。白線は、行動試験中に対象領域に有意な蛍光変化を示した細胞を示す。スケールバー = 50 μm( C)最大強度投影画像。合計6セルは、GCaMP信号のトーン特異的変化を示した。スケールバー= 50 μm. (D)トーン応答セルの代表ΔF/Fトレース。各色は、パネル(C)で同じ色を持つ各セルに対応しています。(E と F)AAV2/1-CaMKIIα-GFPを注入したマウスから得られたデータ。(E)動作テスト中の代表的な内視鏡的スナップショットイメージ。GFP発現細胞は、焦点面範囲内で明確に検出された。(F) ΔF/F信号を示す代表的なスナップショット画像。スケールバー= 50μm.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig4.jpg"> 図4:GRINレンズ位置とGCaMP7b発現の組織学的検証。(A)LA におけるGCaMP7b発現を示す代表的なコロナセクション画像。スケールバー = 200μm. (B) 拡大画像。スケールバー =50μm(C)DAPI 染色信号を示す蛍光顕微鏡画像。スケールバー= 200 μm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>要因</td>
			<td>値</td>
		</tr>
<tr>
<td>空間ダウンサンプリング係数</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>時間下降サンプリング係数</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>空間フィルター: ハイカットオフ</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>空間フィルター: ローカットオフ</td>
			<td>0.005</td>
		</tr>
<tr>
<td>モーション補正: ハイカットオフ</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>モーション補正: ローカットオフ</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>モーション補正: 最大変換</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ΔF/F リファレンス フレーム</td>
			<td>平均フレーム</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: ブロックサイズ</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: 収束しきい値</td>
			<td>1x10^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: ica経時体重</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: ヌミクス</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: numPC</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: アンミックスタイプ</td>
			<td>時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>イベント検出: 減衰定数</td>
			<td>1.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>イベントの検出: しきい値</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:データ処理の変数のリスト

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Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K ビュー.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). 生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。

ビデオ: Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

行動学

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

神経科学

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

上丘における2光子および広視野カルシウムイメージング

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

著者スポットライト:上腺における神経コーディングと視覚処理のメカニズムの解明 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

要約

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仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

覚醒マウスにおける反復生体内イメージングのための頭蓋窓の移植

生体内カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

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仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

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覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

覚醒マウスにおける反復生体内イメージングのための頭蓋窓の移植

生体内カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング